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应用酵母双杂交技术筛选干扰素β结合蛋白的研究
目的 应用酵母双杂交技术筛选干扰素β(IFNβ)结合蛋白.方法 用多聚酶链反应(PCR)技术扩增IFNβ基因,连接酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性克隆,提取酵母质粒后转化大肠埃希菌(DH5α)并经氨苄西林抗性筛选,提取单克隆菌落质粒,进行酶切鉴定及序列测定,并进行生物信息学分析.结果 应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆29个,经生物信息学分析,排除读码框架不正确者,后得到19个克隆基因,编码14种已知蛋白和一种未知功能蛋白.初步发现铁蛋白与IFNβ具有结合作用.结论 应用酵母双杂交技术筛选出多种与IFNβ具有结合作用的蛋白.
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Aptamer核酸药物的研究进展
Aptamer指的是能结合蛋白或其他小分子物质的单链或双链寡核苷酸[1].体外筛选技术的发展和PCR技术的应用,使得Aptamer的研究近年来有了长足的进步,筛选到了一大批能与各种蛋白或小分子特异紧密结合的核酸分子(Aptamer).这些Aptamer包含了RNA、双链DNA、单链DNA等多种形式的寡核苷酸,其配体的性质各异.体外筛选Aptamer不仅增强了人们对核酸-蛋白相互作用的认识,也为寻找新药提供了一条途径.Aptamer核酸药物的研究近年来也取得了一些可喜成果.我们拟就该方面的进展及相关问题作一综述.
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Kinectin与树突状细胞TLR4-TRIF信号途径的相关性
驱动结合蛋白Kinectin是真核细胞内一种与囊泡转运相关的膜受体蛋白,为驱动蛋白(Kinesin)受体.当树突状细胞(DC)接受细菌脂多糖(LPS)的刺激后,其Toll样受体(TLR)4信号途径被活化,大量的抗原肽-MHC Ⅱ复合物被转运到细胞表面以启动免疫应答.研究表明,TLR4-TRIF信号途径对MHCⅡ从胞内转运到细胞表面至关重要.由于Kineetin定位于合成MHCⅡ的内质网且参与调节胞吐、胞质运输等过程,我们通过荧光定量PCR检测了小鼠骨髓来源DC中Kineetin的mRNA表达,以探讨其与TLR4-TRIF信号途径的关系.
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的SCCmec基因型及耐药谱研究
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)常引起医院感染的暴发流行.MRSA由于获得了外源性甲氧西林耐药决定子A(methicillin resistance determinant A,mecA),该基因编码青霉素结合蛋白2a,造成对所有β内酰胺类药物耐药.mec基因存在于葡萄球菌盒式染色体(Staphylococcal cassette chromosome mec,SCCmec)中,SCCmec是一种新型的可移动元件,不同于噬菌体和转座子,而且该元件还携带除mec4基因外的其他抗生素耐药基因,造成多重耐药.
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肺炎链球菌pbp2B基因突变与耐药表型关系的研究
肺炎链球菌主要通过青霉素结合蛋白基因突变,从而改变细胞壁上高相对分子质量青霉素结合蛋白(PBP)的结构,降低了其对抗生素分子的亲和性而产生对青霉素等β内酰胺类抗生素的耐药性.
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聚合酶链反应检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA和femB基因
近年来耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的感染率逐年上升,已成为全世界医源性感染的重要病原菌之一.目前国内多采用PCR方法检测编码耐药菌特异的青霉素结合蛋白(PBP2a)的mecA基因来鉴定MRSA,但近缘的细菌难以区分.如凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)中也发现具有修饰PBP2a的mecA基因.该基因具有属内种间的一致性, 耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)与MRSA mecA基因之间的DNA序列有99%以上是一致的.
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人巨细胞病毒UL57基因原核表达克隆的构建、表达及初步纯化
现有的IgM血清学试验对HCMV的诊断存在敏感性和特异性较差问题,其主要原因是迄今采用的抗原仍为从纯化的病毒颗粒中提取的病毒抗原性物质或粗提的病毒全抗原成分。近几年来人们致力于探讨能替代HCMV全病毒抗原的基因工程抗原,以完善IgM特异性血清学试验。本文通过构建HCMV DNA结合蛋白的一段基因的原核表达克隆,从而对表达产物的抗原性进行初步分析。 通过Oligosis软件设计UL57基因(aa540~604)两端引物,并在引物的5′端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ内切酶识别序列及保护位点。引物序列如下:P1:CTGGGATCCCCCAAAGGTGACGAC P2:GTGAATTCTCAGCGATTGAGGA。从感染的人胚肺成纤维细胞中提取和纯化HCMVAD169基因组,以纯化的核酸为模板,加入PCR反应体系进行UL57基因的扩增。
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肠杆菌科细菌碳青霉烯类抗生素耐药检测方法的研究进展
碳青霉烯类抗生素是20世纪70年代后期在沙纳霉素基础上研发出来的一类抗菌谱广,抗菌活性强的非典型β-内酰胺类抗生素[1-2],对质粒介导的超广谱β-内酰胺酶( ESBLs )、染色体及质粒介导的头孢菌素酶( AmpC酶)均具有高度稳定性,已经成为治疗严重细菌感染主要的抗菌药物之一。碳青霉烯类抗生素通过抑制胞壁黏肽合成酶,即青霉素结合蛋白( PBPs ),从而阻碍细胞壁黏肽合成,使细菌胞壁缺损,菌体膨胀致使细菌胞质渗透压改变和细胞溶解而杀灭细菌[3],其对革兰阳性菌、革兰阴性菌和厌氧菌均有较强的抗菌活性[4]。随着该类抗生素的的广泛使用,临床上不断出现碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌,给临床抗感染治疗和医院内感染控制带来了极大困难。
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NKG2D配体在鼻咽癌细胞的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响
NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关,NKG2D为NK细胞活化性受体,表达于所有的NK细胞表面,是介导NK细胞识别和溶解肿瘤细胞的主要活化性受体.NKG2D配体为MHC Ⅰ类链相关基因产物(MICA、MICB)及ULBPS(人巨细胞病毒UL16蛋白的结合蛋白ULBP1、ULBP2、ULBP3),NKG2D的配体在多种肿瘤细胞表达,其在鼻咽癌细胞的表达尚未见报道.本文通过流式细胞仪技术探讨其在鼻咽癌细胞CNE2的表达情况,并进一步分析其在NK细胞杀伤CNE2细胞中的作用.
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不饱和脂肪酸的抗肿瘤作用
抗肿瘤药物由于对正常组织的毒性及肿瘤对药物的耐药性,常导致化疗疗效不佳.Simonsen等[1]研究发现,癌细胞和正常组织在脂质代谢上有着根本的区别,利用不饱和脂肪酸可达到治疗肿瘤同时不伤害正常组织的目的.现对不饱和脂肪酸抗肿瘤作用的研究进展作一综述.一、不饱和脂肪酸饱和脂肪酸中的碳原子位于脂肪酸支架上,由单键连接,不饱和脂肪酸中有一个或更多的碳-碳连接为双键.含两个或两个以上双键的脂肪酸称为多不饱和脂肪酸.机体中重要的多不饱和脂肪酸为必需脂肪酸(EFA).有两族EFA,分别源自亚油酸(n-6系列)和α-亚麻酸(n-3系列).亚油酸和α-亚麻酸在体内通过一系列减饱和反应(脱氢和形成新双键)及两个碳原子加入链中的链延长能发生转化.目前已发现5个亚油酸和α-亚麻酸的代谢产物.特别重要的代谢物有n-6系列的dihomogammalinolenic acid (DGLA)和花生四烯酸,n-3系列的二十碳五烯酸(EPA)与二十二碳六烯酸(DHA).EFA有许多重要功能:①所有膜的正常结构所必需;②为第二信使前体;③参与细胞因子形成调节和绝大多数膜结合蛋白(受体、离子通道和ATP酶)的行为调节[2].
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豆腐果苷对慢性神经病理性疼痛大鼠热痛觉过敏及脊髓背角p-CREB表达的影响
目的:观察豆腐果苷(helicid)对坐骨神经慢性压迫伤(CCI)后大鼠热痛觉过敏的影响及对脊髓背角磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(phosphorylated cAMP response element binding protein,P-CREB)表达的影响.方法:32只180~220 g Wistar雄性大鼠随机分为4组(n=8);分别为Sham组(假手术组)、CCI组(CCI模型组)、H1组(CCI 10天后豆腐果苷,25 mg·kg-1·d-1×10 d灌胃)和H2组(CCI 10天后豆腐果苷,50 mg·kg-1·d-1×10d灌胃).4组分别于CCI手术前1天、CCI手术后1、3、5、7、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天进行热板实验、测后肢回缩时间(PWL).CCI后20天取L4、5脊髓,免疫组织化学染色,计数p-CREB免疫反应阳性(p-CREB-IR)神经元数量.结果:第一部分:CCI手术后第9天,Sham组、CCI组、H1组、H2组分别与术前PWL基础值比较,Sham组无差异(P>0.05),CCI组、H1组、H2组均有差异(P<0.05),且下降达30%以上;CCI手术后第9天,CCI组、H1组、H2组分别做PWL值组间两两比较均无差异(P>0.05),证实CCI模型制作成功.给药后第1-10天,H1组、H2组分别与CCI组做组间比较,PWL值增高,H2组第3天已有差异,H1组第5天开始有差异,两组PWL值增高至第7天达峰值,后一直保持稳定,H2组较H1组保持较高水平.第二部分:脊髓背角p-CREB免疫反应阳性神经元细胞计数比较:与Sham组比较,CCI组、H1组和H2组计数明显升高,有差异(P<0.01);H1组和H2分别与CCI组比较,数量较之为少(P<0.01);H1组计数稍大于H2组,但无差异;即CCI>H1>H2>Sham组.结论:口服豆腐果苷能剂量依赖性提高CCI大鼠热痛阈值,降低热痛觉过敏,并与影响脊髓背角P-CREB的表达有关.
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冷休克蛋白与肿瘤的研究进展
在环境温度发生明显改变时,生物体会产生某种蛋白来调节机体功能,以适应温度变化。比如,在环境温度降低时机体会在低温的刺激下产生一些蛋白来适应环境变化,该类蛋白统称为“冷休克蛋白”(cold shock proteins,CSPs)[1]。迄今为止,CSPs已经在微生物、植物及动物细胞中发现,而且已证实CSPs在核酸结构以及蛋白质结构上具有较高的同源性,且高度保守[2]。冷诱导RNA结合蛋白(cold inducible RNA-binding protein,CIRP)和RNA结合基序蛋白3(RNA binding motif protein3,RBM3)是两种人们关注较多的CSPs。以往大多数学者对这两种蛋白的研究侧重于观察低温诱导后其表达水平升高后所引发的生理调控变化,但近年来,有关CSPs在肿瘤发生发展中的作用愈加受到关注。本文将着重介绍 CIRP 及 RBM3在恶性肿瘤方面的研究进展。
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p53结合蛋白对细胞周期阻滞与细胞凋亡调控的研究进展
p53基因是人体内重要的肿瘤抑制基因,位于人类染色体17p13.1,含有11个外显子,编码的野生型p53蛋白由393个氨基酸残基组成,包含N-末端的转录激活结构域、生长抑制结构域、序列特异的DNA结合结构域(DNA binding domain,DBD)、核定位信号(nuclear localization signal,NLS)、四聚体化结构域和C-末端非专一DNA调节结构域.p53在监视细胞基因组损伤及维持基因组的稳定性中发挥重要作用.当紫外线、电离辐射、氧化应激及癌基因表达等刺激因素引起细胞内DNA损伤时,p53蛋白迅速聚集活化,并作为序列特异性转录因子对一系列靶基因进行调控.
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普通肝素对高迁移率族蛋白1介导的内皮细胞损伤的保护作用
高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)是一个丰富的DNA结合蛋白,通常驻留在细胞核中,是真核细胞核内的非组蛋白染色质结合蛋白,在维持核小体结构的稳定和DNA重组、复制、修复及基因转录中发挥着重要作用[1]。作为一种新的潜在晚期炎症介质,HMGB1参与了脓毒症发生的病理生理过程并起着重要作用。血管内皮细胞不仅是脓毒症受损的靶细胞,还通过多种生物学功能参与靶器官的损伤。炎症应激时,内皮细胞会释放HMGB1,促进细胞因子和黏附分子的表达,参与全身炎症反应,继而导致多器官功能障碍[2]。
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颗粒溶素酶联免疫吸附测定法的建立及临床初步应用
颗粒溶素(granulysin, GNLY)是脂结合蛋白-皂素样蛋白(saposin-like protein , SAPLIP)家族成员之一,具有广谱细胞毒活性,在抗感染和抗肿瘤免疫中发挥重要作用[1-3].因此,对GNLY血清表达水平准确定量具有重要意义.本中心建立GNLY血清水平酶联免疫吸附测定(ELISA)法,并检测30名正常人及30例传染性单核细胞增多症(IM)患者血清GNLY水平,以进行不同疾病期比较分析,并探讨GNLY在感染性疾病诊断和临床实时监测中的应用价值.
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猪链球菌2型毒力因子多重PCR检测方法的建立与应用
猪链球菌2型是一种重要的人兽共患传染病,该病已成为严重影响各国养猪业发展的一种重要疫病,同时也是公共卫生防疫的重点[1-2].不同猪链球菌2型菌株的致病力不同,可分为高致病性毒株、低致病性毒株、不致病性毒株3种,这种致病力差异与各菌株的毒力因子直接相关,猪链球菌的毒力因子较为复杂,已知的毒力因子有溶菌酶释放蛋白(MRP)、细胞外蛋白因子(EF)、溶血素(SLY)、荚膜多糖(CPS)、IgG结合蛋白、毒力相关序列、黏着素等,不同地区分离的猪链球菌菌株,其毒力因子出现的概率也不一样,尚缺乏统一的评价标准[3-7].
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儿童肺炎链球菌分离株pbp2B基因突变分析
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)是引起儿童呼吸道感染的常见病原菌.近年我国多中心研究发现,无论是儿童还是成人所分离到的青霉素耐药SP(penicillin resistant streptococcus pneumoniae,PRSP)已占SP分离总数的10.0%~50.0%,并呈上升趋势[1,2].PRSP主要为青霉素结合蛋白(penicillin-binding proteins,PBPs)编码基因突变所致[3、4].为了解我国耐青霉素SP菌PBPs基因的突变状况,我们对2002年9月至2003年4月28株分离自苏州地区患儿呼吸道的SP菌之PBP2B亚单位编码基因pbp2B进行了套式聚合酶链反应(nested polymerase chain reaction, nPCR)扩增及其产物的全自动DNA序列测定.
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细菌对β-内酰胺药的耐药性及检测方法
β-内酰胺药是临床用得多的抗生素类,细菌对付这类抗生素所产生的耐药机制种类繁多,十分复杂,为了更好地为临床服务,我们应该了解国内外这方面的研究进展,更重要的是细菌室要建立和掌握检测这些细菌耐药性的新技术,并且保证报告的结果是可靠的.现将细菌对β-内酰胺药产生的耐药性归纳如下.一、β-内酰胺药攻击的靶位--青霉素结合蛋白(PBPs)发生的重大改变
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用胰岛素样生长因子及其结合蛋白诊断垂体性侏儒症
生长激素(GH)缺乏性侏儒症是儿童矮小的重要原因,激发试验是判断垂体GH分泌功能的经典方法.但该方法需多次采血、有不良反应,准确性、重复性欠佳.本研究用免疫放射分析法(IRMA)检测GH缺乏症(GHD)、特发性矮小症(ISS)患儿及健康儿童血清中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和IGF-1结合蛋白3(IGFBP-3)[1],探讨其临床诊断价值.
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头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)不仅对甲氧西林耐药,且具有多重耐药性.目前由于某些菌株在甲氧西林耐药表型上出现不均一性,影响了临床常用的表型检测方法如苯唑西林纸片扩散法、MIC法的准确性,且这类菌株正逐渐增加,并由医院感染向社区感染发展[1].mecA基因和青霉素结合蛋白PBP2a的检测是目前公认的MRSA检测鉴定的金标准,但这两项技术要求高、试剂昂贵,不适合普通临床实验室大量开展[2].有报道使用30μg头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,可克服使用苯唑西林鉴定方法的局限性,具有较好的敏感性和特异性[3-5].本研究对该方法用于临床实验室快速筛选MRSA进行研究.