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STD者病灶部肺炎支原体分子检测与培养分离
目的:确认我国STD者病灶部是否存在肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mpn.方法:应用套式PCR和DNA测序等分子检测技术对尿道拭子/阴道拭子标本进行检测,并对部分Mpn套式PCR阳性病例进行了Mpn培养.结果:786例STD者的尿道拭子/阴道拭子标本经Mpn套式PCR检测共有74例呈阳性结果,阳性率为9.4%.其中484名男性阳性率为10.5%,302名女性阳性率为7.6%,两者无明显差异(P＞0.05);男女性STD各病种均有Mpn阳性者.12例Mpn套式PCR阳性者拭子标本经Mpn培养4例初代培养呈阳性.其中1例成功传代.本文对1例拭子标本和1例Mpn培养分离之传代标本的Mpn套式PCR产物进行了DNA测序,测得序列与Mpn典型株一致.结论:我国男女性STD者的病灶部存在Mpn.
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全自动测序仪PCR产物测序影响因素研究
目的 对影响ABI3500xl全自动测序仪测序过程的因素进行研究,以提高测序的准确度和成功率并降低成本.方法 对PCR反应体系、产物纯化方法进行优化.将BigDye分别稀释8、16和32倍进行测序PCR反应,比较不同的BigDye稀释倍数对PCR产物测序结果的影响;使用CENTRI-SEP柱纯化法、BigDye CleaningBeads磁珠法和乙醇乙酸钠EDTA法对测序PCR产物进行纯化,比较不同纯化方法对测序结果的影响.结果 BigDye稀释8倍和16倍时,PCR反应体系的测序结果正常,而稀释32倍时测序结果出现碱基误读;3种不同的测序PCR产物纯化方法均可得到满意的测序结果.相比之下,CENTRI-SEP Kit纯化方法所需时间短(0.5 h),但是成本较高;乙醇乙酸钠EDTA纯化方法成本低,但耗时较长(2 h);磁珠纯化法所需时间(1 h)和成本介于CENTRI-SEP Kit法和乙醇乙酸钠EDTA法之间,但不适于高通量操作.结论 ABI3500xl全自动测序仪测序过程中,BigDye稀释16倍时所得测序结果准确且成本较低;3种测序PCR产物纯化方法均可得到准确的测序结果,实际工作中应根据操作者具备的实验条件选择适纯化方法,以减少测序时间和成本.
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套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测
目的应用套式PCR-DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法,并评价其临床应用价值.方法采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况.同份痰标本同时做涂片抗酸染色,罗氏培养及菌型鉴定.结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性,产物DNA测序31例有rpoB基因突变,其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变,耐药突变率90.6%(29/32),39例菌阴(涂阴培阴)痰中有2例发生突变.分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变,20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性,特异性100%.结论套式PCR-DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法.
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山西地区HBV DNA定量、分型及P区耐药突变点245例分析
目的:了解山西地区乙型肝炎病毒基因型分布、探究基因型和HBV DNA定量及P区耐药突变点相关性.方法:采用荧光定量PCR、聚合酶链反应-酶联免疫吸附试验(PCR-ELISA)和DNA测序技术分别对患者HBV DNA含量、HBV基因型和HBVP区耐药突变点进行了检测.结果:245例患者中B型45例(18.4%),C型187例(76.3%),BC混合型13例(5.3%);C型的血清中JHBV-DNA平均含量2.7×106 IU/mL,B型的血清牛IHBV-DNA平均含量为6.4×104 IU/mL,二者达到了显著性差异;其中对60例HBV-DNA水平在104 IU/mL患者血清进行DNA测序检测结果发现,其中34例患者中没有出现耐药,在26例耐药患者中以拉米夫定+恩替卡韦+替比夫定交叉耐药比例高,突变点主要为rtL180M、rtA181T和rtM204I/N.结论:山西地区HBV基因型以C型为主,B型次之,C型HBV DNA含量显著高于B型,且耐药的产生主要以拉米夫定+恩替卡韦+替比夫定交叉耐药为主.
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小秦艽rRNA基因内转录间隔区测序鉴定的初步研究
目的:对小秦艽种籽中提取的DNA中rRNA基因内转录间隔区进行碱基序列测定,以期从分子水平建立对秦艽种籽的鉴定标准.方法:常规提取小秦艽种籽DNA,利用合成的特异性引物对其DNA中rRNA基因内转录间隔区进行套式PCR扩增,将扩增产物以四色荧光标记的双脱氧末端终止循环法进行碱基序列测定.结果:经琼脂糖凝胶电泳证实 rRNA基因内转录间隔区 PCR 扩增产物存在,测序后得到了小秦艽种籽 rRNA基因内转录间隔区的碱基序列.结论:rRNA 基因内转录间隔区的碱基序列可作为分子水平鉴定植物性中药材的又一途径.
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塞隆骨原动物高原鼢鼠核基因18S rRNA序列测定与分析
目的：测定仓鼠科动物高原鼢鼠Myospalax b aileyi的核rDNA基因序列，为塞隆骨正品基原检定提供分子依据。方法：采用PCR直接测序技术测定高原鼢鼠18S rRNA基因核苷酸序列并作序列特征分析。[ HT5”H〗结果：高原鼢鼠的18S rRNA序列长度为1 851 bp。根据排序比较，高原鼢鼠与2种鼠科动物间的DNA序列同源性 为72.04%～72.18%。结论：通过基因序列分析，DNA测序技术可成为 塞隆骨正品基原检定的准确有效手段。
关键词： 塞隆骨 高原鼢鼠 18S rRNA基因 DNA测序 -
小鼠蛋白激酶CK2β亚基的克隆、表达及活性测定
通过反转录PCR从NIH 3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶CK2β亚基编码区cDNA;构建其表达质粒并经测序证明其编码小鼠蛋白激酶CK2β亚基,但与两种已报道的小鼠CK2β亚基cDNA编码区序列分别存在一个碱基差异,与大鼠、猪、兔和人CK2β亚基cDNA的编码区相应碱基序列则一致.将其在表达菌BL21(DE3)中诱导表达,出现一26kDa分子量蛋白过度表达,表达蛋白占菌体总蛋白的31.7%,但大多数以不溶形式存在.Western blot鉴定表明:过度表达产物能与抗人CK2β亚基抗体发生特异性免疫反应.当CK2 α和β亚基以1:1摩尔比混合时,构成性的CK2全酶显示出大活性,直接表明CK2β亚基对CK2α有激活作用.这些结果有力地证明了克隆表达的重组蛋白是小鼠蛋白激酶CK2β亚基.
关键词： β调节亚基/蛋白激酶CK2/小鼠 分子克隆 DNA测序 表达 免疫印迹 -
维吾尔族和汉族散发性乳腺癌患者BRCA1／2基因突变的检测
目的：探讨新疆维吾尔族和汉族散发性乳腺癌患者乳腺癌易感基因1／2（ BRCA1／2）突变情况及与临床病理参数的关系。方法采用PCR和DNA直接测序法，对新疆地区230例散发性乳腺癌患者（维吾尔族、汉族各115例）石蜡组织进行BRCA1基因第2、11（11A和11B）、20号外显子和BRCA2基因第11号部分外显子，共5对引物进行突变检测。结果230例乳腺癌患者中，BRCA基因突变率为6.96％（16／230），其中1例BRCA1基因－5382位点的突变及7例新发突变位点；维吾尔族和汉族患者中BRCA基因突变检出率分别为7.83％（9／115）和6.09％（7／115）；BRCA基因突变组发病年龄均≤50岁；突变组16例患者中绝经前患者（13例）的突变率明显高于绝经后患者（3例）（P＜0.05）。结论 BRCA1基因突变可能与新疆地区散发性乳腺癌发生相关。
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乙肝免疫球蛋白抗体的多样性
目的 基于重链可变区的编码基因序列对乙肝免疫球蛋白(HBIG)中的IgG抗体进行分类.方法 借用文献提供的引物,以HBsAb强阳性健康个体外周血中的总RNA为模板进行RT-PCR和Nested-PCR扩增,通过将产物克隆到T载体、随机挑选测序,分析并统计出插入子的VH-D-JH-Cγ组合方式.结果 共获得56个有效克隆,全部为人VH3-D-JH-Cγ序列,可分成49种序列,其中5种序列有2或3个序列完全相同的克隆.4个Cγ功能基因也全部出现,其中IGHG2频率高(28次);23个VH3功能基因有11个出现,其中频率高的是IGHV3-23(29次);23个D功能基因有16个出现,其中频率高的是IGHD1-26(8次);6个JH功能基因则全部出现,其中频率高的是IGHJ4(33次).VH3-D-JH组合有33种,频率高的是IGHV3-23/IGHD1-26/IGHJ4(8次),其中5种与IGHG2拼接,但这5种VH3-D-JH-Cγ2序列仍有明显的差异.结论 成功地从HBsAb强阳性健康个体外周血中克隆到由VH3亚家族参与重排的IgG重链可变区序列;初步证实可变区序列不仅在VH3-D-JH-Cγ组合方式上具有极大的多样性,而且在序列上也具有明显的差异性;基于可变区测序对IgG抗体或B细胞进行分类是可行的,但需大大提高挑取克隆的数量或改用新一代大规模测序技术.
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精氨酸加压素基因多态性在广西人群中的分布
目的 探讨精氨酸加压素(AVP)基因单核苷酸多态性(SNP)位点rs2282018、rs3787482和rs1887854在303例广西人群中的分布,并对比不同族群间AVP基因型及等位基因频率分布的差别.方法 采用单碱基延伸的聚合酶链反应(PCR)技术和DNA测序法,检测303例广西人AVP基因多态性,分析广西人群3个位点的基因型和等位基因的分布频率,并与人类基因组计划(HapMap)公布的欧洲人、中国北京汉族人、日本人和非洲人的基因多态性分型数据比较,分析这5个人群人类的基因型及等位基因的分布频率.结果 我国广西人群AVP基因rs2282018、rs3787482及rs1887854位点各自具有3种基因型,基因型和等位基因分布与性别无关.与人类基因组计划(HapMap)公布的欧洲人、非洲人、日本人和中国北京人的单核苷酸多态性分型数据进行比较,广西人群AVP基因不同多态性位点的基因型和等位基因频率在不同地区人群的分布存在差异.结论 广西地区人群中存在AVP基因多态性.广西人群AVP基因多态性的分布频率与其他不同地区种族人群比较存在差异.
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分子病理学技术在遗传性皮肤病诊断中的应用及前景
遗传性皮肤病是皮肤病临床诊断、治疗中的难点.据不完全统计,目前遗传性皮肤病有300多种,其中大多数发病机制不明确.分子病理学是分子生物学与传统病理学的交叉学科,运用分子病理学技术可以较好地阐释遗传性皮肤病基因变异与临床表现的关系,对遗传性皮肤病的诊断与治疗具有重要意义.随着新一代测序技术及其他技术的发展,分子病理学技术已经被临床作为遗传性皮肤病诊断的重要工具.
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DNA测序鉴定HLA新等位基因B*35:03:07
本研究旨在分析鉴定中国人群HLA-B位点一个新等位基因.应用PCR-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)技术检测到一个与HLA-B* 35:03:01相关的未知基因,应用DNA序列分析技术鉴定并分析该基因与同源性高的HLA等位基因的序列差异.结果表明,先证者HLA -B位点有1个等位基因的核苷酸序列与所有已知基因序列均不相同,与同源性高的HLA-B* 35:03:01相比,第3外显子387位碱基由C→G,并导致相应的105位密码子编码的氨基酸由CCC变为CCG,编码的氨基酸没有改变,仍为苯丙氨酸.结论:被测样本含有HLA-B新等位基因,WHO HLA因子命名委员会将其正式命名为HLA-B* 35:03:07.
关键词： DNA测序 新等位基因 HLA-B*35:03:07 -
罕见B(A)血型的检测及其安全输血探讨
本研究探讨稀有B(A)血型的遗传特性、鉴定方法和输血策略.采用血型血清学方法、PCR-SSP方法基因定型和ABO血型第6、7外显子直接测序的方法进行B(A)血型鉴定,并分析该家系的血型遗传特点和分子机制；同时对B(A)型献血者和用血者进行配合性试验和临床输血研究.结果表明,该家系调查发现3例血清学结果正反定型结果不符,均为血清学结果为正定型AB型,反定型B型,ABO基因型为B(A)04/O01型,1袋B(A)型红细胞输注给1例B型患者后临床有轻度的输血反应,B(A)型患者输注O型洗涤红细胞后患者未出现输血反应.结论:对ABO血型血清学正反定型不符的标本,可以用家系调查和分子生物学方法进行辅助验证,B(A)型血液不能给B型或AB型患者输注,B(A)血型患者输血时应采取配合性成分输血或自身输血.
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温州籍轻型β珠蛋白合成障碍性贫血患者的基因多态性
本研究旨在对14例临床诊断的温州籍轻型β珠蛋白合成障碍性贫血患者的血液学及分子生物学进行分析,测定其PCR产物序列,找出引起该病的致病突变位点并进行单核苷酸多态性分析.对临床诊断的患者抽取静脉血,EDTA-K2抗凝,及时提取模板,设计相关引物,进行PCR扩增后测序,后经过序列比对和分析,找出引起β珠蛋白合成障碍性贫血的致病突变位点.结果表明:14例标本的DNA扩增产物测序分析中发现4例在IVS-2-654位点发生了C→T的杂合突变;1例为CD41/42位-TTCT缺失;2个位点存在单核苷酸多态性,分别是外显子1第59位的T/C多态性、IVS-2 nt 665,T/C多态性.结论:温州籍轻型β珠蛋白合成障碍性贫血患者单核苷酸多态性具有一定的特殊性;发现了两种基因突变类型,分别为IVS-2-654 C→T的杂合突变和CD41/42位-ITCT缺失.
关键词： β-殊蛋白合成障碍性贫血 β-珠蛋白基因 基因突变 单核苷酸多态性 DNA测序 -
三阴性乳腺癌33例患者BRCA1/2基因突变状态及临床病理学特征
目的 探讨三阴性乳腺癌(TNBC)患者BRCA1/2基因突变情况及其与临床病理参数的关系.方法 收集新疆维吾尔自治区33例TNBC患者(维吾尔族21例、汉族12例)的石蜡组织,采用逆转录聚合酶链反应和DNA直接测序法对BRCA1基因第2、11、20号外显子和BRCA2基因第11号部分外显子进行突变检测.结果 33例TNBC患者中,5例患者检测出BRACA1基因突变,突变率为15.2％ (5/33),其中第11号外显子突变4例(4/5),第20号外显子突变1例(1/5),BRCA1基因第2号外显子和BRCA2基因第11号部分外显子均未检测出突变.5例BRCA1基因突变患者发病年龄均≤50岁.汉族、维吾尔族TNBC患者BRCA1基因突变比例分别为2/12和3/21,差异无统计学意义(P =0.854).BRCA基因突变4例临床分期为Ⅰ～Ⅱ期,仅有1例为临床Ⅲ期;4例患者有淋巴结转移,1例患者没有发生淋巴结转移;4例患者原发肿瘤直径＜5 cm,1例患者原发肿瘤直径≥5 cm;4例患者生育次数≤2次,1例患者生育次数＞2次;1例患者确诊时已闭经,4例患者没有闭经;2例患者初潮年龄≤12岁,3例患者初潮年龄＞12岁.结论 BRCA1基因突变率比BRCA2更高,BRCA1可能参与了TNBC的发生和发展,新疆地区BRCA1基因突变TNBC患者与未突变者相比在临床病理特征方面存在差异.
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耐药肺炎克雷伯菌中发现碳青霉烯酶KPC基因新的变异型
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kpn)是医院感染的重要致病菌.我们从医院分离到一组(15株)耐药肺炎克雷伯菌(均分离自2010年3月-2010年5月浙江大学附属第一医院住院患者临床样本).来源为:痰液6份,中段尿3份,血液和引流液各2份,脑脊髓液和咽拭子各1份.进行了A类、B类、C类、D类等4类41种B-内酰胺酶基因(阳性株全部作DNA测序并比对)与β-内酰胺酶活性检测,结果发现了肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase,KPC)基因新的变异型,现报告如下.
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利用噬菌体随机肽库筛选抗呼吸道合胞病毒多肽的实验研究
目的采用完整的呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)颗粒筛选噬菌体肽库,以获得能高亲和力结合并能抑制该病毒复制的特异性多肽.方法Hep-2细胞培养RSV,采用蔗糖密度梯度(30%、45%、60%)和超滤离心纯化病毒.病毒用生物素标记后,应用M13噬菌体PⅢ呈现随机7肽库进行筛选.经过3轮淘筛后,ELISA进一步鉴定噬菌体克隆与RSV的亲和力,通过TCID5o检测其抗病毒复制能力.选取与RSV具有高亲和力的阳性克隆进行DNA测序,据此推导多肽的氨基酸序列.结果经鉴定得到13个阳性噬菌体克隆能与RSV呈高亲和力结合,其中3个克隆体外能明显抑制RSV的复制,使TCID5o由10-8.1SFU/m1分别降至10-4.1、10-4.3、10-3.8SFU/ml.DNA测序发现各个克隆之间缺乏明显的同源序列,但普遍含有较多的脯氨酸.结论通过噬菌体肽库能够筛选到抗病毒作用的阳性克隆,为进一步开发高效RSV的诊断和治疗试剂奠定基础.
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1例3型“青少年发病的成年型糖尿病”的基因突变分析
目的 对一例青少年发病的成年型糖尿病(MODY)患者进行基因分型.方法 运用Sanger测序技术对一例14岁的青少年的成人发病型糖尿病女性患者进行常见MODY基因肝细胞核因子1α(HNF1A)、肝细胞核因子4α(HNF4A)及葡萄糖激酶(GCK)基因直接测序,采用MutationSurveyor软件对测序结果进行分析.结果 DNA测序发现HNF1A基因的1号外显子区域发现一个杂合的错义突变,c.293C＞T(p.A98V).这一突变会导致C肽及胰岛素水平的降低从而引发高血糖症状的发生.结论 借助于DNA测序技术,该患者终被诊断为HNF1A基因变异导致的MODY3.
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介绍沙门菌的新命名系统
DNA分子生物学技术,特别是各种实时PCR技术、现代DNA测序的发展和应用,豁然明白了沙门菌属(Salmonella)的各个种、亚种、型的精确关系,例如过去认为是种的伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、副伤寒A和B沙门氏菌、肠炎沙门菌在保守区某片段处只有几个核苷酸差别,即它们不是种、也不是亚种的关系,而属于型的差异 [1].故需要更改沙门菌属的分类和命名.
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玉树地震受伤患者伤口感染梭状芽胞杆菌培养鉴定分析
目的:了解玉树地震受伤患者伤口感染梭状芽胞杆菌情况,为临床诊治及突发公共卫生灾害细菌的感染救治提供参考依据.方法:3例伤口感染的地震受伤患者入院时立即采集伤口分泌物进行细菌厌氧和需氧培养,并采用ATB自动微生物分析仪进行细菌鉴定;鉴定出的梭状芽胞杆菌菌株经PCR扩增细菌16S rRNA基因,DNA测序分析,进一步确定细菌种类.结果:3份标本经自动微生物分析仪鉴定出1株产气荚膜梭菌,4株疑似梭状芽胞杆菌;PCR扩增显示5株菌均出现目的 大小条带;测序证实5株菌有1株为产气荚膜梭菌,另4株为需氧芽胞杆菌属细菌.结论:自动微生物分析仪鉴定和细菌16S rRNA基因测序分析联合应用可快速、准确为临床提供诊治和预防控制信息.
关键词： 伤口 梭状芽胞杆菌 16S rRNA基因 DNA测序
