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HSP65基因PCR-限制性片断长度多态性分析毛细管电泳技术鉴定分枝杆菌的初步研究
目的建立HSP65 PCR-RFLP毛细管电泳快速鉴定分枝杆菌的方法.方法采用PCR扩增分枝杆菌65-kDa热休克蛋白(HSP65)基因的一个约440bp片段,扩增产物分别经限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ酶切后,用毛细管电泳-激光诱导荧光检测酶切片段.结果试验的全部7种分枝杆菌都有各自独特的酶切图谱模式,几乎所有酶切片段都能很好地分离.结论该方法用于分枝杆菌种水平的鉴定具有准确度、分辨率和灵敏度高的优点.
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结核杆菌HSP65与IL-12多价DNA疫苗的构建
[目的]构建结核杆菌H37RV株HSP65基因与IL-12基因的共表达载体pVIV02-HSP65-IL-12,并研究其在Vero-E6细胞内表达的可行性,为新一代结核多价DNA疫苗寻找理论依据.[方法]采用PCR技术,从培养的结核杆菌H37RV中抽提HSP65基因,克隆到pVIV02-MCS上的一个多克隆位点,构建pVW02-HSP65,将质粒pORF-IL-12上的IL-12基因经双酶切后,亚克隆到pVIV02-HSP65上,构建成共表达载体pVIV02-HSP65-IL-12.并经XbaI/AvrⅡ和NeeI/NheI进行双酶切和测序鉴定;用间接免疫荧光法(IFA)检测HSP65和mIL-12基因在Vem-E6细胞中的表达.[结果]双酶切和测序分析证明HSP65基因和mIL-12基因成功克隆到pVIV02-MCS上,且方向正确,序列无突变;间接免疫荧光试验结果为阳性.[结论]共表达载体pVIV02-HSP65-IL-12构建成功,且pVIV02-HSP65-IL-12可在Veto-E6细胞中获得共表达.
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热休克蛋白－肽复合物与肿瘤免疫
热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一类在生物进化过程中高度保守,广泛表达于所有生命机体组织细胞并具有管家功能的蛋白质.根据分子量的差异,HSP可分为10个家族,包括HSP 110/grp 170、gp96/grp94、HSP90、HSP70/grp78、HSP65、HSP25/27等,每个家族有1～5个成员[1].
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2014至2016年温州地区呼吸道非结核分枝杆菌的流行状况分析
目的 研究温州地区近三年呼吸道非结核分枝杆菌(NTM)的分离率、菌种分布及其变化趋势.方法 收集2014年1月至2016年12月疑似肺结核的患者,送检痰或肺泡灌洗液进行分枝杆菌培养,分枝杆菌阳性菌株进一步采用基因芯片、16S rRNA和hsp65基因测序进行菌种鉴定.采用SPSS 19.0软件对数据进行分析.结果 剔除重复菌株后,共分离3 295株,包括结核分枝杆菌复合群(MTB)3 032株、NTM 238株、戈登氏菌属20株、诺卡氏菌属3株和束村氏菌属2株.2014至2016年NTM占分枝杆菌构成比分别为8.5％ (86/1 006)、6.7％ (72/1 079)和6.8％ (80/1 185) (x2=2.459,P＞0.05);NTM总分离率为7.3％ (238/3 270),NTM菌种类别达15种,前三位菌种分别为胞内分枝杆菌(52.5％,125/238)、脓肿分枝杆菌(22.7％,54/238)和鸟分枝杆菌(10.1％,24/238),其他NTM仅占14.7％(35/238).鸟分枝杆菌从2014年的第五位上升至2016年的第二位(x2=18.259,P＜0.01),而脓肿分枝杆菌占NTM构成比从2014年的34.9％(30/86)下降至2016年的17.5％ (14/80)(x2=7.335,P＜0.01).分离出NTM的患者,男性占56.7％(135/238),年龄＞45岁占79.8％ (190/238).结论 近三年温州地区NTM分离率呈平稳趋势.菌种以胞内分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌为主,鸟分枝杆菌分离呈持续上升趋势,而脓肿分枝杆菌分离出现下降趋势,值得临床医师关注.
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分支杆菌医院感染株与消毒标准株对消毒剂的抗性研究
目的 探讨分支杆菌戊二醛抗性株的抗性机制.方法 采用PCR扩增分支杆菌热休克蛋白(HSP65)基因的一个约440bp片段,分析医院感染株与消毒标准株的HSP65基因有无改变.结果 医院感染株与消毒标准株的PCR-RFLP图谱基本相同.结论 分支杆菌医院感染株与消毒标准株对2%强化中性戊二醛的抗性差异与分支杆菌hsp65基因无相关关系.
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结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光表达载体的构建及表达
背景:Hsp65和Esat6之间的Linker编码一段疏水性多肽,其具有良好的柔顺性和折叠性,有利于翻译成融合蛋白时融合蛋白之间的空间折叠,使融合蛋白保持与两个天然蛋白空间构象的一致性,从而形成正确的构型而提高它们的免疫原性.目的:从结核分枝杆菌(MTB)H37Rv株中克隆目的融合基因Hsp65-Esat6,与报告基因EGFP一起构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达.设计:单一样本实验.单位:暨南大学医学院微生物免疫学教研室.材料:质粒pVAE由华南理工大学曹以诚教授惠赠,MTBH37Rv株、大肠杆菌DH5α、表达质粒pEGFP-C1为本实验室保存,Hela细胞由本教研室胡萍博士惠赠.方法:实验于2005-09/2006-06在暨南大学医学院微生物与免疫教研室和中心实验室完成.以MTB全基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因(不含终止子),与pEGFP-C1载体进行重组,构建pEGHsp65(不含终止子)重组质粒.再以pVAE质粒为模板,经PCR扩增出Linker-Esat6基因,与pEGHsp65质粒(不含终止子)进行重组,构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6.通过限制性内切酶图谱测定pEGHsp65-Esat6融合质粒大小;对质粒pEGFP-C1的多克隆位点内的DNA序列进行序列分析鉴定;将质粒转染Hela细胞,观察荧光的表达情况及转染效率,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达.主要观察指标:①pEGHsp65-Esat6融合质粒大小.②pEGFP-C1DNA序列分析.③转染后Hela细胞的荧光表达情况.④细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的免疫组织化学结果.结果:①质粒pEGFP-C1的大小约为4.7 kb,而pEGHsp65为6.4 kb,融合质粒pEGHsp65-Esat6约为6.7 kb,在琼脂糖凝胶电泳图上可以分辨出泳动速度的差异.②结果与结核分支杆菌H37Rv株的Hsp65和Esat6的基因序列完全相同.③转染融合质粒24 h后,使用共聚焦显微镜可观察到有部分细胞表达荧光蛋白,说明融合质粒转染成功,转染率约为30%.未转染的Hela细胞则无荧光表达.④通过免疫组织化学法证实融合质粒在Hela细胞内能正确表达出具有生物学活性的Hsp65与ESAT-6蛋白.结论:采用Hsp65和Esat6搭配作为免疫原,成功克隆并构建了结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光真核表达质粒.
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结核杆菌pcHSP65真核表达载体的构建及其DNA免疫实验
目的:构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65kD基因为基础的核酸疫苗.方法:采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中,扩增出HSP65的编码基因,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的相应酶切位点,并将此重组质粒免疫动物.结果:重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP65.DNA免疫小鼠体内产生特异性抗体,能抵抗结核杆菌的感染.结论:以HSP65编码基因为基础的真核表达载体构建成功,并能引起特异性动物免疫反应,为进一步研究其在结核病防治中的作用奠定了基础.
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结核杆菌热休克蛋白肽段对胶原诱导性关节炎保护作用的研究
目的:研究结核杆菌HSP65肽段(P256-270)和结核杆菌HSP70肽段(P111-125)对类风湿关节炎动物模型--胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠的保护性作用.方法:结核杆菌HSP肽段滴鼻免疫大鼠,观察其对CIA的防治效果,观察指标包括关节炎指数评分、关节病理学分析、酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测脾脏淋巴细胞分泌细胞因子(IL-4、IFN-γ)水平、流式细胞术分析外周血T淋巴细胞亚群及酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清中抗CⅡ抗体水平.结果:分别经结核杆菌HSP65和HSP70肽段滴鼻免疫的实验组大鼠,与阳性对照组比较,关节炎指数明显下降(P＜0.05),病理变化减轻,抑制性细胞因子IL-4水平升高(分别为P＜0.05和P＜0.01),而炎性细胞因子IFN-γ水平降低(P＜0.01),CD4+/CD8+T细胞比值降低(P＜0.05),血清中抗CⅡ抗体水平也降低(分别为P＜0.05和P＜0.01).结论:应用结核杆菌HSP65肽段或HSP70肽段能减轻CIA大鼠的症状和体征,其作用机制与调节T细胞的功能有关,此研究可为探讨人类RA新的免疫治疗方法提供依据.
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HSP65在结核病血清学诊断中的应用前景初探
及时准确的诊断对结核病的防控至关重要.虽然简易快速的血清学检测技术在病毒等感染性疾病的诊断中得到广泛应用,但目前临床上结核病的血清学诊断技术尚不理想.我们通过间接ELISA方法比较筛查多个结核分枝杆菌抗原在正常人和活动期结核病患者中的血清学应答水平,发现结核分枝杆菌抗原HSP65(Rv0440)的特异性IgG水平在活动期结核病患者外周血浆中明显高于健康对照组(P＜0.0001),其检测的灵敏度达90%,特异性达90%,ROC曲线的AUC值达0.978,上述指标均与目前临床上使用的抗38 kD(Rv0934)蛋白的IgG水平相当;同时结合结核病患者临床资料分析结果显示抗HSP65的IgG在空洞病变结核病患者中的平均水平显著高于无空洞患者;部分抗38 kD IgG抗体阴性的结核病患者中抗HSP65 IgG抗体水平呈现阳性,提示抗HSP65 IgG可以成为目前商业化抗38 kD IgG检测的补充,从而进一步提高结核病诊断的灵敏度.上述研究结果表明抗HSP65 IgG抗体有望成为诊断活动期结核病的候选补充血清标志物.
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利用重组蛋白制备和鉴定分枝杆菌HSP65单克隆抗体
目的制备针对牛分枝杆菌热休克蛋白65(HSP65)的单克隆抗体(mAb)并进行鉴定.方法以CpGODN1826/Alum为佐剂,不同的HSP65融合蛋白为免疫抗原和检测抗窄,用聚乙二醇(PEG)法制备杂交瘤细胞,ELISA检测杂交瘤细胞分泌抗体的效价和类型,Western blot分析抗体的特异性.结果获得5株稳定分泌抗HSP65蛋白的McAb,3株细胞分泌的mAb为IgG1亚类,2株为IgG2a.ELISA和Western blot结果显示,mAb能特异性结合HSP65-PSA-tag、HSP65-MUC1-tag和HSP65重组蛋白,但与Chaperon-PSA重组蛋白和宿主菌BL21的菌体裂解蛋白不发生结合.结论纯化的重组蛋白可代替的牛分枝杆菌,用于HSP65 mAb的制备和鉴定.获得的HSP65 mAb为HSP65及其重组蛋白的功能研究奠定基础.
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结核杆菌Hsp65与人IL-2融合蛋白在耻垢杆菌表达
目的:构建能够分泌表达结核分枝杆菌热休克蛋白65(Hsp65)与人IL-2融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌(recombinant Mycobacterium Smegmatis,rMs).方法:用EcoRV和Hind Ⅲ双酶切合Hsp65-IL-2融合基因的pPRO-hsp65-IL-2载体,回收目的基因片断Hsp65-IL-2,并将其亚克隆入同样双酶切的大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭分泌表达载体pDE22中.重组质粒pDE22-hsp65-IL-2酶切鉴定正确后,电穿孔转化MS感受态,潮霉素抗性压力筛选阳性rMs.Western-blot鉴定rMs培养上清蛋白中目的蛋白的表达.结果:重组pDE22-hsp65-IL-2质粒酶切后可获得约2000 bp片段,与预期大小一致.Western-blot结果表明,rMs培养上清蛋白中有特异性反应条带,大小为78kD,与Hsp65-IL-2融合蛋白大小相一致.结论:成功构建了大肠埃希菌-分枝杆菌穷梭分泌表达载体pDE22-hsp65-IL-2,为该rMs的免疫学特性及抗结核分枝杆菌感染的保护效果研究奠定了基础.
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温州市非结核分枝杆菌菌种的地域分布特点
[目的]了解温州市11个区县呼吸道非结核分枝杆菌(NTM)的菌种分布情况.[方法]对2014年1月至2017年5月分离鉴定的NTM菌株,利用16S rRNA和hsp65基因测序或基因芯片进一步鉴定至种.[结果]菌种鉴定为NTM 293株(已剔除重复菌株),NTM种类达15种,以鸟分枝杆菌复合群(MAC)和脓肿分枝杆菌占绝对优势(89.4％,262/293),其他菌种仅占10.6％(31/293).分离NTM菌株数居前6位的区县依次为鹿城(28.7％,84/293)、 瓯海(13.7％,40/293)、 乐清(12.6％,37/293)、 永嘉(11.6％,34/293)、 苍南(10.6％,31/293)和瑞安(9.6％,28/293).鹿城、 龙湾、 瓯海、 瑞安、 永嘉和平阳等6个区县的前3位菌种均依次为胞内分枝杆菌、 脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌,胞内分枝杆菌是除苍南外各区县常见的菌种.[结论]温州市各区县的NTM菌种主要为胞内分枝杆菌、 脓肿分枝杆菌和鸟分枝杆菌,地域分布存在一定差异.
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皮肤苏尔加分枝杆菌感染一例
患儿女，7岁，因左侧面部斑块4年就诊。皮肤科检查：左侧面部见6cm×5cm境界清楚环状斑块，质韧，无明显触痛，皮损表面可见脓痂。组织病理：表皮部分破溃、坏死，真皮内弥漫性淋巴、组织细胞及上皮样细胞浸润，局灶伴较多嗜中性粒细胞。过碘酸雪夫染色（PAS）阴性、抗酸染色阴性。组织培养25 d后见暗产色分枝杆菌菌落。菌落涂片抗酸染色阳性。PCR扩增16S rRNA、hsp65基因产物发现与苏尔加分枝杆菌同源性接近，分别为100%、99%。给予利福平、异烟肼、乙胺丁醇治疗后好转。
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热休克蛋白HSP65DNA疫苗抑制黑色素瘤血行转移的实验研究
观察卡介苗来源的热休克蛋白HSP65的DNA疫苗对小鼠B16/F10黑色素瘤血行转移的抑制作用.构建含HSP65编码基因的真核分泌表达DNA疫苗pCR3.1-VS-HSP65及其后融合多个T细胞辅助表位的pCR3.1-VS-HSP65-TP-M2.连续8次肌肉注射免疫C57BL/6J雄性小鼠,采用ELISA法检测小鼠血清中抗HSP65-IgG类抗体滴度,于后一次免疫后第2周,尾静脉接种B16/F10黑色素瘤细胞,考察该疫苗的免疫原性及药效.ELISA结果显示两种HSP65核酸疫苗均能诱发高滴度抗HSP-IgG类抗体.pCR3.1-VS-HSP65-TP-M2诱发抗体滴度较pCR3.1-VS-HSP65显著增加,并能显著抑制B16/F10的血行转移(P<0.05),且与生理盐水对照组对比抑瘤率达到74.8%(肝),53.2%(肺).HSP65在增强其免疫原性的基础上能显著抑制B16/F10黑色素瘤的血行转移.
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结核分枝杆菌热休克蛋白65对ApoE基因敲除小鼠Treg/Thl7免疫平衡的影响
研究结核分枝杆菌热休克蛋白65(HSP65)对ApoE-/-小鼠Treg/Th 17免疫平衡的影响.首先,将结核分枝杆菌HSP65蛋白免疫高脂饲喂ApoE-/-小鼠,再采用ELISA检测小鼠血清中抗HSP65抗体的产生情况,流式细胞术检测血中CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞(Treg)和CD4+ IL-17+辅助性T细胞17(Th17)的数量,ELISA检测血清中IL-10、TGF-β1、IL-17和IL-21含量,生化分析仪检测血中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量,染色法计算动脉粥样硬化斑块面积.结果发现结核分枝杆菌HSP65蛋白诱导ApoE-/-小鼠产生了高水平的抗HSP65抗体,Treg细胞及其分泌的IL-10和TGF-β1细胞因子数量明显减少,Thl7细胞及其分泌的IL-17和IL-21细胞因子数量明显增加,TC、TG、HDL-C及LDL-C的含量未见改变,但动脉粥样硬化斑块的面积明显增加.由此可见结核分枝杆菌HSP65蛋白能够破坏ApoE-/-小鼠Treg/Th17免疫平衡,促进动脉粥样硬化的发展.
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2例肺部奴卡菌感染分析
目的 观察基因测序与质谱分析,在奴卡菌菌种鉴定方面的作用.方法 收集2例肺部奴卡菌感染患者的奴卡菌病原体,经过纯分培养,均同时进行了质谱检测和16S rRNA以及hsp65基因测序.结果1例患者质谱分析以及基因测序均证实为盖尔森基兴奴卡菌;另1例患者的质谱分析提示为盖尔森基兴奴卡菌,但16S rRNA以及hsp65基因测序则均证实为脓肿奴卡菌.结论 奴卡菌作为一种重要的机会致病菌,传统微生物学检测耗时费力,新型质谱分析( MALDI-TOF MS)有助于鉴定菌种,但基因测序仍是奴卡菌菌种鉴定的金标准.
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皮肤龟分枝杆菌感染的分子生物学鉴定
目的 用分子生物学方法鉴定龟分枝杆菌皮肤感染临床分离株.方法 从1女性老年糖尿病患者右小腿化脓性感染灶,取创面分泌物沙堡琼脂培养基28℃培养4d,连续两次培养出光滑、湿润、不产色白色菌落.菌落涂片革兰染色为阳性杆菌,抗酸染色阳性.多次真菌镜检、培养阴性.皮损组织病理:皮下组织慢性化脓性感染,大量炎性细胞浸润,局部小脓肿形成;抗酸染色弱阳性杆菌,过碘酸雪夫(PAS)染色阴性.根据该菌株生长特征、生化反应,初步考虑为龟分枝杆菌,使用16S-rRNA、rpoB、hsp65等分子生物学方法鉴定.结果 16 S-rRNA引物测序结果于GenBank中做Blast比对,与龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)AB548610.1同源性达100％,rpoB引物和hsp65引物测序结果做Blast比对与龟分枝杆菌同源性均为99％.结论 该分离菌株为龟分枝杆菌.
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结核分枝杆菌Hsp65的表达、纯化与鉴定
目的 克隆、表达和纯化结核分枝杆菌热休克蛋白65 (Heat Shock Protein 65),为研究结核病诊断技术提供基础.方法 用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中分两段扩增出hsp65基因,将上下游基因片段分别连接进入pMD18-T载体中,序列测定正确后,通过基因内部的单一酶切位点进行连接.将完整的hsp65基因克隆到pProEX Hta载体并在大肠杆菌DH5α中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化.获得的纯化蛋白与10例临床可疑结核病人血清进行Western-blot分析.结果 获得的结核分枝杆菌Hsp65基因序列与GenBank公布的一致;表达蛋白相对分子质量为65kDa,与文献报道相同;Western-blot结果显示,在相对分子量约65kDa处与鼠抗MTB Hsp65mAb特异性结合带;纯化的目的蛋白与8例病人血清有特异性结合条带,2例为阴性,该结果与临床诊断一致.结论 成功表达、纯化和鉴定了Hsp65蛋白,为其在结核病诊断研究中的应用奠定了基础.
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PCR-RFLP法直接检测分枝杆菌皮肤感染的临床应用
目的:评价分枝杆菌热休克蛋白65(Hsp65)基因检测分枝杆菌皮肤感染标本的敏感性和特异性.方法:多聚酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的10％非变性聚丙烯酰胺凝胶法直接检测Hsp65基因,PCR-RFLP检测阳性的标本再经Hsp65基因和16S rRNA DNA基因测序验证.结果:与培养法相比,PCR-RFLP法检测临床分枝杆菌皮肤感染的敏感性为30％ (3/10),特异性为100％(10/10).结论:分枝杆菌PCR-RFLP的10％非变性聚丙烯酰胺凝胶法可用于分枝杆菌皮肤感染的临床检测.
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PCR-RFLP法三种凝胶电泳快速鉴定分枝杆菌的比较研究
目的:比较2%一般琼脂糖凝胶、2%Metaphor琼脂糖凝胶和10%非变性聚丙烯酰胺凝胶分析分枝杆菌标准株酶切片段的准确性.方法:采用通用引物对分枝杆菌hsp65基因序列进行PCR扩增,限制性内切酶BstE II和Hae III对扩增产物进行消化,分别采用2%一般琼脂糖凝胶、2%Metaphor琼脂糖凝胶和10%非变性聚丙烯酰胺凝胶比较分枝杆菌标准株酶切片段的准确性.结果:与标准酶切图谱相比,所有10%非变性聚丙烯酰胺凝胶酶切片段差异均在15 bp以内,而2%Metaphor琼脂糖凝胶和2%一般琼脂糖凝胶则超过15 bp,甚至少数条带不能显示.结论:三种方法中以PCR-RFLP非变性聚丙烯酰胺凝胶法的准确性较高.
