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扩增阻滞突变系统在脊肌萎缩症快速诊断中的应用
儿童进行性脊髓肌肉萎缩症,简称脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA),是一种以脊髓前角运动细胞变性为病理特征,临床上以近端肌无力、肌萎缩为主要表现的常染色体隐性遗传性疾病.根据SMA发病年龄和病程的不同将其分为3型:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型.
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Ⅰ型胶原α1基因多态性与原发性骨质疏松症的相关性研究
目的探讨Ⅰ型胶原α1基因多态性与原发性骨质疏松症、骨质疏松性骨折的相关性.方法 (1)选出60例原发性骨质疏松患者,其中髋部骨折组30例均为新近骨折并有X线片为诊断依据;(2)30例健康对照组,性别、年龄与之对应;(3)全部对象均行骨密度测定;(4)采静脉血,EDTA抗凝;(5)淋巴细胞分离液分离白细胞,置-80℃保存;(6)分离的白细胞中提DNA;(7)ARMS-PCR检测.结果 60例原发性骨质疏松患者中选出1例Ss型,其余均为SS型;30例健康对照组均为SS型.结论Ⅰ型胶原α1基因多态性与原发性骨质疏松症、骨质疏松性骨折无关.
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基于ARMS法检测BRAF V600E突变在甲状腺乳头状癌中的临床价值
目的 探讨扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)法检测BRAF V600E突变的可行性,并评估BRAF V600E突变对鉴别甲状腺结节性质的临床价值.方法 采用ARMS法检测并比较179例甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)和115例甲状腺良性病变组织的BRAF V600E突变状态,计算BRAFV600E突变对鉴别甲状腺结节性质的各项诊断指标,分析BRAF V600E突变与PTC临床病理特征的相关性.结果 ARMS法检测甲状腺病灶组织中的BRAF V600E突变方法可行,结果可信.BRAF V600E在PTC中的突变率为82.68％,而在良性组织中的突变率仅为1.74％,两者差异有统计学意义(x2=183.568,P＜0.01).利用BRAF V600E突变判定甲状腺结节性质的诊断敏感度为82.68％,特异度为98.26％,准确度为88.76％,约登指数为0.8094.BRAF V600E突变与PTC患者的性别、年龄、肿瘤大小、病灶数目、双侧病灶、腺外侵犯以及淋巴结转移等因素无关.结论 ARMS法检测BRAFV600E突变具有较高的诊断敏感度和特异度,其对鉴别甲状腺结节的性质具有重要的临床早期诊断价值.
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华北地区CYP1A2基因常见SNP位点的分布
目的:建立CYP1 A2基因-3860G＞A、-3113G＞A、-2467delT、-739T＞G、-163C＞A、2321G＞C、5347C＞T等7个SNP位点的检测方法,探讨7个SNP位点在华北地区人群中的分布.方法:选取健康受试者,提取全血样本DNA,以Primer Premier 5软件自设计引物及探针,采用扩增阻滞突变系统(ARMS)结合TaqMan探针技术(ARMS-TaqMan法)建立CYP1 A2基因7个SNP位点基因分型方法.结果:-3860G＞A、-3113G＞A、-2467 delT、-739T＞G、-163C＞A、2321G＞C、5347C＞ T7个SNP位点的突变等位基因频率分别为0.292、0.078、0.524、0.078、0.657、0.148、0.127.结论:成功建立7个SNP位点的ARMS-TaqMan基因分型方法,该方法具有准确、操作简单、高通量等优势.
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扩增阻滞突变系统快速检测H型高血压患者MTHFR C677 T基因型的应用研究
目的：通过扩增阻滞突变系统-聚合酶链反应（ ARMS-PCR）检测H型高血压患者5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T基因型，以期建立一种低成本、简单快速的MTHFR C677T基因分型方法。方法基于湖南省H型高血压危险因素研究的大型流行病调查的人群基础，采用单纯随机方法，选取94例H型高血压患者作为研究对象。设计阻滞度递减的系列错配引物，采用ARMS-PCR对94例患者外周血样本的MTHFR C677T基因型进行鉴定，并抽取不同基因型进行测序验证。结果 ARMS-PCR产物电泳后条带清晰，易于判读MTHFR C677T基因型。94例H型高血压患者共检出CC基因型42例、CT基因型24例和TT基因型28例。ARMS-PCR与DNA测序结果一致。结论 ARMS-PCR经阻滞度递减的系列错配引物能有效对MTHFR C677T基因型进行鉴定，此法具有成本低、操作简单、用时短的优点。适用于各类基因的多态性分析。
关键词： 扩增阻滞突变系统 5 10-亚甲基四氢叶酸还原酶 基因分型 H型高血压 -
表皮生长因子受体基因突变检测方法改进及初步临床验证
目的:改进现有的检测表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的荧光PCR法并开发出新的试剂盒,将其与直接测序法和ARMS法进行对比,验证该试剂盒用于临床诊断的敏感性、特异性和准确性.方法:收集2013年6月至2015年8月手术确诊的141例非小细胞肺癌(NSCLC)的石蜡包埋组织标本.采用盲法分别使用直接测序法、ARMS法和新试剂盒检测EGFR突变,比较新试剂盒与其他两种检测方法的差异,结果不一致时采用三种方法分别重复检验一次.结果:三种方法检测成功率均为100％,新试剂盒与直接测序法测得结果完全一致的比率达75.9％(107/141),在直接测序法测得的96例突变阳性中,92例在新试剂盒检测中得到验证(95.8％).而直接测序法显示突变阴性的45例中,新试剂盒检测发现了23例突变阳性,两种检测方法的结果存在统计学差异(x2=40.745,P＜0.05).与直接测序法进行比较,新试剂盒检测EGFR突变的敏感性、特异性分别为95.8％、48.9％,阳性预测值、阴性预测值分别为80.0％、84.6％,检测准确度为80.9％.以ARMS检测法为金标准,新试剂盒测得结果完全一致的比率达84.4％(119/141),两者的一致性比较好(K=0.749,P＜0.05),敏感性、特异性分别为94.1％、86.4％.结论:改进后EGFR基因突变检测的试剂盒在技术上较好地控制了检测结果的假阳性和假阴性,该检测方法较直接测序法具有更好的敏感性和准确性,与现有的ARMS法一致性较高.
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Hb New York病ARMS-PCR检测及临床表型分析
目的 通过扩增阻滞突变系统PCR (ARMS-PCR)检测Hb New York病,并对阳性患者进行表型分析.方法 用毛细管电泳筛查出可疑Hb New York患者,用ARMS-PCR和基因测序技术同时对可疑阳性患者进行检测,并对确诊患者进行表型分析.结果 在23 026例标本中共筛检出可疑Hb New York病例28例,用ARMS-PCR和基因测序技术确诊24例,二者吻合率达100％.结论 ARMS-PCR可快速检测Hb New York病,适于推广应用.
关键词： 血红蛋白New York 扩增阻滞突变系统 表型分析 -
CYP1A2*1F基因多态性的检测方法建立及其对阿戈美拉汀药代动力学的影响
建立实时荧光定量PCR方法检测CYP1A2* 1F基因多态性,并探讨CYP1A2*1F基因多态性对阿戈美拉汀药代动力学的影响.该方法采用扩增阻滞突变系统(ARMS)结合TaqMan探针技术(ARMS-TaqMan法)同时检测野生和突变两个反应体系,根据野生引物循环阈值(Ctw)与突变引物循环阈值(Ctm)的差值绝对值(ACt)来判断CYP1A2* 1F的基因型.同时进行口服阿戈美拉汀片25mg的药代动力学试验,采用液相色谱-串联质谱法测定血浆中阿戈美拉汀浓度,采用WinNonlin 6.3软件处理血浆中药物浓度-时间数据,非房室模型方法计算药代动力学参数Tmax、Cmax、AUC0→t、AUC0→∞和T1/2.结果表明,在55名健康受试者中,CYP1A2 * 1F野生型共12例(21.8％),其△Ct值为9.89±0.56;杂合型22例(40.0％),其△Ct值为0.41±0.14;纯合突变型21例(38.2％),其△Ct值为6.85±0.32.统计分析显示,CYP1A2* 1F 3种基因型组间各药代动力学参数比较皆无显著性差异(P＞0.05),但所建立的用于CYP1A2* 1F基因多态性检测的ARMS-TaqMan法具有准确、操作简单、高通量等优势,便于进一步筛查基因多态性对阿戈美拉汀药代动力学的影响,适合临床应用.本方法检测原理可用于各种单碱基突变率的检测,具有广泛的应用前景.
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血浆EGFR基因突变检测在晚期非小细胞肺癌患者EGFR-TKI疗效评估中的价值
目的 探讨血浆表皮生长因子受体(EGFR)突变状态检测在晚期非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体酪氨酸酶抑制剂(EGFR-TKI)疗效评估中的价值.方法 应用扩增阻滞突变系统(ARMS)法检测70例晚期非小细胞肺癌患者肿瘤组织及血浆的EGFR突变状态.以肿瘤组织中的EGFR突变状态检测为对照,计算血浆中EGFR突变状态检测的敏感性、特异性、一致性,并比较两种检测对患者EGFR-TKI疗效及预后评估的差异.结果 以配对的肿瘤组织EGFR突变检测结果为对照,ARMS法检测血浆EGFR突变的敏感性、一致性及特异性分别为58.1%、72.9%、96.3%.在38例经过EGFR-TKI治疗的患者中,肿瘤组织EGFR突变型患者的有效率及中位无进展生存期均优于EGFR野生型患者(有效率:69% 比11.1%,P=0.005;无进展生存期:10个月比3个月,P=0.003).血浆EGFR突变型患者与肿瘤组织EGFR突变型患者的有效率及中位无进展生存期均相似(有效率:P=0.908;中位无进展生存期:P=0.593).在血浆标本中,EGFR突变型患者的中位无进展生存期长于EGFR野生型患者(10个月比7个月 ,P=0.032).EGFR突变型患者的有效率高于EGFR野生型患者,但差异无统计学意义(70.6%比42.9%,P=0.111). 结论 血浆EGFR突变可预测晚期非小细胞肺癌患者EGFR-TKI疗效,但因较高的假阴性率,血浆EGFR野生型患者需应用肿瘤组织进一步检测.
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基于实时荧光定量PCR的ARMS法检测BRAF V600E点突变在甲状腺微小乳头状癌中的早期诊断价值
目的 探讨BRAF V600E点突变在甲状腺微小乳头状癌(PTMC)和甲状腺良性病变中的表达状况,并评估其在PTMC中的早期诊断价值.方法 采用基于实时荧光定量PCR技术的扩增阻滞突变系统(ARMS)法检测并比较104例PTMC和42例甲状腺良性病变中BRAF V600E点突变的表达差异,分析BRAF V600E点突变与PTMC临床病理特征的相关性,计算BRAF V600E点突变对鉴别PTMC及甲状腺良性病变的各项临床诊断指标.结果 104例PTMC的BRAFV600E点突变率为83.65％,而42例甲状腺良性病变的突变率仅为2.38％,BRAF V600E点突变率在2组间差异有统计学意义(x2=82.531,P＜0.05).BRAF V600E点突变与PTMC患者的性别、年龄、肿瘤大小、病灶数目、双侧累及、被膜侵犯、淋巴结转移及TNM分期均无相关性(P＞0.05).ARMS法检测BRAF V600E点突变对诊断FTMC的敏感度为83.65％,特异度为97.62％,准确度为87.67％,约登指数为0.812 7,阳性预测值为98.86％,阴性预测值为70.69％.结论 BRAF V600E点突变是诊断PTMC的重要标记物,基于实时荧光定量PCR的ARMS法检测BRAF V600E点突变对PTMC具有良好的早期诊断价值.
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扩增阻滞突变系统检测晚期非小细胞肺癌患者外周血游离DNA中EGFR基因突变
目的 探究外周血游离DNA(cfDNA)检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的可行性.方法 收集2013年7月-2014年1月湖北省肿瘤医院收治50例确诊为晚期NSCLC患者的肿瘤组织及配对的外周血样本,分别提取肿瘤组织DNA及cfDNA,采用基于实时荧光定量PCR的扩增阻滞突变系统(ARMS)检测两类样本中EGFR基因突变.结果 以肿瘤组织的结果为准,c仍NA中检出突变的特异性为97.2％ (35/36),敏感度为78.6％(11/14),一致性为92.0％ (46/50),且具有和肿瘤组织相同的EGFR基因突变类型.结论 cfDNA和肿瘤组织的EGFR基因突变类型相同,一致性、特异性和敏感度较高,对于晚期难以获得组织的NSCLC患者,外周血可代替肿瘤组织应用于临床EGFR基因突变检测.
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基于ARMS法检测BRAF V600E突变在甲状腺乳头状癌中的临床价值
目的 探讨扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)法检测BRAF V600E突变的可行性,并评估BRAF V600E突变对鉴别甲状腺结节性质的临床价值.方法 采用ARMS法检测并比较179例甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)和115例甲状腺良性病变组织的BRAF V600E突变状态,计算BRAF V600E突变对鉴别甲状腺结节性质的各项诊断指标,分析BRAF V600E突变与PTC临床病理特征的相关性.结果 ARMS法检测甲状腺病灶组织中的BRAF V600E突变方法可行,结果可信.BRAF V600E在PTC中的突变率为82.68%,而在良性组织中的突变率仅为1.74%,两者差异有统计学意义(χ2=183.568,P<0.01).利用BRAF V600E突变判定甲状腺结节性质的诊断敏感度为82.68%,特异度为98.26%,准确度为88.76%,约登指数为0.8094.BRAF V600E突变与PTC患者的性别、年龄、肿瘤大小、病灶数目、双侧病灶、腺外侵犯以及淋巴结转移等因素无关.结论 ARMS法检测BRAF V600E突变具有较高的诊断敏感度和特异度,其对鉴别甲状腺结节的性质具有重要的临床早期诊断价值.
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晚期非小细胞肺癌患者EGFR基因突变及其与血清肿瘤标志物的相关性
目的 利用扩增阻滞突变系统(ARMS)检测晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者表皮生长因子受体(EGFR)基因突变情况,探讨其与患者临床特征和血清肿瘤标志物的相关性.方法 收集2015年1月至2016年4月山东大学齐鲁医院收治的92例晚期NSCLC患者血浆标本,采用ADx-ARMS方法 检测EGFR基因突变情况,采用化学发光法检测癌胚抗原(CEA)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCC-Ag)、糖类抗原(CA)125、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、唾液酸(SA)水平.结果 晚期NSCLC患者EGFR基因总突变率为32.6%(30/92).其中,EGFR19-del突变率为15.2%(14/92),EGFR21-L858R突变率为12.0%(11/92),EGFR20-T790M突变率为2.2%(2/92).晚期NSCLC患者EGFR基因突变与患者性别、吸烟史、病理类型具有明显相关性.与EGFR基因野生型患者比较,EGFR基因突变患者CEA水平明显升高(P<0.05),CA125、CYFRA21-1、SCC-Ag水平明显降低(P<0.05).结论 晚期NSCLC患者EGFR基因突变者血清肿瘤标志物CEA、CA125、CYFRA21-1、SCC-Ag水平与未突变患者存在明显差异,为发现EGFR基因突变与血清肿瘤标志物的相关性乃至筛选表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗的优势人群提供参考.
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3个肾上腺脑白质营养不良家系的基因突变分析
目的对3个肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy,A100)家系进行基因突变分析.方法从3个ALD患儿及其主要家系成员的外 周血白细胞,提取总RNA和基因组DNA.应用逆转录聚合酶链反应技术,对3个家系的 ABCD1基因编码区,分4个片段进行PCR扩增并对PCR产物直接测序.同时应用PCR-限制性酶切 或扩增阻滞突变系统分析相应的基因组DNA,进一步确证 ABCD1基因的突变位点.结果 3名患儿的 ABCD1基因上均存在错义突变 ,其中患儿1的 ABCD1基因第534位密码子发生CCC→CGC改变,使脯氨酸被精氨酸取代(P534R);患儿2的 ABCD1基因第266位密码子发生GGG→AGG 改变,使甘氨酸被精氨酸取代(G266R);患儿3母亲的 ABCD1上一个等位基因第617位密码子 发生CGC→GGC改变,使精氨酸被甘氨酸取代(R617G),另一个等位基因未发生突变.结论在中国人ALD患者中发现1个新的 ABCD1基因突变(P534 R),并首次在中国人ALD患者中检测到G266R、R617G突变.
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应用双侧扩增阻滞突变系统排除肾上腺脑白质营养不良分子诊断中假基因的干扰
目的 应用扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system, ARMS)排除ABCD1假基因的干扰,对肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy, ALD)家系进行基因突变分析.方法 按ARMS引物设计原则设计上游引物(正常引物、突变引物)和下游公共引物,对家系成员的基因组DNA分别进行PCR扩增.结果 R617C突变患者及其母亲的突变引物均扩增出特异性条带(107 bp),患者父亲和对照则未见条带,在基因组DNA水平证实了R617C突变的存在.结论 双侧ARMS方法可以快速、有效地排除假基因干扰.
关键词： 肾上腺脑白质营养不良 分子诊断 ABCD1基因 假基因 扩增阻滞突变系统 -
ARMS技术联合Taqman探针检测100例非小细胞肺癌EGFR基因突变
背景与目的 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变是决定表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)疗效重要的预测因子,对EGFR基因突变进行检测,对指导患者个体化治疗具有重要意义.EGFR基因突变检测方法有很多,每种方法各有优缺点,本研究拟采用扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)技术与Taqman探针相结合的方法,建立一种能快速、敏感及特异检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的方法.方法 首先,应用Primer Premier 5.0软件在EGFR基因E746 A750和L858R处设计ARMS引物及Taqman水解探针.然后,以包含E746_A750缺失和L858R点突变的质粒为研究对象,进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性以及特异性.后,用所建立的ARMS-Taqman法检测100例非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)临床标本.结果 在无背景DNA干扰的情况下,ARMS-Taqman法检测灵敏度可达10 copies.对于检测敏感性,在500 copies/μL野生型基因背景下,其敏感性达1％；在5,000 copies/μl野生型基因背景下,其敏感性高达0.1％-0.5％.对于检测特异性,以正常人白细胞DNA为研究对象,21 L858R突变存在一定程度的非特异性扩增,但其小ΔCt高达14.89,而19 Del未见非特异性扩增.对100份临床标本进行检测,19 Del 21例,21 L858R 18例,总突变率为39.0％.结论 我们所构建的ARMS-Taqman法是一种快速、简便以及具有较高灵敏度和特异性的EGFR基因突变检测方法,值得在临床上进一步推广和验证.
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扩增阻滞突变系统用于ABO血型基因分型研究
目的 建立一种快速、低成本的ABO血型基因分型方法.方法 设计6对引物,建立扩增阻滞突变系统(ARMS),对30例中国汉族无关个体外周血样本的ABO基因型进行鉴定,并与血清学方法和直接测序结果进行比较.结果 ARMS技术检测30例样本结果同血清学方法、直接测序结果吻合率达到100％.结论 该研究建立的ABO血型基因型鉴定方法可快速检测出28种ABO基因型,具有一定的临床应用价值.
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ARMS法检测肺腺癌EGFR基因突变及临床意义
目的 探讨扩增阻滞突变系统(ARMS)法在肺腺癌中表皮生长因子受体(EGFR)基因突变检测的应用及其临床意义.方法 收集2015年1月～2016年8月西安交通大学第一附属医院病理科的肺腺癌标本566例作为研究对象.其中,胸腔积液细胞块标本34例,肺活检标本401例,手术切除标本131例,采用ARMS法进行石蜡标本EGFR基因突变检测,分析EGFR基因突变与肺腺癌患者临床资料的相关性.结果 肺腺癌标本566例中,吸烟腺癌患者239例,非吸烟腺癌患者327例.吸烟患者中,EGFR突变率与患者年龄、性别、手术方式等无明显关联(P＞0.05),而与肺癌原发部位关系密切(P＜0.05);非吸烟患者中,EGFR突变率与性别、年龄、标本类型及肺癌原发病灶部位无明显相关性(P＞0.05).结论 ARMS法可有效应用于肺腺癌临床病理石蜡标本中EGFR基因突变检测.吸烟是EGFR突变率的重要影响因子,且对左、右肺均有影响,但是对右肺的影响较大.
