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反义硫代修饰寡核苷酸体外抗甲型流感病毒感染的效应研究
目的 在感染甲型流感病毒(influenza A virus,IFAV)的人气道上皮细胞(9HTEO)中观察与IFAV PB1、M2、NS、PB2、HA基因瓦补的反义硫代修饰寡核苷酸(ASODN)的抗病毒活性.方法 细胞外体系观察没计的ASODN效率,筛选对IFAV有效的3个ASODN进行9HTEO的抗病毒效应.倒置显微镜下观察IFAV的敛细胞病变作用和ASODN的细胞保护作用.MTT方法测细胞存活率,空斑试验、RT-PCR、Westem blot、免疫荧光检测ASODN特异性抗病毒效应,MTT法检测ASODN对细胞的保护作用.结果 IFAV感染复数(MOI)在0.1以上时,培养5 d后IFAV感染的9HTEO细胞全部死亡.设计的ASODN能够提高感染细胞的存活率,且呈量效依赖关系.空斑试验、RT-PCR、Western blot、免疫荧光试验证实在细胞水平、基因转录水平、蛋白水平针对IFAV PB1、M2、NS基因mRNA转录起始点保守序列没计的ASODN具有特异性抗IFAV作用.结论 ASODN具有较明显的抗病毒活性,为进一步研究和开发新型抗IFAV药物提供了实验依据.为高致病性禽流感(H5N1)的基因治疗提供了新的思路和理论依据.
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细胞因子信号转导抑制因子在呼吸道合胞病毒感染支气管上皮细胞免疫失衡中的表达
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是婴幼儿下呼吸道感染的重要病原体之一,流行病学调查发现,婴幼儿期患过RSV毛细支气管炎的患儿中50％ ～ 70％可发生反复喘息,甚至支气管哮喘(简称哮喘)[1].Th1/Th2失衡是哮喘患儿气道炎症和气道高反应性发生和发展的关键[2],细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)与Th1/Th2分化有密切关系[3].本研究通过在体外构建RSV持续感染人气道上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBEC)的模型,并与淋巴细胞共培养,观察干扰素-γ(IFN-γ)和IL-4以及SOCS3和SOCS5的表达,为RSV感染引起Th免疫失衡的机制及SOCS与Th分化的关系提供证据.
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脂多糖诱导气道上皮细胞过氧化物氧化还原酶1的表达
目的 探讨脂多糖(LPS)作用于气道上皮细胞后对过氧化物氧化还原酶1(prdx1)表达的影响.方法 培养正常人气道上皮细胞株BEAS-2B,以0、1、10 mg/L LPS作用于气道上皮细胞12h和24h后,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测pMx1 mRNA表达；以0、0.1、0.5、1、5、10 mg/L LPS作用于气道上皮细胞12h后,用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测prdx1蛋白表达.结果 RT-PCR结果显示:LPS作用于细胞12h内,随着LPS作用剂量的增加,pMx1mRNA表达增高,10 mg/L LPS作用12hpMx1 mRNA表达较对照组显著增加(2.014±0.197比0.644±0.178,P＜0.05)；但随着LPS作用时间的延长,24 h时prdx1mRNA表达有所回落.Western blotting结果显示,随着LPS作用剂量的增加,prdx1蛋白表达逐渐增高,5mg/L LPS作用12h时prdx1蛋白显著高于对照组(1.069±0.175比0.328±0.010,P＜0.05),10 mg/L LPS作用12h时维持在高水平(0.984±0.220).结论 10 mg/L的LPS作用于BEAS-2B细胞12h后可诱导prdx1的基因和蛋白表达增加.
关键词： 脂多糖 人气道上皮细胞 过氧化物氧化还原酶1 -
灵芝孢子粉对脂多糖诱导的人气道上皮细胞损伤的保护作用
目的：探讨灵芝孢子粉对脂多糖（LPS）诱导细胞损伤的保护作用及机制。方法对16HBE细胞体外培养，分别给予不同剂量灵芝孢子粉预保护24 h后，给予LPS（1μg／ml）刺激6 h，采用MTT法检测气道上皮细胞活性，检测细胞上清液中的超氧化歧化酶（ SOD），丙二醛（ MDA），肿瘤坏死因子α（TNF-α），白介素-6（IL-6）等。采用Western印迹检测细胞内核因子（NF）-κB蛋白表达。结果灵芝孢子粉可明显提高人气道上皮细胞的活力，显著降低细胞上清液中MDA、TNF-α、IL-6；显著提高SOD的含量；并显著降低细胞内NF-κB蛋白表达。结论灵芝孢子粉对 LPS诱导的人气道上皮细胞损伤有保护作用。
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白三烯诱导人呼吸道上皮细胞氧化应激及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的作用研究
目的 研究白三烯诱导人呼吸道上皮细胞内谷胱甘肽氧化还原状态变化及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的作用.方法 将人气道上皮细胞分为对照组和暴露组.暴露组的人气道上皮细胞暴露于白三烯2、4、6、12 h.检测对照组及暴露组在2、4、6、12 h相应指标.测定气道上皮细胞内谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量;双酶法测定γ-GCS活性;RT-PCR检测气道上皮细胞中γ-GCS-mRNA表达;Western-blot检测气道上皮细胞核和细胞质中γ-GCS蛋白表达;细胞免疫荧光法检测气道上皮细胞γ-GCS蛋白表达.结果 暴露组细胞2、4、6、12 h的GSH含量、GSH/GSSG比值先减少后逐渐增加,4 h低,6 h达高,12 h恢复正常;而GSSG含量则呈现相反趋势,与对照组之间差异有统计学意义.暴露组细胞2、4、6 h,γ-GCS活性增强,与对照组比较差异有统计学意义.细胞免疫荧光法检测气道上皮细胞γ-GCS蛋白阳性信号主要分布在胞质中,暴露组呈强阳性表达,而对照组表达较弱,暴露组2、4、6 h时与对照组比较,差异有统计学意义.Western-blot 检测结果相似.RT-PCR检测气道上皮细胞中γ-GCS-mRNA表达,暴露组2、4、6 h时较对照组增加,差异有统计学意义.结论 白三烯诱导氧化应激影响呼吸道上皮细胞谷胱甘肽氧化还原状态,而呼吸道上皮细胞通过提高γ-GCS活性对抗氧化应激,保持氧化还原稳定的状态.
关键词： 支气管哮喘 白三烯 氧化应激 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 人气道上皮细胞 -
羧甲司坦对人气道上皮细胞炎症的影响及调控机制研究
目的 通过比较羧甲司坦单用或联合布地奈德对人气道上皮细胞炎症的影响探讨其调控机制.方法 MTT法检测不同浓度烟雾提取物(CSE)对细胞生存率的影响.给予不同药物抑制剂和激动剂干预后,检测炎症因子水平、ERK和IκBα蛋白,以及ERK和NF-κB mRNA的表达.结果 模型组炎症因子水平、p-ERK和p-IκBα蛋白,以及ERK和NF-κBmRNA表达均增高;用药组上述指标较模型组均有所改善,但用药组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05).羧甲司坦、PD98059干预后p-ERK蛋白及ERK、NF-κBmRNA水平均降低,而给予EGF干预后上述指标较羧甲司坦组有所回升.结论 羧甲司坦的抗炎机制可能与糖皮质激素存在重叠,基础应用糖皮质激素者由于抑制了相同的信号转导通路,故再联合应用羧甲司坦时效果不佳.
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脂多糖诱导的人气道上皮细胞Caspase-1的表达研究
目的 探讨脂多糖(LPS)诱导人气道上皮细胞半胱氨酸天冬氨酸酶-1(Caspase-1)的表达情况.方法 体外培养人气道上皮细胞,将其随机分为阴性对照组、LPS组及Caspase-1特异性抑制剂(Ac-YVAD-cmk) +LPS组(简称cmk+LPS组).采用四氮唑盐(MTT)法测定各组细胞的增殖能力；实时荧光定量RT-PCR检测各组细胞Caspase-1mRNA的表达水平；Western-blot测定各组细胞Caspase-1蛋白的表达;ELISA法检测各组细胞上清液白介素1β(IL-1β)水平.结果 3组细胞增殖差异无统计学意义(P＞0.05)；LPS组Caspase-1 mRNA的表达水平较cmk+LPS组和对照组增高,3组间差异有统计学意义(P＜0.05); LPS组Caspase-1蛋白的表达明显高于对照组和cmk+LPS组,3组间差异有统计学意义(P＜0.05)；LPS组IL-1β水平高于对照组和cmk+LPS组,3组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 NLRP3炎症复合体诱导的Caspase-1活化参与人气道上皮细胞LPS的致敏过程,并促进下游IL-1β的生成.
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脂氧素A4通过Nrf2调节气道上皮细胞E－cadherin的表达缓解脂多糖吸入诱导的小鼠急性肺损伤
机体局部或全身失控性炎症反应是急性肺损伤（ acute lung injury， ALI）的重要病理生理特征。脂氧素（ lipoxin， LX）是机体重要的促炎症缓解物质。气道上皮细胞是组成气道屏障和气道环境刺激首先受累的细胞，外界刺激和肺组织内异常的活性氧引起气道上皮损伤在ALI中扮演重要角色。本研究发现，LX稳定气道上皮细胞钙黏蛋白（ E－cadherin）的表达保护其完整性，改善气道通透性，有效缓解脂多糖（ lipopolysaccharide， LPS）吸入引起的小鼠ALI。低温成像结果表明LX逆转LPS吸入引起的小鼠肺组织线粒体氧化还原状态失衡，并抑制LPS引起人气道上皮细胞16HBE中活性氧的产生。采用荧光共振能量转移技术监测16HBE细胞中调节抗氧化基因的重要转录因子Nrf2和其胞浆负性调节伴侣分子Keap1的解离，证实LX通过促进Nrf2蛋白ser40位点的磷酸化使其解离活化发挥其保护效应。转入显性负性突变的质粒pDN－Nrf2后，LX对16HBE钙黏蛋白表达的稳定作用几乎消失。综上所述，我们认为LX通过Nrf2调节气道上皮细胞E－cadherin的表达而保护LPS引起的ALI。
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25羟维生素D3对支气管上皮细胞维生素D受体表达及分布的影响
目的 探讨25羟维生素D3对人正常气道上皮维生素D受体表达及分布的影响.方法 选取正常人支气管上皮细胞系16HBE为研究对象,MTT法分别检测不同浓度25羟维生素D3对细胞活力的影响；实验组分为对照组和不同浓度25羟维生素D3处理组.各处理因素作用细胞时间为24 h.用实时荧光定量PCR、Western blot、免疫荧光法观测各处理组维生素D受体(VDR)mRNA及蛋白表达、分布的情况.结果 与对照组相比,各个不同处理浓度的25羟维生素D3对VDR的表达量及分布均无显著增加(P＞0.05).结论 25羟维生素D3对支气管上皮细胞的影响可能并不依赖于VDR的表达及转位.
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反义硫代修饰寡核苷酸体外抗呼吸道合胞病毒感染的研究
目的:在感染呼吸道合胞病毒(RSV)的9HTE细胞中观察与RSVNS1基因和M2基因互补的反义硫代寡核苷酸的抗病毒活性.方法:直接观察RSV的致细胞病变作用,用MTT方法测定细胞存活率.结果:1.RSV感染复数(moi)在0.1以上时,培养5天后RSV感染的9HTE细胞全部死亡.2.我们设计的反义核酸能够提高感染细胞的存活率,且呈量效依赖关系.结论:反义硫代寡核苷酸具有较明显的抗病毒活性,为进一步研究新型抗RSV药物奠定了基础.
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分枝杆菌噬菌体Chy3对人气道上皮细胞16HBE生长及功能的影响
目的:探讨不同滴度的分枝杆菌噬菌体Chy3对人气道上皮细胞16HBE生长及功能的影响.方法:不同滴度噬菌体Chy3作用于人气道上皮细胞后,采用倒置显微镜观察细胞生长形态变化,CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,ELISA法检测细胞上清液中细胞因子分泌水平,RT-PCR和Western blot分别检测上皮细胞黏蛋白MUC5AC mRNA和蛋白表达水平.结果:不同滴度噬菌体Chy3作用于人气道上皮细胞一段时候后,细胞的生长形态、存活率、凋亡率、细胞因子分泌水平以及黏蛋白MUC5AC表达与正常组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:分枝杆菌噬菌体Chy3无论高低滴度对体外培养人气道上皮细胞生长和功能均无明显影响,有较好的安全性.
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核转录因子κB在TNF-α诱导人气道上皮细胞hBD-2表达中的作用
目的观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导人气道上皮细胞人β防御素-2(hBD-2)的表达及核转录因子κB(NF-κB)在hBD-2表达中的作用.方法用TNF-α和或NF-κB抑制剂PDTC处理体外培养人气道原代上皮细胞,RT-PCR法检测hBD-2 mRNA的表达,Western blot检测细胞质IκB-α蛋白活性变化,凝胶迁移试验(EMSA)检测不同时相NF-κB活性的变化.结果TNF-α刺激0.5 h后可见人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达,并呈时间依赖性;PDTC可抑制hBD-2mRNA表达;NF-κB在TNF-α刺激1 h后明显活化,抗体超迁移率实验结果显示p65-p50异型二聚体NF-κB参与了NF-κB的活化.结论一定剂量的TNF-α可诱导人气道上皮细胞hBD-2 mRNA表达,NF-κB在TNF-α诱导气道上皮细胞hBD-2mRNA起重要的调控作用.
