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脐血来源未成熟树突状细胞低温冻存的实验研究
目的 观察脐血来源的未成熟树突状细胞(imDC)低温冻存前后的生物学特性,探讨imDC的保存方法.方法 取新鲜脐血分离单个核细胞(MNC),在体外经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素(rhIL)4诱导产生imDC后,加入二甲亚砜(DMSO)作为保护剂,-80℃降温,-196℃保存,40℃水浴复温,获得冻存imDC.光学显微镜下观察冻存的imDC与新鲜imDC形态,计算其锥虫蓝拒染回收率(TBR);流式细胞仪检测细胞表面成熟标志;混合淋巴细胞反应(MLR)检测细胞刺激未致敏T淋巴细胞的增殖能力.结果 脐血MNC在rhGM-CSF和rhIL-4诱导下可向树突状细胞(DC)分化,相差显微镜显示细胞形态不规则,细胞表面呈树枝样突起;扫描电镜显示,细胞表面不规则,有树枝样突起和不规则皱褶.冻存imDC复苏后TBR为(86.8±1.3)%,冻存imDC在形态上与新鲜imDC无明显差异.MNC体外经rhGM-CSF和rhIL-4诱导生成的imDC表面CD1a阳性率为(62±8)%、CD14为(18±7)%、人类白细胞DR抗原(HLA-DR)为(67±5)%、CD80为(13±7)%、CD86为(12±5)%;反映DC成熟的表面标志物CD83为(4.6±2.0)%,符合imDC的表型特征.冻存imDC的CD80、CD86、CD83分别为(15±5)%、(17±5)%、(7.4±3.3)%,较新鲜imDC有所增高(P＜0.05),但仍符合imDC的表型特征.对照组MLR的每分钟放射性荧光闪烁计数(cpm)值为(488±197)min-1;新鲜imDC组为(463±104)min-1,与冻存imDC组的cpm值(512±78)min-1比较,差异无统计学意义(P＞0.05).各组细胞刺激指数(SI)均＜2.新鲜imDC和冻存imDC均不能有效刺激同种未致敏T淋巴细胞增殖.结论 本实验中获得的冻存imDC具有足够的细胞活力,其细胞免疫表型和细胞功能具有不成熟特征,说明利用DMSO低温保存imDC的方法可行.
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介绍一种低温保存皮肤的快速复温法
临床上用快速玻璃化抗冻液在-196℃液氮中保存皮肤,可较好地避免皮肤低温保存时冷冻损伤的问题.但冷冻皮肤在使用前的复温过程中造成损伤的问题依然存在,怎样解决这一问题是大家努力的方向.
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海藻糖低温保护血小板的研究进展
细胞治疗已经成为临床广泛采用的治疗方法,其中输注血小板制剂是治疗各种原因导致的血小板减少、外科急创伤和手术大出血的重要手段.常规使用的22 ℃震荡保存法会使血小板制剂存在细菌繁殖和血小板活化的风险.为了提高血小板制剂储存质量,减少储存损伤的发生,人们尝试在低温条件下用海藻糖保存液保护血小板,取得了一定效果.本文就低温条件下海藻糖保护血小板的研究进展进行综述.
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低温冷冻和酒精处理的同种异体周围神经移植的效果比较
目的比较低温冷冻和酒精处理的同种异体周围神经移植的疗效.方法取45只成年雄性SD大白鼠,随机分为A、B、C、D 4组.A、B、C组为实验组,每组10只;D组为供体组,15只.切取双侧坐骨神经15mm作为供体神经.A组的供体神经在-196℃下保存3周,37℃生理盐水复温后桥接于受体一侧坐骨神经10mm缺损段;B组用70%酒精浸泡8小时后,桥接于受体一侧坐骨神经10mm缺损段;C组的供体神经不经任何预处理,桥接于受体一侧坐骨神经10mm缺损段.术后17周进行电生理测定,光镜观察及移植异体神经中段的轴突计数.结果 A、B实验组的电生理测定及移植神经中段的轴突计数结果无显著性差异,光镜下的形态学变化相似.A、B组与C组,电生理测定与移植体中段轴突计数均有显著性差异.结论两种预处理方法降低异体神经的抗原性具有相似的近期效果.
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冻存保护剂对低温保存的组织工程骨修复骨缺损的影响
目的 探讨不同方法低温保存的组织工程骨修复节段性骨缺损的差异.方法 以骨髓基质干细胞(marrow stromal cells,MSCs)复合部分脱蛋白骨培养制备组织工程骨,组织工程骨分别用添加或不添加冻存保护剂的保存液于-80℃深低温冻存3个月,3个月后复温冻存的组织工程骨.选择60只新西兰白兔,制作15mm长的桡骨节段性骨缺损模型,实验根据植入不同的材料分为A、B、C和D组.A组:骨缺损区植入添加冻存剂保存的组织工程骨;B组:骨缺损区植入未添加冻存剂保存的组织工程骨;C组:骨缺损区植入未行低温保存的组织工程骨;D组:骨缺损区植入部分脱蛋白骨.术后4、8、16周取材,行X线检查、组织学观察、计算机图像分析和生物力学测定.结果 术后4、8、16周各组骨缺损区均有新骨生成,成骨量随时间的推移而增加.经X线、组织学和生物力学评估,A组与C组比较未见差异(P＞0.05),A组或C组分别与B组和D组比较,成骨能力依次为:A或C＞ B ＞ D(P＜0.001,P＜0.05),其中A或C组术后16周骨缺损完全修复,骨髓腔再通,生物力学性能接近正常骨.结论 选择适宜的冻存保护剂对组织工程骨的生物活性有一定的保护作用.
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人工皱缩后玻璃化冷冻小鼠扩张囊胚的效果观察
目的:观察冷冻前人工皱缩小鼠扩张期囊胚的囊胚腔,冻融后小鼠扩张期囊胚的存活率及体外和体内继续发育能力.方法:冻前先应用自制的玻璃微细管人工皱缩小鼠囊胚腔后,再应用冷冻环进行玻璃化冷冻小鼠扩张期囊胚150个.冻融后培养3 h观察胚胎存活情况,以新鲜扩张囊胚为对照,并将存活胚胎及新鲜未冻囊胚移植受体孕鼠子宫内,观察胚胎的妊娠率和产仔率.结果:人工皱缩后小鼠扩张囊胚的存活率及孵出率均显著高于未皱缩组(P＜0.05),皱缩组与对照组无显著差异(P＞0.05).移植后皱缩组的妊娠率及产仔率均显著高于未皱缩组(P＜0.05),皱缩组与对照组无显著差异(P＞0.05).结论:冻前人工皱缩小鼠扩张期囊胚的囊胚腔后,再应用冷冻环进行玻璃化冷冻是个行之有效的方法,能明显提高囊胚的玻璃化冷冻效率.
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卵低温保存过程中透明带提早硬化的影响因素和调控机制
人卵低温保存是女性生育力保存和不育症治疗的重要辅助生殖技术,但其导致的透明带提早硬化使体外受精率显著降低,且其机制尚不明确.本文对透明带在卵低温保存过程中发生提早硬化的影响因素和调控机制进行了综述,有助于加强研究以提高卵低温保存技术和辅助生殖技术的有效性和安全性.
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两种冷冻保护剂玻璃化冷冻小鼠卵巢的比较研究
目的:探讨两种玻璃化冷冻保护剂对小鼠卵巢组织学和功能的影响.方法:将23只4周龄ICR雌鼠随机分为新鲜卵巢移植组(6只)、去势组(5只)、EG40组(6只)和ED20组(6只).EG40组和ED20组分别应用乙二醇(EG)和联合应用EG与二甲基亚砜(DMSO)玻璃化冷冻小鼠卵巢组织,一周后解冻,将一部分复苏卵巢组织自体移植入小鼠肾被膜下,另一部分组织行组织学观察.移植术后5 d开始观察所有小鼠的动情周期,一个月后处死小鼠,对存活的卵巢组织行组织学观察.结果:EG40组、ED20组和新鲜卵巢移植组小鼠动情周期出现率均为100%,出现动情周期的天数分别为10.2±1.2 d、8.0±0.9 d和6.8±1.0 d,EG40组动情周期出现天数明显多于新鲜卵巢移植组(P＜0.01);ED20组与新鲜卵巢移植组差异无显著性(P＞0.05).移植存活的卵巢组织内可见不同发育阶段的卵泡,形态正常,但冻融卵巢组织内卵泡数量比新鲜组织少.结论:联合应用玻璃化冷冻保护剂EG和DMSO对小鼠卵巢组织学和功能的影响较小.
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不同浓度保护剂对超速冻存小鼠卵巢组织的效果观察
目的:寻找适宜的小鼠卵巢组织超速冻存低温保护剂种类及浓度.方法:以不同浓度二甲亚砜(DMSO)和丙二醇(PROH)(1.5 mol/L、3 mol/L)作低温保护液时,观察超速冻存法对小鼠卵巢组织的冻存效果.解冻后行自体和异体卵巢的肾被膜下移植.通过对受体动情期的恢复及激素水平测定等方法对冻存效果进行观察.结果:低浓度组DMSO和PROH动情期的恢复率分别为75%和71%;血清E2分别为(10.5和16.8)×10-9mmol/L,与作为对照的慢速程序法组无显著性差异(66.7%和100%;11.7×10-9mmol/L和12.1×10-9mmol/L).高浓度动情期的恢复率分别为100%和62.5%;血清E2分别为14.1×10-9mmol/L(DMSO)和7.4 × 10-9 mmol/L(PROH),与慢速组比也无显著性差异.结论:两种浓度的DMSO和PROH均适用于超速冻存法,尽管高浓度的DMSO在超速冻存时可取得较好的动情周期恢复率,但血清E 2水平的结果以低浓度的PROH为好.
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冷冻保存对人卵巢组织雌二醇分泌功能的影响
目的:探讨冷冻保存对人卵巢组织E2分泌功能的影响.方法:收集20例卵巢良性肿瘤手术患者的正常卵巢皮质,随机分为新鲜对照组和玻璃化冷冻组,冻融后行体外培养,比较冻融前、后人卵巢组织的内分泌功能. 结果:①在体外培养期间,所有卵巢组织均能持续分泌E2.新鲜对照组E2分泌水平始终高于冷冻组,培养前10 d,差异有统计学意义(P<0.05);培养12 d之后,组间E2水平无统计学差异(P>0.05).②体外培养初期E2分泌水平较平稳,随培养时间延长E2水平呈波动性变化.结论:人卵巢组织冷冻解冻后仍具有内分泌功能,随着培养时间的延长,新鲜组与冷冻组间E2分泌水平可能无差异.
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海藻糖对液氮保存同种带瓣大动脉组织结构的影响
目的 观察3种不同保护剂对液氮冻存同种带瓣大动脉组织结构影响,寻求佳冷冻保护剂.方法 单独使用0.1 mol/L二甲亚砜(对照组)及单独使用0.1 mol/L海藻糖(实验组1)和0.1 mol/L二甲亚砜+0.1 mol/L海藻糖(实验组2)作为冷冻保护剂,用光镜及电镜对新鲜组织及液氮保存6、9、12个月的带瓣大动脉进行形态学观察.结果 随着保存时间的延长,3组结构破坏均逐渐加重.光镜下观察,保存超过6个月后,3组形态学与新鲜组织比较均有改变(d=17～30,P<0.01),3组之间比较差异有显著意义(d=6～13,P<0.01、0.05).电镜下观察, 保存6、9、12个月时,对照组的同种带瓣大动脉组织的超微结构改变十分明显,实验组1改变较对照组轻,实验组2的结构改变轻.结论 海藻糖对液氮保存的带瓣大动脉有较好的保护作用; 单独使用0.1 mol/L海藻糖保护效果优于单独使用0.1 mol/L二甲亚砜,二者联合应用保护效果明显好于单独使用.
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造血干细胞低温保存与复温操作规程（讨论稿）
低温保存造血干细胞的效果受诸多因素的影响，如温度、降温速率、细胞含量、低温保护剂、解冻复温过程、保存时间以及检测指标，由于各研究中心之间所用方法存在一定差异，导致结果可比性差，循证力度较弱。因此至今为止，国内尚无相关操作指南，国外也只有欧洲的国际细胞治疗学会和血液及骨髓移植组联合认证委员会指南。作者结合自身多年血细胞低温保存工作经验和各种文献，起草了适用于医院小型低温保存库的操作规程，供同行参考，并期待大家批评指正。
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断肢（指）保存的研究进展
外伤所致肢（指）体离断是临床工作中常见的急诊创伤。在急诊创伤中，手外伤占15.0%～28.6%[1]，顾兴初[2]报道肢体离断伤占全部手外伤的19.3%，康庆林等[3]的报道中上述数字甚至达到了22.8%以上。肢体离断后，组织缺血缺氧，正常的代谢过程受到干扰，逐步产生一系列的病理变化，如代谢和毒性物质堆积、细胞胞浆空泡形成、线粒体水肿、功能下降、溶酶体稳定性下降，从而导致细胞变性、组织坏死，后必然导致再植肢体的功能障碍。然而，断肢再植的根本目的是重建离断肢体的血液循环，终使肢体恢复良好的功能。当前，交通事业和现代工业飞速发展，肢体离断合并多器官损害的发病率逐步上升，对临床再植工作提出了新的挑战。在重建血液循环之前，如何对离断肢体进行保存，以减少组织的缺血性损害，延缓组织变性坏死，为临床治疗赢得时间，确保再植肢体成活及功能的恢复，是目前临床工作中需要深入研究的课题之一。本文将国内外离断肢体保存的现状和新进展做一综述。
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肝脏低温机械灌注保存的研究进展
肝移植术已成为挽救终末期肝病患者唯一有效的手段［1-3］。随着器官移植的出现，器官保存技术也应运而生。肝脏保存技术分为单纯低温保存和机械灌注保存两种，由于单纯低温保存技术简单、易于操作，且保存时间可达24小时，基本能够满足器官保存的需求；但随着肝移植技术的不断发展，供肝短缺越来越成为制约肝移植技术发展的一大障碍，供肝标准也不断扩大，边缘供肝越来越多地应用于临床，边缘供体尤其是无心跳供体器官不可避免地会有更严重的损伤，原发性移植肝无功能等并发症的发生率也随之增加，为了更好地利用边缘供肝，迫切需要更好的器官保存技术减轻供肝的损伤。由于我国尚未采用脑死亡标准，对于供肝的保存要求更高，需要更好的保存技术以保证供肝的质量。机械灌注保存技术近受到人们越来越多的关注，机械灌注保存技术是指在保存过程中持续向肝脏泵入保存液直至移植，它尽量模拟生理状态下的肝脏灌注来减轻保存过程中所引起的肝脏损伤［4］。机械灌注根据需氧与否可分为氧合机械灌注和非氧合机械灌注，根据温度的不同可分为低温机械灌注和常温机械灌注，其中低温氧合机械灌注显示了对于心脏死亡器官捐献（DCD）供肝的良好保存效果，目前备受人们青睐，但是在灌注液的选择、氧合的应用与控制等方面尚无统一意见。
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冻融胚胎移植周期中高龄患者的临床结局分析
目的:分析冻融胚胎移植周期中高龄患者移植不同培养天数胚胎及单双胚胎的妊娠结局.方法:回顾性分析锦江妇幼保健院2008年1月至2015年12月高龄患者行冻融胚胎移植的1324个周期的临床妊娠结局,根据患者年龄分为三组:38～39岁(n-605),40～42岁(n-499),≥43(n-220),比较3组的临床结局;分析高龄患者不同年龄阶段移植双囊胚、单囊胚、双D3胚胎以及单D3胚胎的临床结局.结果:随着年龄的增长,妊娠率、活产率均呈下降趋势,38～39岁、40～42岁、≥43岁组患者妊娠率、活产率分别为52.4％、37.02％,33.27％、19.64％,15.45％、9.09％.三个年龄阶段中,移植双胚胎的临床妊娠率和活产率高于单胚胎,囊胚的临床妊娠率和活产率高于D3胚胎,移植双囊胚的妊娠率及活产率高,移植单D3胚胎的妊娠率和活产率显著低于其它3组,尤其是≥40岁患者,妊娠率＜10％,活产率＜3％.结论:对高龄患者,双囊胚移植妊娠率和活产率优,但多胎率增加,不建议移植1枚D3胚胎;38 ～42岁的不孕患者可获得可接受的活产率,可积极鼓励其及时接受助孕治疗;≥43岁患者应充分告知其低成功率和高流产率.
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全胚冷冻周期患者冻融胚胎移植次数和妊娠结局关系
目的 分析全胚冷冻周期患者冻融胚胎移植次数和妊娠结局的关系.方法 将解冻胚胎移植周期可以移植的1052个周期,根据年龄分成A组≤34岁,B组35～39岁,C组≥40岁,在根据胚胎移植数量分成单胚胎移植是D组,2个移植胚胎是E组,2个以上移植胚胎是F组,之后分析移植胚胎数量、年龄和冷冻胚胎解冻移植(FET)结局的关系.结果 A组妊娠率是56.1％,B组是40.9％,C组16.2％,A组和C组差异显著,差异有统计学意义(P<0.05);三组妊娠率存在差异,差异有统计学意义(P<0.05);E组减胎率、多胎率与F组存在差异;差异有统计学意义(P<0.05).结论 对于年轻患者应该尽可能减少移植胚胎数量,减少多胎妊娠率,降低妊娠期风险,超过40岁的患者妊娠率明显下降,移植胚胎数量和流产、宫外孕没有较大关系,一般选择冻融周期移植两个胚胎比较合理.
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肝素抗凝以及低温保存对血脂测定的影响
[目的]探讨抗凝剂肝素,低温保存(4℃)对脂类各种主要成分测定的影响,从而使脂类测定更加标准化.[方法]将同一份标本分别采用肝素抗凝和不抗凝,然后测定2 h血清和低温保存24 h的血清和血浆中的总胆固醇(TC),甘油三脂(TG),高密度脂蛋白(HDL-C),低密度脂蛋白(LDL-C),载脂蛋白(apo-A1,B).[结果]低温保存对血清中TC,TG,HDL-C的测定没有影响,但对载脂蛋白有影响.低温保存24 h对血浆中的载脂蛋白及HDL-C没有影响,但对TC,TG有影响.不论抗凝与否还是低温保存对LDL-C测定影响非常显著.[结论]标本采集后应及时测定,不能长时间保存.
