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高甘油三酯血症患者脂蛋白脂肪酶基因检测意义
目的 探讨脂蛋白脂肪酶( lipoprotein lipase,LPL)基因突变与高甘油三酯血症的相关性.方法 采用Primer 5.0软件针对LPL基因分片段设计特异性引物.高甘油三脂血症患者12例,抽取外周静脉血提取基因组DNA,扩增LPL基因1～9号外显子及相邻部分内含子,进行核苷酸测序,并与LPL基因全序列进行比对分析.结果 12例患者中1例LPL基因第4外显子存在错义杂合突变；1例LPL基因第8外显子存在同义杂合突变；8例LPL基因第6内含子5'端的几个位点处发生相同的碱基置换(1388+73T＞G,1388+ 108G＞A,1388+82C＞A)；2例患者未检出核苷酸变化.结论 LPL基因缺陷与高甘油三脂血症密切相关,LPL基因检测可用于临床上有遗传倾向的严重高甘油三脂血症患者的基因诊断.
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普通成年人群隐匿性乙型肝炎病毒感染情况分析
目的:调查普通成年人群隐匿性HBV感染率.方法:收集普通成年人血清1440份,ELISA检测HBV血清学标志物,分别设计HBV DNA不同区域的引物,用巢式PCR检测HBV DNA,对阳性标本进行DNA序列分析,并确定HBV基因型.结果:1440份血清中,HBsAg阳性70例(4.86%);HBsAg阴性的1370份血清中,3例(0.21%)至少2组不同特异性引物巢式PCR显示HBV DNA阳性.其DNA序列与基因库中已知HBV序列同源,证实了PCR产物的特异性,而各HBV DNA序列又不完全相同,排除了因污染造成的假阳性.3例隐匿性HBV感染中2例为基因型B型,另1例为C型.结论:普通成年人群存在隐匿性HBV感染.输血和器官移植时,仅以血清学标志物作为筛查HBV的手段,可能会引起HBV的传播.
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50例HBV基因分型及P区耐药突变分析
目的:调杳温州乙型肝炎患者血清HBV基因分型和P区基因逆转录酶区(RT区)序列的突变情况.方法:选取50例接受核苷类似物治疗后的乙型肝炎患者作为研究对象,采用PCR产物直接测序法,并对扩增产物进行测序,将测序结果与GenBank中的标准序列进行比对分析,同时确定基因型.结果:在50例中C型44例,占88％,B型6例,占12％.存在位点突变者25例(50％).其中检出以单位点rtM204I/V/S突变为主,9例,占36％,rtA181V/T突变4例,占16％,rtM204L/V/S+ rtL180M突变5例,占20％,rtV214A,rtA181V/T+ rtV173L,rtM204I/V/S+ rtQ215H,rtM204I/V/S+ rtL180M+ rtV173L,rtM204I/V/S+ rtL180M+rtV207I,rtM204I/V/S+ rtL180M+ rtT184A/G/I/S,rtM204L/V/S+ rtL180M+ rtT184A/G/I/S+ rtA181V/T突变各占1例,占4％.结论:多数乙型肝炎患者在HBV P区可检出突变,突变形式多样,其中以rtM204I/V/S突变为主,应用DNA序列测定法分析HBV P区基因突变,获得的信息全面,对临床评估病情进展和实施抗病毒治疗有参考价值.
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视网膜色素变性光感受器发育相关基因分型的研究
目的探讨一新近发现的与氧调节光感受器发育相关基因(ORP1)在常染色体显性遗传(RP)发病机制中的作用.方法运用聚合酶链反应(PCR)、构象敏感凝胶电泳(CSGE)和DNA直接测序方法对92例RP患者ORP1基因全编码区进行突变的筛选与检测.结果检出一ORP1致病突变因子R677X,并首次发现一非致病的无义突变因子R1933X.结论预测香港地区大约有1.1%(95%的可信区间为5.4%以下)的RP是由ORP1基因突变所致.R1 933X无致病意义,结合近发现的Y1053(1-bp del)的病理意义,推测密码子1 052至1 933区域的稳定对ORP1结构及功能的维持起着重要的作用.
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河南分离株阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因序列分析
目的:对河南分离株阴道毛滴虫铁氧还蛋白(Fd)基因突变进行检测分析.方法:采用改良法提取阴道毛滴虫全基因组DNA,应用特异性引物对Fd基因进行扩增,随机选取河南省内5个地区来源的10个虫株的Fd基因扩增片段直接进行双向测序,应用Chromas和Clustalx软件对测序结果进行分析,将测序所得Fd基因核苷酸序列与GenBank中的Fd基因(M33717)进行比对,对所得Fd基因的同源性进行分析.结果:河南省内5个地区来源的Fd基因的核苷酸序列无差异,与Fd基因(M33717)对比,在第200位发生碱基插入,插入碱基为ctg,与Fd基因M33717的同源性为99%.结论:经NIH GenBank基因命名委员会认定,本研究中Fd基因为新型基因,收录编号为EU652852.
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HLA新等位基因A*110202的发现
目的:用DNA测序的方法确定HLA新等位基因.方法:用SSO流式荧光微珠技术(LABMAS)进行常规HLA-A、B、DRB1中低分辨检测,用DNA 测序的方法鉴定HLA*A新等位基因.结果:应用3种常规的HLA检测试剂检测该标本,均无法得到确切的A位点的结果,合成特异性引物对A位点2、3外显子进行扩增测序,发现在HLA*A 的2外显子区域出现295 C＞A,该改变不引起氨基酸变化,无新的抗原产生.结论:该新的基因经WHO HLA因子命名委员会(IMGT)注册确认为A*110202,注册号为HWS 10003507-DQ354441.
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ABI PRISMTM 3100型遗传分析仪佳反应体系探讨
目的 探讨ABI PRISMTM 3100型遗传分析仪的佳反应体系,使DNA序列测定高效且经济.方法 运用含有重组质粒的饱和大肠杆菌E. coli菌液,采取碱裂解法提取质粒.依据测序原理,分别通过调整模板量、BigDye Mix的用量和反应体系的体积来确定ABI PRISMTM 3100型遗传分析仪的佳反应条件.结果 针对该样本,测定DNA序列的佳反应体系为:模板量100 ng,BigDye Mix 2 μL,引物1.6 pmol,双重蒸馏水补足总体积为10 μL.结论 该反应体系保证了ABI PRISMTM 3100型遗传分析仪的测序质量,且大大节约了成本.
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HLA组特异性PCR及DNA测序确认新基因HLA-A*110202
目的:用HLA组特异性PCR扩增,DNA测序方法确认新等位基因.方法:用SSO(序列特异性寡核苷酸探针)反向流式荧光微珠法对标本62011550进行常规HL-A、B、DRB1分型检测,A位点反应格局清晰而无法给出确切分型结果,对该基因扩增2、3外显子,以此为模板采用组特异性引物区分杂合子,分别对杂合子2、3外显子测序,将测序结果与已知的基因序列进行比较.结果:测序得到A*1102v(1102的变异体)序列与已知序列比对发现,在第2对外显子215出现C＞A,导致第75密码子GGA＞AGA,未引起氨基酸改变(R＞R),该序列为新的HLA序列,经向WHO HLA因子命名委员会申报确定为HLA-A 110202,注册号HWS.10003507-DQ3544411(www.ebi.ac.uk/imgt/hla)结论:DNA测序是HLA分型的直接准确方法,常用于新基因的发现,用组特异性引物区分杂合子进而进行测序简便易行,避免了基因克隆操作.
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线粒体DNA序列分析鉴定4种蛇粗毒
目的 利用PCR技术鉴定干燥蛇粗毒的来源.方法 从4种蛇粗毒中提取总DNA--其中包括1份已保存了7年的干燥眼镜蛇粗毒,并分别以从蛇粗毒和肌肉组织中提取的总DNA作为模板用1对线粒体16S rRNA基因引物进行扩增.结果 测序结果提交NCBI,并与GenBank中的同源序列进行比对.结论 序列比对和系统发育分析的结果证实,该扩增的即为正确的蛇粗毒来源物种的线粒体16S rRNA基因序列,该技术有可能推广用于对动物粗毒的来源进行准确和直接地鉴定.
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1份生产用中药蛇粗毒的DNA分子鉴定
目的 利用PCR技术鉴定干燥蛇粗毒的来源物种,并对基因组DNA的提取效果及提取过程中需注意的若干问题进行分析和讨论,同时还对若干针对不同长度目的 基因扩增引物的使用效果进行验证.方法 从1份已保存了7年的生产用干燥蛇粗毒中提取总DNA,并以之为模板进行PCR扩增、测序和序列分析.结果 使用该方法可从蛇粗毒中提取得到微量的总DNA,并成功扩增得到0.45～1.18 kb不同长度范围的目的 片段;测序结果提交NCBI,并与CenBank中的同源序列进行BLAST比对.结论 该蛇粗毒样品来自眼镜蛇,且极可能由多个不同的亚种或单倍型所组成.该技术有可能推广用于对动物粗毒的来源进行准确和直接地鉴定.
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人胎儿骨膜全长cDNA文库的构建及测序
目的 构建人胎儿的骨膜组织的全长cDNA文库,了解该组织表达谱的特征.方法 以胎儿胫骨骨膜为材料,运用末端模板转换技术(SMART)构建cDNA文库,测定库容量并应用菌落PCR的方法确定平均插入片段长度,随后大规模测序并进行生物信息学处理分析.结果 所构建的cDNA文库的库容量为5.2×106,平均插入片段的长度为1.2 kb.随机测序了25 000余个克隆的序列,拼接后为5 230个聚类群(contigs)和4 714个独立EST(singleton),Blast比对分析得到骨膜基因表达谱的概况,发现了23个候选的新基因.结论 构建的骨膜组织的cDNA文库质量满足后续工作的需要,骨膜组织基因表达谱及一些新基因的获得为今后寻找骨膜组织特异性的基因从而研究骨相关疾病的发病机制、发现具有药物开发靶点的功能基因奠定了基础.
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肾母细胞瘤中RB基因突变的研究
目的: 调查肾母细胞瘤中RB基因突变, 探讨RB基因突变与肾母细胞瘤发生的关系. 方法: 采用多重PCR-SSCP法结合DNA测序对肾母细胞瘤的手术标本进行RB基因全部外显子的突变筛查. 结果: 25例肾母细胞瘤中5例显示有缺失, 4例检出SSCP电泳迁移率的改变, 2例经测序证实为单碱基置换. 其中1例(W28)为第756个密码子的第2个碱基发生A→C的颠换, 另1例(W31)为第26内含子距5′端28个碱基处发生T→C的转换.结论: RB基因突变涉及肾母细胞瘤的发生, 提示肾母细胞瘤的发生为多次遗传改变积累的结果.
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分子诊断在性别发育异常诊断中的应用
目的 性发育异常是一组多基因介导的遗传性疾病,其遗传学病因异常复杂,但临床表型的多样化,导致临床实践中诊断比较困难.近年来,基因测序技术广泛应用于多种先天性疾病的诊断领域,本研究利用基因测序和基因芯片技术对临床诊断为性发育异常患儿进行基因检测,初步探讨性发育异常的分子病因,探索分子诊断技术用于性发育异常诊断的可能性.方法 22例患儿临床诊断为性发育异常,取全血2 ml并获取DNA.其中5例采用基因芯片技术检测已知的性发育异常相关基因,另17例采用全外显子测序技术检测可能的基因变化.检测结果再采用一代的Sanger测序进行验证.对于阳性发现患儿,取其父、母全血各2 ml,采用Sanger测序探究基因变化来源.结果 5例基因芯片检测患儿中,1例卵睾型性发育异常存在17号染色体中SOX9基因重复(Chr17:70,117,161-70,122,560).其余行全外显子测序17例患儿中5例发现阳性基因变化.这5例致病性基因变化分别为:1例肾上腺发育不良存在DAX1基因错义突变(c.871T＞G,p.W291G),1例肾上腺皮质增生为CYP21A2基因中2个致病性无义突变(c.292+ 1G＞A,c.293-13 A/C＞G),1例Charge综合征为CDH7基因移码突变(c.2916_2917delGT;p.Gln972HisfsX22),2例雄激素不敏感综合征患儿分别存在AR基因错义突变(c.2612C＞T;p.Ala871Val) AR基因错义突变(c.528C＞A;p.Ser176Arg).结论 二代测序技术及基因芯片发现可导致性发育异常的基因突变,可帮助明确病因,提高了诊断精准度.分子诊断技术在性发育异常诊断中的作用已初步显现.
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大鼠输卵管特殊糖蛋白基因片段的扩增、克隆与序列分析
目的:大鼠输卵管特殊糖蛋白核苷酸序列的扩增、克隆及序列分析.方法:在Genebank中查找到已知的小鼠、金仓鼠、猪和人的输卵管特殊糖蛋白的基因序列并运用Primer Premier 5.0软件对这些输卵管特殊糖蛋白的基因序列进行同源性分析.依据同源性较大的保守区基因序列设计一对引物,并提取大鼠输卵管总RNA作为模板进行RT-PCR,得到一条cDNA片段.将产物连接到T载体中,转化、扩增重组质粒.提取大肠杆菌中的重组质粒进行DNA测序.将DNA测序所得到的基因序列和已知的小鼠、金仓鼠、牛、羊及人的输卵管特殊糖蛋白的基因序列进行同源性分析.结果:利用RT-PCR的方法扩增出一条120 bp的目的基因片段,测序结果发现其和小鼠、金仓鼠、牛、羊和人的输卵管特殊糖蛋白的核苷酸序列的同源性分别为90%,90%,78%,87%.结论:本实验所获得的基因序列为目前尚未见报道的大鼠输卵管糖蛋白的基因序列的一部分.
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结核分枝杆菌喹诺酮类药物耐药与基因突变关系的研究
目的:探讨喹诺酮类药物的耐药性与结核分枝杆菌gyrA基因突变的关系.方法:采用比例法检测结核分枝杆菌中氧氟沙星耐药的菌株,并对氧氟沙星耐药菌株的gyrA基因的耐药决定区域进行序列测定.结果:175株结核分枝杆菌中,耐氧氟沙星菌株为30.9%(54/175),其中81.5%(44/54)的菌株gyrA基因的喹诺酮耐药决定区发生突变.结论:在结核病人中存在着较严重的耐喹诺酮药物情况,因此对结核病人选择喹诺酮药物治疗时,好先进行喹诺酮药物的耐药检测,gyrA基因突变的检测可预测菌株对喹诺酮类药物的耐药表型.
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携带新SCCmec型别菌株的耐药特点及PCR图谱多位点序列分析
目的 了解前期研究中发现的3株携带有新型SCCmec聚合酶链反应(PCR)谱型的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的位点序列特性.方法 在前期的分型研究中,从58株MRSA中检测到3株(5.17%)携带了一种新的SCCmec多位点PCR谱型,其含有5条扩增带,依次为A、F、H、B和M.对上述扩增产物测序,用BLAST与国际基因库内已知位点序列进行对比分析.结果 测得序列与已有位点相应序列的同源性均在97%以上.结论 此型为一新的SCCmec多位点PCR谱型,是传统Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型的重组型,与已有型别比较,不但有不同的位点图谱,且有多个点突变.
关键词： 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 葡萄球菌染色体mec盒 DNA测序 序列分析 抗药性 微生物 聚合酶链反应 -
3种检测乙型肝炎病毒YMDD变异方法比较及结果分析
目的对检测乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的3种方法进行比较并分析结果.方法对101例用拉米夫定治疗的HBV感染者,测定其治疗前HBV DNA水平,定期随访,分别以通用模板信号扩增(UT-PCR)、限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和DNA测序法检测病毒YMDD变异.结果UT-PCR和PCR-RFLP的检测结果与DNA测序结果的符合率均为98.11%.按治疗前HBVDNA水平分为5×102～5×104拷贝/mL,5×104～5×106拷贝/mL,5×106～5×108拷贝/mL,＞5×108拷贝/mL 4个组,MDD变异率分别为10%,12.90%,32.43%和53.85%.YMDD突变后,HBVDNA水平显著降低,其中YVDD突变株的HBVDNA水平高于YIDD突变株(P＜0.01).结论UT-PCR法适合临床检测HBVYMDD变异.乙型肝炎患者用拉米夫定治疗时,病毒DNA水平越高,发生YMDD变异的几率越大.突变株的复制能力低于野生株,YVDD突变株复制能力强于YIDD突变株.
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1个有汗性外胚层发育不良大家系的基因研究
目的：探讨有汗性外胚层发育不良（HED）的临床特点和分子机制。方法对1例HED先证者进行其家系5代91人的临床及基因特点研究。抽取家系中7名患者及3名正常对照进行GJB6基因检测。结果家系5代91人中，HED患者17例，表现为不同程度的指（趾）甲发育不良、毛发或体毛稀少甚至缺如；家系中男性患者毛发稀少程度重于女性；随着代数增加，指（趾）甲损害渐减轻。系谱中每一代均有发病者，患者的父母中必有一人发病；男女都可患病；遗传方式为常染色体显性遗传。家系中所有患者的GJB6基因均存在一个杂合错义突变31G→A，家系中无HED临床表现的未检测到此突变。结论 HED为常染色体显性遗传性疾病，以指（趾）甲发育不良、掌跖角化过度、毛发或体毛稀少甚至缺如为临床特点；男性毛发稀少重于女性；且随着代数的增加，指（趾）甲损害逐渐减轻。GJB6基因错义突变（31G→A）是HED的分子机制之一。
关键词： 有汗性外胚层发育不良 GJB6基因 DNA测序 基因诊断 家系 -
5SrRNA基因间隔区DNA序列在穿心莲道地性中的可行性研究
目的 探讨5SrRNA基因间隔区DNA序列在穿心莲道地性研究中的可行性.方法 提取不同产地穿心莲总DNA后,PCR特异扩增5SrRNA基因间隔区,采用荧光标记末端终止子双脱氧末端终止法测序,对测序结果进行多序列联配分析.结果 成功得到321bp的5SrRNA基因间隔区碱基序列,经过多序列联配分析发现,不同产地穿心莲的此段5SrRNA基因间隔区DNA序列之间没有差异.结论 5SrRNA基因间隔区DNA序列不适合用于研究穿心莲药材的道地性.
关键词： 穿心莲 5SrRNA基因间隔区 DNA测序 -
中国汉族帕金森病人microRNA-7变异分析
目的:调查中国大陆帕金森病(Parkinson's disease,PD)患者microRNA-7基因的变异.方法:对225例汉族PD患者应用DNA测序技术进行microRNA-7基因突变分析.结果:在本组PD患者中未发现microRNA-7变异.结论:MicroRNA-7基因突变不是导致中国人群罹患PD的主要因素.
关键词： 帕金森病 microRNA-7基因 基因突变 DNA测序
