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PRL-3基因对结直肠癌细胞增殖能力的影响
目的:探讨PRL-3的过表达或敲低对结直肠癌细胞增殖能力的影响.方法:利用MTT法、平板克隆形成实验检测PRL-3对细胞体外增殖的影响:应用流式细胞术检测PRL-3对细胞周期的影响.结果:应用MTT法,检测PRL-3对SW480/EGFP、SW480-EGFP-PRL-3、SW480/EGFP/Mock及SW480-PRL-3-KD1细胞体外增殖能力的影响,经析因方差分析,4组差异具有显著性(F=23.463,P=0.000)；不同时间点对细胞体外增殖的影响差异具有显著性(F=71.515,P=0.000)；各组细胞与各时间组两因素交互效应显著(F=2.128,P=0.008)；除第1天外,其他各时间点细胞组间的细胞增殖差异具有显著性.经LSD法多重比较,结果表明,与SW480/EGFP/Mock和SW480/EGFP细胞相比,SW480-EGFP-PRL-3细胞的增殖速度加快,而SW480-PRL-3-KDl细胞的增殖速度减慢.平板克隆形成实验显示SW480-EGFP-PRL-3细胞克隆形成能力明显增强,而SW480-PRL-3-KD1细胞克隆形成能力显著下降,差异具有显著的统计学意义(F=44.411,P=0.000).结论:PRL-3基因可促进结直肠癌细胞的增殖.
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miR495、miR551a靶向干扰SGC7901细胞PRL-3基因的表达
目的:构建靶向PRL-3基因的miRNA495和miRNA551a真核表达载体,观察其转染胃癌SGC7901细胞后对胃癌细胞PRL-3基因表达的影响.方法:设计并合成两条针对PRL-3基因的特异性miRNA495和miRNA551a干扰序列,分别与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体连接,转化大肠杆菌,纯化并鉴定后利用LipofectamineTM2000转染胃癌SGC7901细胞,实时定量PCR及Western blot技术鉴定重组体对PRL-3基因表达的干扰效果.结果:针对PRL-3基因的miRNA495和miRNA551a干扰质粒构建成功,胃癌SGC7901细胞分别转染两种质粒后miRNA495及miRNA551a的表达明显升高,并且明显抑制了PRL-3基因mRNA及蛋白的表达.结论:靶向PRL-3基因的miRNA495和miRNA551a真核表达载体构建成功,其可有效提高胃癌SGC7901细胞miRNA495和miRNA551a的表达,并抑制PRL-3 mRNA及PRL-3蛋白的表达.
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siRNA沉默PRL-3基因对前列腺癌PC-3细胞生物学行为的作用
目的 探讨小于扰RNA沉默PRL-3基因对前列腺癌PC-3细胞侵袭及增殖的影响.方法 化学合成PRL-3基因的特异性siRNA,脂质体转染法转染PC-3细胞;24及48小时行real-time PCR和Western blotting验证其沉默效果;Transwell侵袭实验检测其体外侵袭力的改变;CCK8检测其增殖能力.结果 转染siRNA后,与对照组相比较,siRNA干扰组mRNA水平抑制率达60％以上,蛋白水平抑制率达90％以上,且在48h达到佳抑制效果(P ＜0.05,P＜0.05);PC-3细胞穿过基膜数明显减少(P＜0.05),但是对细胞生长抑制作用不明显.结论 应用RNA干扰技术沉默人前列腺癌PC-3细胞中的PRL-3基因,可以抑制PC-3细胞的侵袭能力,为进一步探讨前列腺癌的发病机制奠定一定的实验基础.
关键词： RNA干扰 生物学行为 人前列腺癌PC-3细胞 PRL-3 -
探寻肝再生磷酸酶3在膀胱癌细胞T24中的作用
目的:已经有研究证明肝再生磷酸酶3 (Phosphatase of Regenerating Liver-3,PRL-3)在消化道肿瘤的发生发展过程中起到重要作用,但其在膀胱癌中发挥何种作用尚不清楚,本次研究主要探寻PRL-3在膀胱癌细胞T24中作用,以求为膀胱癌的治疗提供新思路.方法:采用siRNA干涉的方法下调T24中PRL-3蛋白表达水平,通过western blot方法检测干涉效果,绘制细胞生长曲线、构建裸鼠种植瘤模型,检测PRL-3下调对细胞体外及体内增殖的影响.结果:我们所设计的siRNA能够下调PRL-3在A498细胞中的表达(F=7.26,P＜0.05),细胞生长曲线显示下调PRL-3能够抑制细胞的增殖,这种作用从干涉后的第60h开始,随时间增加作用愈加明显(F≥ 8.35,P＜0.05)；动物实验表明,siRNA下调PRL-3能够抑制T24细胞在活体内的增殖,从干涉后第21天开始这种作用开始体现出来(F≥ 10.46,P＜0.05),并且干涉组的肿瘤肿瘤明显低于两个对照组(F=13.63,P＜0.05).结论:我们构建的siRNA能够在T24细胞中实现对PRL-3蛋白的下调,siRNA介导的PRL-3蛋白下调能够明显抑制T24细胞在活体外及活体内的增殖,这初步证明PRL-3在膀胱癌中发挥重要的作用.随着我们对PRL-3分子进一步深入的了解,揭示其发挥作用的具体机制,PRL-3很可能成为膀胱癌基因治疗的新靶点.
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PRL-3对人体胃癌中特异性 SiRNA 的影响
目的：探讨PRL-3对人胃癌中特异性SiRNA的影响。方法采用免疫组化学方法从检测PRL-3；采用 RNAi 技术剔除 PRL-3的表达， MTT 方法检测胃癌细胞的生长，测定 PRL-3的功能。结果 PRL-3在胃癌的表现显示出它的水平高于癌旁胃黏膜组织，这与患者的浸润深度、淋巴结转移及TNM的具体分期有关。由于不同siRNA能对胃癌细胞SGC7901生长、增殖可以产生抑制作用；通过细胞划痕实验，可以比较PRL-3的特异性对siRNA的空白对照组。结论 PRL-3与胃癌生物学行为密切相关，在细胞生长、迁移中起到重要作用。
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结、直肠癌中PRL-3、RhoC的表达及与浸润转移的关系
目的:探讨肝再生磷酸酶-3(PRL-3)与RhoC的表达与结、直肠癌浸润转移的关系及其相关性.方法:采用免疫组化法检测48例结、直肠癌组织中PRL-3和RhoC的表达情况,结合临床病理学资料,分析其与结直肠癌浸润转移的关系及其相关性.结果:结、直肠癌中RhoC、PRL-3蛋白阳性表达率分别为 64.58%(31/48)和68.75%(33/48),二者的表达与结、直肠癌的浸润深度、临床分期和有无淋巴结转移相关,而与病人的年龄、性别、肿瘤细胞分化程度无相关性.在结、直肠癌中PRL-3、RhoC蛋白的表达具有密切相关性.结论:结、直肠癌中PRL-3、RhoC蛋白的表达与其浸润转移密切相关,联合检测这两个指标对了解结、直肠癌的生物学行为和判断预后具有一定的价值.
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PRL-3与E-cad在非小细胞肺癌中的表达及临床意义
目的:探讨肝再生磷酸酶(phosphataseofregenerating liver-3,PRL—3)及上皮钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及其相互之间的关系,为肺癌的临床治疗及预后判断提供依据.方法:利用免疫组化SP法检测50例非小细胞肺癌及15例距癌旁5mm正常肺组织标本中E-cad、PRL-3的表达情况.结果:①E-cad在NSCLC中低表达,且在不同临床分期、病理分级及有无淋巴结转移者中的表达有显著差异(P＜0.05).②PRL-3在NSCLC中高表达,且在NSCLC的不同临床分期及有无淋巴结转移者中也存在显著差异(P＜0.01).③PRL-3与E-cad之间为负相关(x2=11.36,P＜0.01,相关系数r=-0.48).结论:PRL-3及E-cad在NSCLC的各临床分期中表达不同,且在淋巴结转移中起重要作用.
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喷他脒对卵巢癌Skov-3细胞及其裸鼠移植瘤PRL-3的抑制作用
目的 探讨喷他脒对卵巢癌Skov-3细胞及其裸鼠移植瘤PRL-3的抑制作用.方法 (1)M TT法检测不同浓度喷他脒对Skov-3细胞的生长抑制作用;(2)RT-PCR法检测不同浓度喷他脒处理后的Skov-3细胞PRL-3的表达;(3)建立人卵巢癌Skov-3 细胞裸鼠转移瘤模型,按喷他脒给药剂量分4组,记录裸鼠皮下移植瘤的生长情况,绘制肿瘤生长曲线.采用RT-PCR方法检测裸鼠移植肿瘤的PRL-3表达情况.结果 喷他脒对卵巢癌Skov-3细胞体外生长有抑制作用,呈浓度依赖性(P＜0.05);喷他脒中高剂量组予5次给药后裸鼠移植瘤生长速度均与对照组有差异(P＜0.05);中、高剂量喷他脒抑制人Skov-3卵巢癌细胞裸鼠皮下移植瘤的PRL-3表达,且随剂量增加而抑制作用更明显(P＜0.05).结论 喷他脒对卵巢癌Skov-3细胞体外生长及裸鼠Skov-3皮下移植瘤均有有抑制作用;喷他脒可抑制Skov-3卵巢癌细胞及裸鼠Skov-3皮下移植瘤PRL-3的表达.
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PRL-3抑制剂对子宫内膜异位症大鼠异位病灶的作用
目的:建立子宫内膜异位症动物模型,探索PRL-3抑制剂对SD大鼠异位病灶的影响.方法:选取36只雌性SD大鼠,将自体子宫内膜移植至腹壁造模,免疫组化实验鉴定病灶内膜的上皮及间质组织.内异症大鼠腹腔注射PRL-3抑制剂,按给药浓度分组:对照组(0mg/kg)、低剂量组(0.1mg/kg)、中剂量组(1mg/kg)和高剂量组(10mg/kg),比较处理前后各组病灶情况.结果:SD大鼠自体子宫内膜移植建模存活率为86.1％,存活大鼠的造模成功率为92.5％.SD大鼠各组处理后对比处理前,对照组病灶明显增大(P<0.05),低剂量组和中剂量组病灶大小无明显变化,高剂量组病灶显著缩小(P<0.05).高剂量组的病灶显著小于对照组(P<0.05).结论:SD大鼠内异症模型可用于内异症的体内实验研究,是一种操作性强、重复性好且成本低的内异症模型.一定剂量的PRL-3抑制剂可抑制SD大鼠自体异位内膜病灶的生长;PRL-3抑制剂对内异症的靶向治疗有一定的潜在价值.
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PRL-3磷酸酶分子生物学特性及其与大肠癌转移
PRL磷酸酶家族含有PRL-1、PRL-2和PRL-3三种分子,每种分子在不同肿瘤谱中都表现为高表达.新近研究发现,与相应正常组织和原发灶相比,PRL-3在大肠癌转移灶中表达水平和表达率明显增高,其表达水平升高与大肠癌的肝转移潜能有一定的相关性.体外大鼠实验PRL-3能显著增强转染细胞的转移、侵袭和血管生成能力.但是PRL-3通过何种机制以及与何种蛋白相互作用促进大肠癌的转移还有待进一步探讨.对PRL-3的深入研究有望使其成为大肠癌转移诊断和治疗的特异靶点.
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蛋白酪氨酸磷酸酶PRL-3在乳腺癌中表达及意义
目的 探讨乳腺浸润性导管癌及乳腺不典型增生组织中蛋白酪氨酸磷酸酶PRL-3表达情况.方法 采用SP法及RT-PCR方法检测60份乳腺癌组织及50份乳腺不典型增生组织标本中PRL-3表达情况,分析PRL-3与乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系.结果 在乳腺癌癌变过程中PRL-3表达阳性率呈递增趋势；PRL-3表达与有无淋巴结转移有相关性(P=0.011); PRL-3在乳腺癌中表达明显高于乳腺不典型增生组织(P＜0.05).结论 乳腺癌组织中PRL-3在蛋白及基因水平呈高表达,一定程度上提示PRL-3与乳腺癌发生密切相关.
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酪氨酸磷酸酶PRL-3单抗的制备及特性鉴定
目的 制备并鉴定抗肝再生磷酸酶-3(Phosphatase of Regenerating Liver-3,PRL-3)单克隆抗体,为临床检测和以PRL-3为靶点的肿瘤治疗提供可能.方法 运用杂交瘤融合技术制备PRL-3单克隆抗体,通过Western blot检测和免疫沉淀鉴定其与原核及真核PRL-3蛋白的反应性;重组并诱导表达PRL-3的6个截短体,Western blot分析单抗结合的大致抗原表位.结果 共得到9株单抗,3株与PRL-1、PRL-2和PRL-3均反应,6株(9D8、9E2、9F4、11B2、4D3和4D10)只与PRL-3反应,其中4株特异性单抗可以与哺乳动物细胞表达的PRL-3反应;单抗9D8、9E2、9F4和11B2可以和PRL-3羧基末端(162-173位氨基酸)的短肽结合;4D3和4D10与中间部分(69～95位氨基酸)的短肽结合.结论 抗体9D8、9E2、9F4、11B2、4D3和4D10特异性强、亲和力高,为临床检测提供了可靠工具,并为进一步的功能研究奠定了基础.
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PRL-3基因对结直肠癌细胞形态及粘附、运动能力的影响
目的 探讨PRL-3的过表达或敲低对结直肠癌细胞相应的生物学特性的影响.方法 常规进行细胞培养,应用倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞结构;应用运动小室实验检测PRL-3对结直肠癌迁移能力的影响；应用细胞粘附实验测定细胞在Ⅰ型胶原上的粘附性.结果 粘附实验结果表明,与SW480/EGFP/mock和SW480/EGFP细胞相比,SW480- EGFP- PRL-3细胞的粘附能力增强,而SW480-PRL-3-KDI细胞的粘附能力减弱,差异有统计学意义( F=22.013,P＜0.01).运动小室实验证明,SW480/EGFP、SW480-EGFP-PRL-3、SW480/EGFP/mock及SW480-PRL-3-KD1细胞的运动能力差异有统计学意义(F=21.368,P＜0.01),说明PRL-3与结直肠癌细胞的运动迁移能力有关.结论 PRL-3基因是结直肠癌细胞粘附、迁移的促进基因.
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PRL-3基因在前列腺癌组织中的表达及其意义
目的 研究前列腺癌、前列腺增生组织中PRL-3(phosphatase of regenerating liver-3,PRL-3)基因的表达,探讨其与患者临床病理特征的关系.方法 分别采用免疫组织化学S-P法和实时荧光定量PCR检测54例前列腺穿刺/手术切除标本中的PRL-3蛋白和mRNA,其中前列腺增生组织20例,前列腺癌组织34例,比较两者间基因表达的差异;研究PRL-3蛋白和mRNA表达水平与前列腺癌患者年龄、Gleason评分、神经侵犯等临床病理特征的关系和相关性.结果 PRL-3蛋白和mRNA在前列腺癌及前列腺增生组织中均可检出,癌组织中的PRL-3蛋白和mRNA表达水平显著高于增生组织(P=0.001;P=0.001).PRL-3蛋白和mRNA表达水平均与前列腺癌患者年龄无关.PRL-3蛋白与前列腺癌神经侵犯和Gleason评分无关(P=0.376;P=0.360).PRL-3 mRNA与Gleason评分密切相关(P=0.001);PRL-3 mRNA与神经侵犯也存在相关P=0.001.结论 PRL-3基因的表达与前列腺癌发生发展机制关系较密切,可作为前列腺癌鉴别诊断及判断预后的一种较有价值的病理学指标.
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蛋白酪氨酸磷酸酶-3对结肠癌细胞表皮生长因子相关信号通路的调节
目的 观察蛋白酪氨酸磷酸酶-3(PRL-3)在结肠癌LoVo细胞中对表皮生长因子(EGFR)相关信号通路的调节作用.方法 转染PRL-3的LoVo细胞(以下简称LoVo-P)及对照组LoVo细胞(以下简称LoVo-C)48 h后,通过Western blot检测LoVo细胞PRL-3蛋白表达,并检测EGFR及相关信号MEK-ERK通路蛋白p-MEK1/2,p-Erk1/2,p-Msk1/2的表达.结果 Western-Blot检测发现高表达PRL-3的LoVo细胞能够激活EGFR磷酸化水平,蛋白灰度分析显示其表达增多72.3％(P＜0.01).并且转染PRL-3后LoVo细胞的MEK-ERK通道被激活.结论 PRL-3通过激活细胞表皮生长因子磷酸化参与表皮生长因子相关信号通路的调节.
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应用RNA干扰技术建立PRL-3和CDH22双基因表达抑制的结直肠癌细胞模型
目的 建立稳定干扰PRL-3及CDH-22基因的结直肠癌细胞株,为探讨PRL-3、CDH22及其相互作用在结直肠发生及转移中的作用提供理想的细胞模型.方法 以稳定干扰人PRL-3基因大肠癌SW480细胞的克隆为基础,以靶向人CDH22基因的RNAi慢病毒再次感染该细胞株,将经慢病毒二次感染的细胞悬液通过有限稀释法制备细胞单克隆,各细胞克隆扩大培养,荧光定量PCR检测各细胞克降PRL-3及CDH22mRNA表达水平.结果 应用于二次感染的慢病毒悬液的滴度为8×105U/ml.综合分析荧光定量PCR结果,所获得的细胞克隆中1号克隆PRL-3及CDH22mRNA水平的表达显著降低.结论 成功建立PRL-3及CDH-22基因稳定敲低的大肠癌细胞克隆,探索同时敲低2个基因的慢病毒RNAi技术.
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PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及在SW480细胞中的表达
目的 构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系.为PRb-3基因功能研究奠定基础.方法 设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体.通过与pENTRTM/U6 entry clone与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST载体进行重组,获得pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体.利用包装细胞293FT获得重组的慢病毒,感染大肠癌细胞株SW480细胞,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰PRL-3基因的细胞亚系.结果 成功构建PRL-3 pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为6×105U/L.RT-PCR、Western blotting结果 表明,克隆1 PRL-3mRNA及蛋白显著降低.结论 成功构建人PRL-3基因特异性的慢病毒干扰载体,获得PRL-3基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系.
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PRL-3基因的克隆及其原核表达载体的构建表达
目的 克隆人PRL-3基因并构建其原核表达载体.方法 设计PRL-3特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人PRL-3 cDNA.经T-A克隆,通过双酶切鉴定及测序确认后,构建人PRL-3基因的原核表达载体pGEX-4T-1-PRL-3.结果 成功扩增出人PRL-3全长cDNA,并构建pGEX-4T-1-PRL-3原核表达载体,测序结果表明PRL-3全长cDNA与GenBank中PRL-3序列完全一致,SDS-PAGE胶分析表明,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了重组蛋白.结论 获得人PRL-3基因全长cDNA并构建其原核表达载体,使其在大肠杆菌中获得了高效表达,为深入研究PRL-3基因在大肠癌发生发展中的作用奠定了基础.
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人大肠癌细胞PRL-3基因启动子Snail结合位点的初步研究
目的 确定转录因子Snail可与PRL-3基因启动子区结合.方法 应用生物信息学方法获得PRL-3基因启动子区域,并对其潜在的Snail结合位点进行预测,进一步应用Snail抗体染色质免疫共沉淀技术结合PCR技术检测PRL-3基因启动子序列,以确定转录因子Snail可与PRL-3基因启动子结合.结果 应用TRED在线分析系统确定PRL-3基因的启动子区域位于PRL-0基因上游-700 bp至299 bp之间,在该启动子区域存在多个转录因子如Snail、n-MYC、ARNT、E74A、NF-kappaB、NRF-2及AML-1等的结合位点;在启动子区域的-500 bp至-451 bp之间存在Snail结合的核心寡核苷酸序列CACCTG,在其他多个区域存在多个类似这一核心序列的DNA序列;应用染色质免疫沉淀技术结合PCR扩增的方法对人大肠癌细胞株SW480细胞进行分析,发现Snail可与人大肠癌细胞株SW480 PRL-3基因的启动子区域的DNA片断结合.结论 转录因子Snail可与人大肠癌细胞SW480 PRL-3基因启动子结合,参与PRL-3基因的调控.
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重组人PRL-3蛋白的表达、鉴定和酶动力学分析
目的 构建融合蛋白pCold Ⅱ-His-PRL-3表达质粒,并进行诱导表达、纯化、鉴定和酶动力学分析.方法 通过基因重组技术构建pCold Ⅱ-His-PRL-3融合蛋白表达载体,并在ArcticExpress E.Coli中表达融合蛋白.经Ni2+-NTA层析纯化,PRL-3蛋白用SDS-PAGE和Western blot初步鉴定,基质辅助激光解吸/电离直角型飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)确证,并进行酶动力学分析.结果 重组载体pCold Ⅱ-His-PRL-3包含正确的PRL-3编码序列,经IPTG诱导后能正确表达融合蛋白,Western blot显示表达蛋白具有抗原性,质谱分析结果显示目的蛋白氨基酸序列与PRL-3蛋白完全相符.PRL-3酶的米氏常数Km为6.59μmol/L,催化常数Kcat为0.44 min-1.结论 构建的pCold Ⅱ-His-PRL-3重组载体可表达具有酶活性的PRL-3蛋白,为PRL-3酶抑制剂的筛选奠定了基础.
