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淋病奈瑟菌青霉素、四环素耐药的分子检测
淋病奈瑟菌(Neisseria Gonorrhoeae,NG)的青霉素、四环素耐药表型研究(即药敏分析)国内已有较多文献报导.但不同的药敏检测方法其检出率的差异颇大.NG对青霉素、四环素耐药多数分别为获得TEM基因和Tet M基因的质粒所致.为精确了解常州地区NG对青霉素、四环素的耐药状况,我们应用以TEM基因为靶基因的套式聚合酶链反应(nested Polymerase Chain Reaction,nPCR)和以Tet M基因为靶基因的PCR技术对分离自常州地区的50株NG进行了分析检测,现将结果报告如下.
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套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测
目的应用套式PCR-DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法,并评价其临床应用价值.方法采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况.同份痰标本同时做涂片抗酸染色,罗氏培养及菌型鉴定.结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性,产物DNA测序31例有rpoB基因突变,其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变,耐药突变率90.6%(29/32),39例菌阴(涂阴培阴)痰中有2例发生突变.分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变,20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性,特异性100%.结论套式PCR-DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法.
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120例系统性红斑狼疮患者支原体感染的状况研究
支原体是人类呼吸道和尿道的常见病原体,近年来被认为与人类自身免疫性疾病有关系.国外学者陆续报道了系统性红斑狼疮(SLE)患者的血液、关节腔和关节、心脏瓣膜修复部位分离到人型支原体.鉴于国内外尚无SLE患者咽部、睑结膜部和泌尿道支原体感染状况的研究报道.我们于2001年3月至2003年5月收集了120例SLE患者的咽、睑结膜、泌尿道拭子以及血清标本,应用套式聚合酶链反应(nPCR)进行解脲脲原体(Uu)、人型支原体(Mh)、发酵支原体(Mf)、关节炎支原体(Mar)核酸检测,并将阳性标本进行DNA测序.结果报告如下.
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输卵管妊娠者输卵管组织生殖支原体检测研究
应用套式聚合酶链反应(nPCR)检测了输卵管妊娠者之输卵管组织中的生殖支原体(Mg)DNA,目的在于探讨输卵管妊娠与Mg感染可能存在的关系.
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汉族人群载脂蛋白CII基因二核苷酸串联重复序列(TG)n(AG)m及(AG)m多态性
采用套式聚合酶链反应结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术,并构建载脂蛋白CII (ApoCII) 基因二核苷酸串联重复序列(TG)n(AG)m及(AG)m序列等位基因梯阶标准;检测正常汉族人群基因型和等位基因频率分布,检出36种(TG)n(AG)m序列基因型、12种等位基因.等位基因为17、18、26~35,其频率分别为0.061、0.011、0.002、0.002、0.054、0.255、0.372、0.084、0.026、0.039、0.052、0.041.检出7种(AG)m序列基因型、4种等位基因.等位基因为6、7、8、9,其频率分别为0.002、0.152、0.812、0.034.与欧洲白种人比较,ApoCII基因二核苷酸串联重复序列(TG)n(AG)m及(AG)m序列等位基因频率分布均具有明显的种族差异性(P<0.01,P<0.01).
关键词: 载脂蛋白CII 二核苷酸串联重复序列 基因多态性 套式聚合酶链反应 -
浅析支原体污染对非脊髓灰质炎肠道病毒分离率的影响
为探讨脊髓灰质炎(脊灰)实验室网络中非脊灰肠道病毒(NPEV)分离率下降的原因,采用套式聚合酶链反应(PCR)法对24个省(自治区、直辖市)的40份脊灰病毒(PV)分离物,用国家脊灰实验室的RD、HEp-2、L20B细胞及3个不同厂家生产的牛血清进行了支原体检测.结果显示:40份PV分离物中,37份检测到支原体,阳性率为92.5%,其中9份PV分离物感染了2种支原体;3种细胞悬液均被同种支原体污染;3份牛血清中未检出支原体.经核苷酸序列测定证明,污染的2种支原体为猪鼻支原体(M.hyorhinis)和精氨酸支原体(M.arginini).该实验表明,脊灰实验室网络中普遍存在支原体污染,这也许是导致近年来NPEV分离率普遍下降的原因之一.NPEV分离率是评价脊灰实验室监测敏感性的重要指标之一.我国正处于消灭脊灰后期的一个关键时期,除了有来自邻国脊灰野病毒输入的危险外,因为我国是使用减毒活疫苗预防脊灰的国家,还有发生疫苗相关麻痹型脊灰或由疫苗衍生脊灰病毒引起病例的危险.实验室监测敏感性下降会导致这些病毒的漏检,从而增加其向外扩散的危险.因此必须彻底消除支原体污染,以提高脊灰实验室网络的敏感性,保证网络监测的质量.
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浅析支原体污染对手足口病相关肠道病毒分离率的影响
目的 探讨支原体污染对手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)相关肠道病毒(Enterovirus,EV)分离率的影响.方法 随机选择13个省的HFMD相关EV培养物共26份,同时从EV复核率较低的某省送检的HFMD相关EV培养物中,随机挑选18份,采用套式聚合酶链反应(Nested Polymerase Chain Reaction,nPCR)对细胞培养物中的支原体核酸进行检测.对阳性产物进行序列测定,通过基本多序列比对工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)对序列进行同源性比对.结果 随机挑选13个省的EV培养物中,4个省的标本支原体检测结果为阴性,1个省同时检出猪鼻支原体和精氨酸支原体,8个省检出精氨酸支原体.EV复核率较低省送检的18份培养物中均检出牛支原体.结论 支原体污染在中国HFMD实验室使用的细胞系中普遍存在,某些支原体的污染,可能降低细胞的敏感性,引起病毒分离率的下降.避免细胞系的支原体污染对提高HFMD实验室网络运转质量具有重要意义.
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套式PCR扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县疟原虫感染的研究
目的采用套式PCR系统诊断、鉴别人体疟原虫感染. 方法采用已建立的套式PCR系统扩增SSU rDNA特定片段检测云南金平县恶性疟镜检阳性患者的6份血样,并设阳性与阴性对照. 结果间日疟原虫、恶性疟原虫和三日疟原虫感染血样中分别扩增出104 bp、102 bp和115 bp预期大小的特定扩增带.正常人血、人源弓形虫、杜氏利什曼原虫DNA及灭菌双蒸水均未产生特异扩增带.6份血样中检出4份P.v.、P.f.和P.m.的混合感染,1份P.v.和P.f.及1份P.f.和P.m.的混合感染. 结论该系统特异、灵敏、稳定,在诊断疟疾的同时可准确地判定混合感染,对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控等具有实际应用价值.
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套式聚合酶链反应检测豚鼠巨细胞病毒宫内感染
人巨细胞病毒(HCMV)宫内感染是导致出生缺陷的重要因素之一,其致病机制迄今尚未阐明.本研究建立豚鼠巨细胞病毒(GPCMV)宫内感染模型,将灵敏性和特异性均较高的套式聚合酶链反应(N-PCR)用于研究检测,报道如下.
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静脉吸毒者SEN病毒基因型检测和序列测定
SEN病毒(SENV)是一种新发现经输血、静脉吸毒等方式传播的DNA病毒.为此,我们采用套式聚合酶链反应(nPCR)检测方法,初步获得了SENV-D和SENV-H两个亚型在湖北地区静脉吸毒者(intravenous drug users,IVDUs)中的感染情况.
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2006年北京市外来人口中HIV-1感染者流行毒株gag基因序列测定和亚型分析
目的 了解北京市外来人口中HIV-1亚型的特点和流行规律.方法 随机采集北京市2006年外来人口中新确证HIV-1感染者的抗凝全血标本80份,分离血浆,提取病毒RNA,用套式聚合酶链反应扩增病毒gag基因,并进行序列测定和亚型分析.结果 系统进化分析确定北京市外来人口HIV-1毒株属于8个亚型,分别为B亚型4份,泰国B亚型15份,C亚型1份,CRF01_AE亚型5份,CRF02_AG亚型1份,CRF07_BC亚型29份,CRF08_BC亚型3份,CRF15_01B亚型1份.结论 北京市外来人口中已存在8种HIV-1亚型和流行重组型,应该加强对HIV-1亚型变异的监测.
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HGV RNA逆转录套式聚合酶链反应法的优选实验
1995年,美国Simons等和Linnen等分别从肝炎患者的血清中克隆出庚型肝炎病毒(GBV-C/HGV)的基因组,并建立了检测血清GBV-C/HGV RNA的逆转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)方法.但是,该检测方法的灵敏度存在着较大差异.本实验使用A~E共5套PCR引物,基中A、B、D为自行设计的HGV 5′端非编码区引物,目的产物长度分别为368bp, 158bp及220bp;C引物为参照文献设计的核心区引物,目的产物为302bp;E引物为李倬副研究员设计的NS3区引物,目的产物长度为591bp.采用改良的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取HGV RNA,套式逆转录聚合酶链反应(RT-nPCR).
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献血者TT病毒DNA及其IgG抗体的检测
目的观察献血者输血传播病毒(TTV)的感染情况.方法应用Nested-PCR对388例献血者、168例非肝炎住院患者进行TTV DNA检测,同时用ELISA法检测抗TTV IgG.结果 TTV基因检出率分别为献血组15.46%,对照组24.40%;556例受检血清中TTV DNA总的阳性检出率为18.17%,抗TTV IgG检出率分别为献血组13.14%,对照组27.98%;献血组与对照组相比TTV DNA及抗TTV IgG均存在显著性差异(P<0.05).结论献血者存在TTV感染,TTV存在健康携带状态.
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儿童肺炎链球菌分离株pbp2B基因突变分析
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)是引起儿童呼吸道感染的常见病原菌.近年我国多中心研究发现,无论是儿童还是成人所分离到的青霉素耐药SP(penicillin resistant streptococcus pneumoniae,PRSP)已占SP分离总数的10.0%~50.0%,并呈上升趋势[1,2].PRSP主要为青霉素结合蛋白(penicillin-binding proteins,PBPs)编码基因突变所致[3、4].为了解我国耐青霉素SP菌PBPs基因的突变状况,我们对2002年9月至2003年4月28株分离自苏州地区患儿呼吸道的SP菌之PBP2B亚单位编码基因pbp2B进行了套式聚合酶链反应(nested polymerase chain reaction, nPCR)扩增及其产物的全自动DNA序列测定.
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套式聚合酶链反应快速诊断结核性心包炎
快速诊断结核性心包炎以便及早抗痨治疗防止缩窄性心包炎的发生.应用套式聚合酶链反应(Nested-PCR)、直接涂片、培养对83例心包积液标本进行结核菌检测.结果:结核性心包积液Nested-PCR阳性率为72.5%、培养阳性率为19.6%、涂片镜检阳性率为23.5%.非结核性心包积液无1例阳性.Nested-PCR特异性好、敏感性强并可能避免一般聚合酶链反应(PCR)所出现的假阳性.
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支气管哮喘患者肺炎支原体感染发病情况的观察
目前认为支气管哮喘(简称哮喘)无论是急性发作或缓解期都存在气道炎症和气道反应性增高.其发病机制尚未完全明了.我们用微量免疫荧光(MIF)试验和套式聚合酶链反应(nPCR)分别检测血清和痰中肺炎支原体DNA,以探讨肺炎支原体感染与支气管哮喘发病是否相关联.
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应用套式PCR技术对胆色素结石成因的研究
本研究从胆汁细菌培养阴性的胆色素结石中提取细菌DNA,应用套式聚合酶链反应(nested primer polymerase chain reaction,NP-PCR)技术进行检测[1],探讨细菌感染与胆色素结石形成之间的关系.
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1 240例女性生殖道支原体感染分析
目的为了解生殖道支原体在晚期孕妇、育龄妇女、念珠菌性阴道炎和淋球菌性阴道炎患者中的感染状况. 方法采用套式聚合酶链反应技术,对962例晚期孕妇、85例育龄妇女、90例念珠菌性阴道炎和103 例淋球菌性阴道炎患者的宫颈拭子标本进行了生殖道支原体检测. 结果在晚期孕妇、育龄妇女、念珠菌性阴道炎和淋球菌性阴道炎患者中生殖道支原体的检出率分别为4.16%、3.52%、11.11%和13.59%. 结论生殖道支原体在晚期孕妇、育龄妇女、念珠菌性阴道炎和淋球菌性阴道炎妇女中均有一定的检出率.
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HAART治疗前后HIV-1细胞嗜性分析
目的 分析7例患者在高效抗逆转录病毒治疗(HAART)前和治疗后,艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)细胞嗜性的改变及影响因素. 方法 采用BD公司的流式细胞仪,通过绝对计数法测定CD+4 T淋巴细胞计数和CD+8 T淋巴细胞计数,荧光标记物为BD TriTEST CD3FITC/CD4PE/CD45PerCP.采用核酸序列扩增实验(NASBA)测定病毒载量(生物梅里埃公司提供仪器和试剂).套式聚合酶链反应(Nested-PCR)对gp120V3环区基因进行扩增、测序分析,并确定HIV-1细胞嗜性. 结果 在7例患者中,有3例发生细胞嗜性转换,2例是从R5到X4嗜性的转换,1例是X4到R5嗜性的转换.在7例患者中,病毒细胞嗜性转换与患者病毒载量、CD+4、CD+8 T淋巴细胞之间无相关性. 结论 HIV-1细胞嗜性的转换与疾病进展的关系不确定;HAART治疗对嗜性转换的作用还不明确.
关键词: 高效抗逆转录病毒治疗 套式聚合酶链反应 艾滋病病毒Ⅰ型 细胞嗜性 -
滤纸片干血斑HIV-1 DNA检测方法的建立
目的 探索用滤纸片作血液样本的载体,建立一种简单、经济、敏感的滤纸片干血斑艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)DNA检测方法.解决HIV-1感染者全血样本采集、运输和储存过程中存在的实际困难.方法 首先用滤纸片FTA卡收集血液制成滤纸片干血斑,处理提取DNA后,针对HIV的env、gag、pol区,设计三对高度保守引物,套式PCR扩增HIV-1 DNA.进一步用HIV-1质粒DNA检测该方法的低检测限.结果 摸索出扩增滤纸片干血斑HIV-1 DNA的佳扩增条件;滤纸片干血斑样本pol区低检测限是6拷贝/μl,env区8拷贝/μl,gag区10拷贝/μl.结论 可以用滤纸片FTA卡收集HIV-1感染者的血液,制成滤纸片干血斑后检测HIV-1 DNA.该方法操作简便、经济、敏感,建议作为HIV-1抗体检测的辅助诊断方法.
关键词: 滤纸片干血斑 艾滋病病毒Ⅰ型DNA 套式聚合酶链反应