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体外培养后深低温保存兔颈总动脉结构和力学性能
①目的观察深低温保存后兔颈总动脉内皮细胞存在状态、平滑肌细胞存活与再生能力;观察并分析深低温保存后、体外培养后动脉血管壁的结构变化、血管力学性能变化.②方法获取兔子的颈总动脉并用含有1.5 mol/L 1,2-丙二醇(PROH)的低温保护剂深低温保存,复温时采用液氮中预冷的冰袋缓慢复温.以新鲜动脉作为对照.体外培养新鲜和冷冻复温后的动脉的平滑肌细胞(SMCs);同时将冷冻复温后的血管组织在体外培养6、12和24 h,以观察血管内皮细胞和SMCs的变化,以及血管壁的完整性(弹力膜或纤维的完整性)和这些血管的力学特性(弹性模量和断裂压力)的变化.③结果冷冻复温后血管SMCs在体外培养开始生长增殖所需的时间(24～36 h)几乎与新鲜血管相似,生长的速度也相似.冷冻复温后,血管内壁存留有少量的内皮细胞,平滑肌和血管壁结构没有明显变化.但是,血管力学性能显著降低(F=5.325～97.458,q=2.32～12.38,P<0.05、0.01).冷冻复温后的血管作为完整的组织体外培养后,所有的内皮细胞脱落,部分SMCs出现变性和坏死;弹力纤维和胶原出现不同程度的断裂,力学性能进一步降低(q=2.12～8.76,P<0.05、0.01).④结论本研究中应用的方法对于保护血管的SMCs是有效的,但是对于血管内皮细胞效果不好;冷冻复温过程和复温后体外培养损伤了血管壁的结构,降低了血管的力学性能.
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不同复温方法对深低温保存兔颈总动脉力学性能的影响
①目的研究4种不同的复温方法对深低温保存兔颈总动脉力学性能的影响.②方法深低温保存后的兔颈总动脉,随机分成4组,分别采用4种不同的复温方法复温:37 ℃水浴、空气复温、-20 ℃冰和液氮冰复温,以新鲜血管为对照.并分别测定4种方法复温后动脉的力学性能,包括轴向和周向弹性模数和断裂应力.③结果所有冷冻复温后的血管轴向和周向参数及断裂应力均小于新鲜血管(F=2.89～13.38,q=2.45～9.15,P<0.05).随着降温速率的降低,血管轴向弹性模数和断裂应力等参数基本是增加的.液氮冰中复温的血管,其上述参数接近新鲜血管.④结论逐步慢速复温可以改善深低温保存复温后血管的力学性能,液氮冰复温可能是好的复温方法.
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二甲亚砜与第二信使效应剂对深低温冻存血小板膜CD42b、CD62p表达的影响
①目的观察体积分数0.02二甲亚砜(DMSO)联合第二信使效应剂(ThromboSol,TS)在-196 ℃时对浓缩血小板膜CD42b、CD62p表达的影响,并了解体积分数0.02 DMSO+TS对浓缩血小板的长期(6个月)保存效果.②方法分别应用体积分数0.02 DMSO、体积分数0.06 DMSO、体积分数0.02 DMSO+TS作为冻存液-196 ℃冷冻保存浓缩血小板,并在冻存后1、3及6个月时分别取出复温,流式细胞仪检查血小板膜CD42b、CD62p表达水平.③结果冻存后1、3及6个月,体积分数0.02 DMSO+TS组与体积分数0.06 DMSO组血小板CD42b的表达水平差异无显著性(F=3.13～5.01,q=1.12～1.76,P＞0.05),两者均高于体积分数0.02 DMSO组(q=3.17～4.06,P＜0.05);但与新鲜组相比,3组冷冻保存血小板CD42b表达水平均有所下降(q=3.09～4.15,P＜0.05).体积分数0.02 DMSO+TS组CD62p的表达水平低于体积分数0.06 DMSO组和体积分数0.02 DMSO组,差异有显著性(F=5.75～9.77,q=3.20～4.34,P＜0.05),后两组差异无统计学意义(q=1.55～2.02,P＞0.05);与新鲜组相比,3组均明显升高,差异有显著性(q=4.85～7.35,P＜0.01).④结论第二信使效应剂的应用降低了DMSO的使用浓度,在抑制血小板的体外激活方面,体积分数0.02 DMSO+TS的效果优于体积分数0.06 DMSO,且长期(6个月)保存效果稳定.
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二甲亚砜与第二信使效应剂对深低温保存血小板超微结构的影响
①目的观察体积分数0.02二甲亚砜(DMSO)联合第二信使效应剂(ThromboSol)对深低温保存浓缩血小板超微结构的影响.②方法分别应用3种不同的保存液(体积分数0.02 DMSO、体积分数0.06 DMSO、体积分数0.02 DMSO+ThromboSol)-196 ℃冷冻保存浓缩血小板,并在冻存后1、6个月时分别取出复温,采用扫描和透射电镜观察血小板超微结构变化.③结果体积分数0.02 DMSO+ThromboSol组血小板能保持完整结构,部分血小板出现激活迹象,冷冻保存1个月和6个月的血小板超微结构无明显差异.④结论体积分数0.02 DMSO+ThromboSol能够有效地保护血小板超微结构,其6个月内的保存效果稳定.
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二甲亚砜与第二信使效应剂对深低温保存血小板聚集功能的影响
①目的观察体积分数0.02二甲亚砜(DMSO)联合第二信使效应剂(ThromboSol)对深低温保存浓缩血小板聚集功能影响.②方法分别用体积分数0.02 DMSO、体积分数0.06 DMSO、体积分数0.02 DMSO+ThromboSol作为保存液,在-196 ℃冷冻保存浓缩血小板,并在冻存后1、3及6个月时分别取出复温,检测各组的血小板计数、二磷酸腺苷(ADP)和花生四烯酸(AA)诱导的聚集反应.③结果冷冻1、3及6个月体积分数0.02 DMSO+ThromboSol组血小板计数、ADP及AA诱导的聚集反应结果与体积分数0.06 DMSO组相比差异无显著意义(F=3.67～5.22,q=0.87～1.89,P>0.05),均高于体积分数0.02 DMSO组,差异有显著意义(q=3.43～4.26,P<0.05).但与新鲜组相比,3组冷冻后各指标结果均有所下降,差异有显著性(q=3.16～4.34,P<0.05).④结论在深低温保存浓缩血小板过程中第二信使效应剂的应用降低了DMSO的使用浓度.
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小鼠卵巢组织的深低温保存和移植研究
①目的采用深低温保存方法冷冻保存小鼠的卵巢组织,观察移植后卵巢功能和组织学的恢复情况.②方法 36只昆明种小鼠随机分为3组:假手术组、对照组(新鲜移植组)和深低温保存组.假手术组不切除卵巢,对照组切除卵巢后即行自体原位移植,深低温保存组则将双侧卵巢完全摘除后,行二期手术自体原位移植深低温保存的卵巢.观察所有小鼠的动情周期的变化,并对卵巢的卵泡发育情况进行组织学检查.③结果假手术组小鼠的动情周期没有任何变化,对照组小鼠的动情周期也在手术后的不同时间内恢复正常,深低温保存组小鼠在完全切除卵巢后,完全失去了动情周期的变化;冷冻复温卵巢自体移植后,多数小鼠的动情周期恢复正常.组织学分析显示,深低温保存卵巢在自体移植后,卵巢可以存活,并有各级卵泡发育.④结论采用深低温保存方法保存后的小鼠卵巢复温后保持组织活性,自体移植后小鼠的动情周期恢复,卵巢中有正常卵泡发育.
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不同时间深低温保存对胸骨组织活性的影响
目的 观察不同时间深低温保存对胸骨组织活力的影响.方法 切取SD大鼠胸骨后立即放入含有低钾右旋糖酐(LPD)冻存液的冻存管,在程序降温仪降至-80℃后投入液氮,分别保存1、15、30、60、120 d后对胸骨组织进行体外培养,加入3H-胸腺嘧啶核苷(TaR)以做标记,使用β液体闪烁计数器检测组织细胞吸收情况和培养上清中的碱性磷酸酶(ALP)活性.结果 与冷冻前比较,低温保存1 d后胸骨组织培养上清中ALP活性开始降低,15 d降至低,以后基本保持稳定.低温保存1 d后, 3H-TdR掺入率降至90.02%.冷冻15 d以后3H-TdR掺入率降至73.9%,以后无明显变化.结论 深低温保存后胸骨组织保留70%～80%的活力,损伤主要发生在冷冻早期,ALP活性检测和3H-TdR体外组织培养是测定胸骨组织活力的有效方法.
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依达拉奉对断肢再植后缺血再灌注损伤大鼠骨骼肌线粒体的保护作用及机制
目的 探讨依达拉奉对断肢再植后缺血再灌注损伤大鼠骨骼肌线粒体的保护作用及其机制.方法 36只成年Wistar大鼠,随机分为对照组、冷冻组和药物组.对照组只暴露股动、静脉,不离断肢体;余两组制作深低温保存断肢再植缺血再灌注损伤动物模型,药物组洗脱液中含依达拉奉0.5 mg/kg.选取相同时点骨骼肌标本,提取骨骼肌线粒体,测定线粒体丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、线粒体呼吸控制率及抗氰呼吸,并对骨骼肌线粒体超微结构行透射电镜观察.结果 与对照组相比,冷冻组与药物组线粒体中的MDA显著增高,抗氰呼吸显著增加,SOD显著降低,呼吸控制率显著下降.与冷冻组比较,药物组的MDA水平及抗氰呼吸显著降低,SOD显著增高,呼吸控制率显著升高(P均＜0.05);病理改变在冷冻组为严重,药物组再灌注骨骼肌大部分线粒体完整.结论 依达拉奉能减轻深低温保存大鼠断肢再植骨骼肌线粒体的缺血再灌注损伤.其可能与依达拉奉直接抑制羟自由基,提高骨骼肌线粒体内SOD活性,减少MDA的产生,使细胞进行正常的氧化磷酸化有关.
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SMO保存液对犬肾低温保存期间氧自由基变化的研究
建立犬离体肾脏单纯低温保存模型,对照组供肾灌注和保存用HTK保存液和UW保存液,实验组用自制SMO保存液,分别在犬肾保存24、48、72 h切取肾皮质标本,测定皮质丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性.结果显示,实验组SOD活性48 h明显高于对照组,MDA含量各时点均显著低于对照组(P均＜0.05).实验组各时点SOD活性和MDA含量与UW液组比较均无统计学差异.提示SMO液在减轻氧自由基损伤方面优于HTK液,与UW液相当.
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生物体的深低温保存技术研究进展
近年来,低温保存技术的应用越来越广泛.低温可以降低细胞的呼吸代谢作用,延缓其功能的丧失,鉴于临床上将生物组织或器官采用特殊方法冷却至深低温,并长期保存,待需要时,再将其按特殊方法复温,以便获得活的生物体[1].
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低温保存机采单个供者血小板的临床应用
机采单个供者血小板(SDP)治疗血小板低下导致出血的效果显著,因此输注量上升,已成为目前临床输血的发展趋势.
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血红素加氧酶-1过表达延长肝脏低温保存时间的研究
目的 研究血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)过表达延长肝脏低温保存的时间及其机制.方法 利用大鼠肝脏离体再灌注模型,用钴-原卟啉(cobalt protoporphyrin,CoPP)和锌-原卟啉(zincprotoporphyrin,ZnPP)特异地诱导和抑制HO-1,观察肝脏保存0、6、24h,灌注2h后的胆汁生成量,灌流液AST、LDH、TNF-α和IL-6的活性,肝脏MDA的含量,肝组织HO-1蛋白表达的Western印迹,细胞凋亡情况等.结果 CoPP诱导了肝组织HO-1的表达,与未诱导24h保存组相比,CoPP诱导组的肝脏灌流液AST、LDH、TNF-α和IL-6的活性以及肝脏MDA含量显著降低,胆汁生成量明显增加,凋亡细胞数量减少(P<0.05),并与未诱导6h保存组接近.给予ZnPP后,这些保护作用消失.结论 HO-1过表达延长了肝脏低温保存时间,原因可能与抗氧化应激、抑制炎性因子的表达和细胞凋亡有关.
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二甲基亚砜和右旋糖酐对脐血造血细胞的低温保护作用
目的:探讨液氮保存中联合低温保护剂二甲基亚砜和右旋糖酐对造血细胞的保护作用和不同冻存时间对造血细胞活力的影响.方法:通过测定冻存前后总有核细胞数(TNC)、细胞活率、造血祖细胞集落生成情况,反映冻存后造血细胞损失情况及增殖能力.结果:40例脐血冻存后细胞活率平均为91.5%,TNC、粒-巨噬细胞集落形成单位、红系爆增式集落形成单位、混合集落生成单位平均回收率分别为95.0%、86.7%、81.8%、84.4%.不同保存时间细胞活率,TNC、祖细胞回收率差异均无显著性意义(P＞0.05).结论:联合保护剂对造血细胞有良好保护作用,适合于建立脐血库长期低温保存造血细胞.长期冻存造血细胞的效果与冻存时间无密切关系.
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当归对大鼠肝脏低温保存影响的实验研究
目的:研究当归对大鼠肝脏低温保存效果的影响及可能的作用机制.方法:采用大鼠肝脏低温保存模型,利用生化分析、光镜及电镜技术测定肝脏功能及观察肝脏组织形态学改变.结果:各保存时限(12h、24h、36h),B组(25%当归注射液20ml/CMU-1保存液1L,大鼠肝脏置于其中保存)和C组(25%当归注射液40ml/CMU-1保存液1L,大鼠肝脏置于其中保存)大鼠肝脏灌洗液的AST,LDH水平均较A组(单纯CMU-1保存液组,大鼠肝脏置于其中保存)为低,差异有统计学意义(P＜0.95),B组和C组间差异不显著(P＞0.05).在各保存时限内,B组和C组肝细胞和肝窦内皮细胞的损伤均较A组为轻,B组和C组损伤程度相当.结论:当归对低温保存的大鼠肝脏有保护作用;当归在保存液中达到一定浓度后(B组),即使再增加浓度(C组),并不能明显增加其保护作用.
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低温机械灌注在器官捐献供肾移植中的临床效果分析
目的 通过观察低温机械灌注保存器官捐献供肾肾移植的临床效果,探讨采用肾脏灌注转运箱(LifePort)对移植肾功能恢复的影响.方法 回顾性分析郑州人民医院器官移植科自2012年1月至2016年12月期间186例供肾移植的临床资料,其中68例供肾采用LifePort低温机械灌注保存;118例供肾采用静态冷保存.收集并分析两组受者术后肾功能恢复情况,统计原发性移植肾无功能(PNF)、肾功能恢复延迟(DGF)、急性排斥反应、感染等并发症的发生率,以及术后12个月、36个月的受者和移植肾存活率等相关资料.结果 两组受者在性别构成、年龄、血液透析患者百分率、透析时间、体重指数、热缺血时间、冷缺血时间等方面相比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).术后1周静态冷保存组受者血肌酐为(128.7±39.5)μmol/L,低温机械灌注组为(106.1±31.8) μmol/L,差异有统计学意义(t=2.145,P＜0.05);而受者术后3、6、12、24和36个月血肌酐相比较,差异均无统计学意义(t=1.369,P＞0.05;t=1.697,P＞0.05;t=1.329,P＞0.05;t=1.547,P＞0.05;t=1.698,P＞0.05).静态冷保存组术后DGF发生率为12.7％,低温机械灌注组为4.4％,差异有统计学意义(t=1.258,P＜0.05).两组间受者术后急性排斥反应和感染发生率的差异均无统计学意义(P＞0.05).静态冷保存组术后1年的受者和移植肾存活率分别为98.0％和95.5％,低温机械灌注组术后1年受者和移植肾存活率分别为98.5％和96.5％,静态冷保存组术后3年的受者和移植肾存活率分别为94.2％和92.5％,低温机械灌注组术后3年的受者和移植肾存活率分别为96.1％和94.2％,两组间的差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 应用LifePort对器官捐献供肾进行灌注较静态冷保存能够有效降低DGF的发生率.LifePort灌注时的阻力指数和灌注流量对供肾质量的评估具有重要的参考意义.
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低温机械灌注与冷保存应用于心脏死亡器官捐赠供肾效果的荟萃分析
目的 探讨低温机械灌注与冷保存应用于心脏死亡器官捐赠(DCD)供肾的效果差异,为临床DCD供肾选取佳保存方式提供依据.方法 计算机检索中国知网、中国生物医学文献、维普中文科技期刊、万方数据知识服务平台、PubMed、EMbase、Ovid、EBSCO数据库,检索时间均为2000年1月至2014年12月,同时检索相关文献的参考文献,纳入所有低温机械灌注与冷保存在DCD供肾效果分析的随机对照试验、病例对照试验及回顾性队列分析,应用Review Manager软件对资料进行荟萃分析.结果 10篇文献纳入荟萃分析,低温机械灌注组1 590例,冷保存组1 834例.低温机械灌注组的受者移植肾功能延迟恢复发生率低(比值比=0.49,95％可信区间为0.30～0.80,P=0.004).两组原发性肾脏无功能发生率的差异无统计学意义(比值比=1.55,95％可信区间为0.54～4.42,P=0.41)且移植后1年移植肾存活率的差异也无统计学意义(比值比=0.79,95％可信区间为0.37～1.69,P=0.54).结论 在DCD供肾移植中,低温机械灌注的保存方式优于冷保存,但其改善保存效果的能力有限.
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心肌组织射频频段介电特性参数tanδm在保存猪心心肌活性评价中的应用
目的 探讨不同保存温度下猪心肌组织射频频段介电特性参数tanδm的变化，及其与心肌活性的关系。方法 葡萄糖-胰岛素-K+停跳液诱导杂种幼猪心脏停跳，获取心脏，分为3组，A组保存于4℃下12h，B组保存于15℃下6h，C组保存于25℃下4h。保存过程中，每5min测定各组心肌组织tanoδm，每30 min测定心肌组织ATP含量，并对tanδm与ATP变化的关系进行探讨。结果 3组保存开始阶段tanoδm均明显下降，A组下降相对缓慢，C组下降为明显。保存1h时，B、C组tanδm的含量与A组相比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；但保存2、3和4h时，B、C组tanδm的含量低于A组(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01)。ATP与tanδm的皮尔逊相关系数为0.643(P=0.01)。结论 心肌组织射频频段介电特性检测方法简捷、准确、无创，其检测结果tanδm与心肌活性（ATP含量）呈正相关。
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人动脉的低温-深低温序贯保存
目的 通过观察低温及深低温保存后移植血管的细胞代谢活性及组织结构变化情况,探讨低温-深低温序贯保存人体血管的可行性与安全时限. 方法 取人的髂动脉和脾动脉,于4℃UW液中分别保存72 h、1周、2周、3周和4周,得到的血管一部分分别行氯化硝基四氮咗蓝(NBT)染色和HE染色.另一部分继续于-80 ℃下深低温冻存4周,复温后分别行NBT染色和HE染色,光镜及电镜下观察血管组织和细胞结构变化. 结果 冷保存2周时的血管NBT染色时间的差异无统计学意义(P＞0.05);冷保存后1周,冻存前后的染色时间的差异无统计学意义,冻存者的染色时间与新鲜血管比较,差异也无统计学意义(P＞0.05).随着4℃冷保存时间的延长,血管组织结构的破坏加重,当保存时间超过2周时.血管损伤更加明显及严重;4℃下保存越久的血管,再行-80℃冻存后其超微结构破坏越重,当4℃下保存时间超过1周时,血管损伤更加明显及严重. 结论 4℃UW液冷保存人体动脉的安全时限为2周;4℃UW液冷保存1周以内的血管再行-80℃深低温冻存,其细胞代谢活性与组织结构保持良好.
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深低温冻存降低人脐静脉血管内皮细胞的免疫原性
目的 探讨深低温冻存对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)免疫原性的影响.方法 体外分离、培养HUVEC,将传代至第2代的HUVEC进行冻存、复苏.将复苏的HUVEC与人淋巴细胞进行单向混合人淋巴细胞-血管内皮细胞培养(MLEC),观察HUVEC刺激下淋巴细胞增殖情况(测定刺激指数);利用流式细胞仪检测冻存前后HUVEC的HLA-A、B、C及HLA-DR抗原表达的变化;检测不同浓度γ干扰素(IFN-γ)作用下新鲜及冻存HUVEC的HLA-A、B、C及HLA-DR抗原的表达情况.结果 新鲜HUVEC的刺激指数为1.716±0.181,冻存HUVEC为1.686±0.145,二者间的差异无统计学意义(P>0.05).新鲜HUVEC和冻存HUVEC的HLA-A、B、C抗原表达率分别为(96.6±1.9)%和(96.0±1.4)%,表达强度分别为84.1±5.7和82.4±4.8,二者间比较,差异均无统计学意义(P>0.05).新鲜HUVEC和冻存HUVEC均不表达HLA-DR抗原.当IFN-γ的浓度≥100 U/ml时,新鲜HUVEC和冻存HUVEC的HLA-A、B、C表达强度逐渐增强(P<0.01),同一IFN-γ浓度下,新鲜HUVEC和冻存HUVEC的HLA-A、B、C表达强度的差异均无统计学意义(P>0.05);新鲜HUVEC和冻存HUVEC的HLA-DR表达随IFN-γ浓度的升高逐渐加强,其表达率和强度均呈剂量依赖性(P<0.01),新鲜HUVEC较冻存HUVEC表达更显著(P<0.01).结论 在无或低浓度IFN-γ(≤50 U/ml)条件下,深低温冻存对HUVEC免疫原性的影响不显著,而在高浓度IFN-γ(≥100 U/ml)条件下,深低温冻存的HUVEC的HLA-DR抗原表达显著低于新鲜HUVEC,这可能是冷冻降低免疫原性的机制之一.
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体外持续肝脏灌注常温保存和HTK液低温保存无心跳供肝效果的比较
目的 比较应用组氨酸-色氨酸-酮戊二酸(HTK)液低温保存和体外持续肝脏灌注(ECLP)系统常温保存无心跳供肝的效果.方法 按保存方法不同将供肝随机分为A组和B组:供肝切取后,A组用HTK液在低温下保存10 h;B组用ECLP系统在常温下用稀释的自体血液持续灌注10 h.两组供肝再经过60 min冷缺血期后,连接ECLP系统用稀释的自体血液再灌注4 h.观察再灌注后1、2、3、4 h四个时间点的胆汁分泌量,门静脉和肝动脉的压力,肝脏耗氧率的变化,灌注液中丙氨酸转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖水平以及灌注后供肝的常规病理和超微病理变化.结果 B组再灌注后1、2、3、4 h时间点的胆汁分泌量,门静脉和肝动脉的压力,灌注液中ALT、LDH和葡萄糖水平,以及2、3、4 h时间点的耗氧率与A组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);B组供肝的病理损害程度较A组轻.结论 供肝切取后10 h内,利用ECLP系统持续灌注常温保存比用HTK液单纯低温保存在维持无心跳供肝的功能和生理活性方面效果更好.
