免疫组化技术(五)

3.6 免疫金银染色法(IGSS) Faulk和Taylor在1971年引进了胶体金,并以此作为免疫组化标记.胶体金能用于直接和间接法,而且在超微免疫定位上具有广泛用途,但在光镜的免疫组化中未被广泛使用.

华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子的分子生物学及免疫学定位研究

目的 由华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选重要新基因并进行功能基因研究.方法 生物信息学、基因克隆表达技术、免疫识别、S-P免疫组化等方法.结果 由华支睾吸虫成虫cDNA文库成功分离到了CsRPEF(RNA聚合酶Ⅱ延长因子)基因.通过BLASTX程序同源性比对,显示CsRPEF基因与小鼠和人类的RPEF基因同源性为82%.成功构建了CsRPEF原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行了大规模诱导表达,所表达的GST融合蛋白经蛋白酶原切割后获得CsRPEF重组蛋白.凝胶扫描分析和Bradford法显示,CsRPEF重组蛋白的纯度和浓度分别为85%和(0.73±0.02) mg/ml.将CsRPEF重组蛋白接种至BALB/c小鼠进行免疫实验.间接ELISA法显示免疫小鼠抗体滴度达1∶150.免疫识别结果显示此抗体可识别20 ku CsRPEF重组蛋白和华支睾吸虫20 ku虫源性蛋白.S-P免疫组化方法显示CsRPEF主要定位于华支睾吸虫成虫的表皮、皮下组织和虫卵三部位.CsRPEF新基因序列GenBank的登录号为EU232119.结论 CsRPEF基因是防治华支睾吸虫病生物药物研发的重要靶点.

交感神经系统与骨代谢调节

以往认为骨代谢的调节仅涉及骨局部的自分泌、旁分泌以及内分泌等因素.然而,越来越多的研究指出除了上述三者之外,交感神经系统(sympathetic nervous system,SNS)在骨形成和骨吸收过程中也发挥关键的作用[1-2].本文就有关SNS对骨代谢调节的作用做一综述.一、交感神经支配与肾上腺素能受体SNS对骨组织和骨细胞的神经支配是其调控骨代谢的组织解剖学基础.SNS是自主神经系统的重要组成部分,广泛分布于外周组织器官,其由外周逆行向脊髓、脑干,后投射于下丘脑核和非下丘脑核.组织学研究发现骨外膜、骨小梁及骨髓中均分布有交感和感觉神经纤维.免疫定位和电镜观察显示,神经纤维在生长板和长骨的干骺段分布多、密度大,并在骨小梁周围的血管附近形成一个紧密的连接网络[3].

小鼠胚卵石蜡切片及免疫组织化学染色方法

石蜡切片法是科研与教学工作中的一种常用实验技术,在细胞生物学、组织胚胎学及病理学中应用甚广[1].对于一般肉眼可见的较大组织标本来说,此项技术操作简便 ,标本能够长期保存.胚卵标本是研究人与动物胚胎发生发育过程中必须观察的标本,尤其是植入前的早期胚卵,对研究胚体早期发育的影响因素至关重要.本文对原有的胚卵切片技术进行了改进,为进一步研究人与动物的早期胚卵发育及其影响等诸因素提供了新的技术方法.已有研究表明层粘连蛋白(laminin,LN)在胚胎粘附、着床过程中发挥重要作用[2,3].本实验利用植入前各阶段的早期胚卵,以单个胚卵石蜡包埋切片技术为手段 ,通过免疫组化染色研究LN在小鼠早期胚卵中的分布,摸索出一套特异性强的针对单个胚卵进行免疫组化染色的方法,为进一步研究LN在小鼠早期胚卵中的免疫定位及分布奠定了基础.

猪白血病抑制因子多克隆抗体的制备及其免疫定位

目的:构建猪LIF原核表达载体,表达并纯化重组猪LIF蛋白,制备兔抗猪LIF多克隆抗体并进行免疫定位.方法:根据GenBank中猪LIF cDNA基因序列扩增出目的基因片段,将扩增的片段克隆进PET-31b表达载体的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,经转化使其在大肠杆菌BL21中表达,产生重组猪LIF蛋白,纯化后作为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;经ELISA和Western blotting分析鉴定抗体的效价和特异性;后利用所制备的抗体进行LIF蛋白在猪体内的免疫定位.结果:酶切和DNA测序显示,所构建的原核表达质粒PET-31b-mpLIF含有编码成熟型猪LIF蛋白的cDNA序列;表达结果显示,诱导样品在相对分子质量约20 000的位置上有明显的增强表达条带;纯化结果显示,重组蛋白在相对分子质量约20 000的位置上有一条清晰、单一的条带;通过免疫新西兰大白兔,获得了特异性较高、效价达1:10 000的多克隆抗体;应用该抗体进行的免疫定位显示,LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达.结论:重组猪LIF蛋白在大肠杆菌中进行了高效、正确表达;得到了效价较高、特异性较强的多克隆抗体;LIF蛋白在心肌细胞、脾索和脾被膜的单层上皮细胞、肺成纤维细胞中有弱表达.

NBC1在大鼠生后胰腺发育中的表达

目的:研究碳酸氢钠协同转运栽体(NBCl)在大鼠生后胰腺发育过程中的表达变化及细胞定位.方法:采用RT-PCR和Westem blot分别检测了NBC1核酸和蛋白在新生(PO)、P7、P14、P21和成年时期胰腺的表达情况,用Double fluorescence immunohistochemistry 分析了NBC1在P7、P14和成年时期腺泡和β细胞的定位表达.结果:在大鼠胰腺生后发育过程中,NBC1核酸、蛋白在P14时特异高表达,而在P7和成年低;在腺泡基底侧膜和β细胞膜有阳性信号,且在成年胰腺中β细胞膜阳性信号较腺泡基底侧膜强.结论:NBC1在生后发育重塑旺盛期特异高表达,而在凋亡旺盛期和成年期表达低.与腺泡细胞相比在成年期NBC1更集中于β细胞.提示NBC1在胰腺生后发育过程中不仅与胰岛结构重塑而且与胰腺功能发挥相关.

大鼠胚胎发育期NBC1在胰腺的表达与定位

目的:探讨碳酸氢钠协同转运载体(NBC1)在大鼠胰腺胚胎发育期不同阶段核酸、蛋白水平的动态变化以及在腺泡和β细胞的定位表达.方法:采用高密度寡核苷酸芯片对孕125d (E12.5)、E15.5、E18.5、新生和成年胰腺进行基因转录水平分析,用RT-PCR和Western blot分别验证了NBC1核酸和蛋白在E15.5、E18.5、新生和成年时期胰腺中的表达情况,用Double fluores-cence immunohistochemistry分析了NBC1在E18.5、新生和成年时期胰腺腺泡和β细胞的定位表达.结果:在大鼠胰腺胚胎发育过程中,NBC1核酸、蛋白在E18.5时特异高表达,新生下降直至成年低；在腺泡基底侧膜和β细胞膜有强烈的阳性信号,且在成年胰腺中8细胞膜阳性信号较腺泡基底侧膜强.NBC1的表达变化与其功能近似基因的表达趋势相反,而与其协同发挥作用的基因及胰腺特异基因的表达趋势一致.结论:NBC1在胰腺发育过程中不仅与结构形成而且与功能发挥相关.

MMP-26在子宫内膜瘤和子宫内膜癌中的表达的研究

基质金属蛋白酶家族在肿瘤细胞的浸润、发生和生长过程中起着非常重要的作用.本研究通过用免疫组化的方法对MMP-26在子宫内膜癌和子宫内膜肿瘤的整个月经周期中的分布与定位以及对MMP-26与子宫内膜瘤各亚型、分期和级别之间的关系进行了研究.研究发现,MMP-26在子宫内膜癌和子宫内膜瘤月经周期的不同阶段均有表达.而且,在绝经后,MMP-26在子宫内膜癌中的表达强于子宫内膜瘤中的表达,而不是在月经周期的分泌期.MMP-26在子宫内膜上皮细胞中的表达强,其次是血管上皮细胞,子宫肌层的平滑肌细胞和子宫内膜基质细胞.并且随着肿瘤的浸润深度和根据FIGO划分的肿瘤级别的升高MMP-26的表达增强.所以,MMP-26在子宫内膜和子宫内膜癌中的分布与表达说明MMP-26在子宫内膜肿瘤的发生上起着非常重要的作用.

114曼氏血吸虫磷酸果糖激酶:在体被中的免疫定位和免疫原性

日本血吸虫钙蛋白酶基因的原核表达及功能分析

目的 克隆表达日本血吸虫钙蛋白酶(Sjcalpain),了解Sjcalpain在尾蚴内的分布及其在尾蚴侵染中的作用. 方法 根据SjCalpain基因全序列(GenBank登录号为AB016726)设计引物,PCR分别扩增Sjcalpain的催化位点区域和Ca2+结合位点区域的基因片段,克隆入pET-28a原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli) BL21 (DE3)中进行原核表达,组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白表达和纯化情况.纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔多克隆抗体,ELISA和蛋白质印迹(Western blotting)分别检测多克隆抗体的效价和特异性.利用免疫荧光定位技术观察Sjcalpain在尾蚴组织中的分布情况.将尾蚴和钙蛋白酶抑制剂孵育后感染小鼠,计算血吸虫减虫率. 结果 成功构建了Sjcalpain的催化位点/pET-28a和Ca2+结合位点/pET-28a原核表达重组质粒,在E.coli BL21 (DE3)中成功表达目的蛋白,相对分子质量(Mr)约为43 000和39 000,与预期大小一致,且均为包涵体表达.组氨酸标签亲和层析成功纯化得到目的重组蛋白.间接ELISA结果显示,多克隆抗体的效价超过1∶80 000.免疫定位结果显示,Sjcalpain在日本血吸虫尾蚴头部分布较多.尾蚴侵染抑制实验中,钙蛋白酶抑制剂作用组平均获虫19条,对照组平均获虫23条,减虫率为17.4％. 结论 Sjcalpain蛋白产物主要分布在日本血吸虫尾蚴的头部;Sjcalpain被抑制后可以减少入侵宿主的尾蚴数量,说明Sjcalpain在尾蚴感染宿主皮肤过程中发挥一定的作用.

日本血吸虫硫氧还蛋白-1的克隆、表达和功能分析

目的 克隆、表达日本血吸虫硫氧还蛋白-1(SjTrx-1)编码基因,测定重组SjTrx-1蛋白的酶催化活性,分析SjTrx-1基因在血吸虫不同发育阶段的转录本差异,观察其在日本血吸虫成虫体内的组织分布情况. 方法 从日本血吸虫cDNA文库中挑选SjTrx-1的基因序列,应用PCR技术对目的片段进行体外扩增,并克隆人原核表达载体pET28a,重组质粒转化E.coli BL21 (DE3)细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物,二硫苏糖醇(DTT)/胰岛素还原法测定重组SjTrx-1蛋白的酶催化活性.纯化的重组SjTrx-1蛋白免疫新西兰白兔,以制备的免疫兔血清作为抗体,应用免疫荧光定位技术检测SjTrx-1在日本血吸虫成虫体内的分布情况.制备日本血吸虫各虫期的总RNA样品,利用RT-PCR方法扩增目的片段,分析SjTrx-1基因在各发育阶段的转录本丰度. 结果 构建了重组表达载体SjTrx-1/pET28a,在E coli中实现了重组SjTrx-1蛋白的可溶表达,其相对分子质量(Mr)约为38000,与预测的融合蛋白大小相符.经组氨酸标签亲和层析法获得纯化重组蛋白SjTrx-1,并测定了其体外的酶催化活性.虫期转录特异性分析显示,该基因在各个虫期均存在转录,其中胞蚴、童虫和成虫阶段的丰度较高,毛蚴和尾蚴中含量相对较低.荧光定位结果显示,SjTrx-1蛋白在虫体内分布广泛,且无组织特异性. 结论 SjTrx-1在日本血吸虫虫体内分布广泛,在胞蚴、童虫和成虫阶段的丰度较高.

日本血吸虫FKBP12基因的克隆及其免疫组织定位

目的克隆日本血吸虫(Sj)FKBP12基因全长cDNA,并进行免疫组织定位.方法从成虫RNA中RT-PCR扩增SjFKBP12基因完整的编码阅读框后,将其分别克隆入pGEX-4T-1和pEGFP-N1载体中;DNA免疫后制备抗血清,间接免疫荧光法对FKBP12进行组织定位.结果将SjFKBP12基因成功克隆入pGEX-4T-1和pEGFP-N1载体中;FKBP12定位于Sj成虫的被膜上.结论成功克隆了SjFKBP12基因,并对FKBP12蛋白在Sj成虫中进行组织定位,为将其进行疫苗等研究打下了基础.

日本血吸虫TOM34基因的克隆和表达分析

目的 克隆、表达日本血吸虫线粒体外膜转运酶34基因(SjTOM34),并对其生物特性进行初步研究.方法 应用RT-PCR方法从42 d日本血吸虫成虫cDNA中扩增SjTOM34基因,并进行生物信息学分析.应用实时定量RT-PCR方法分析了SjTOM34基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达状况.构建了SjTOM34基因重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达,Western blotting分析了重组抗原的免疫原性及该蛋白在不同发育阶段虫体中的表达情况,利用免疫组化方法观察了该蛋白在虫体内的分布情况.结果 获得了SjTOM34的基因序列,其开放阅读框(ORF)为1 083 bp.该基因在所检测的不同发育阶段童虫和成虫中均有表达,其中在35 d虫体中的表达量略高于其他时期的虫体.成功构建了重组的原核表达质粒并且在大肠杆菌中获得表达,重组蛋白在上清和沉淀中都有存在,并且具有较好的免疫原性,在所检测的各时期虫体中均可检测到该蛋白的存在,并且主要分布在虫体的实质组织中.结论 获得了日本血吸虫SjTOM34基因,初步明确了该基因在日本血吸虫童虫和成虫中的表达情况,及在成虫中的分布.

ELF3多克隆抗体的制备及其免疫定位

目的 制备并鉴定兔抗小鼠胚肝血影蛋白3(embryonic liver fodrin 3,ELF3)的多克隆抗体,并探讨其在部分小鼠组织中的免疫定位.方法 合成ELF3氨基端特异性多肽片段,连接载体蛋白钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin,KLH),免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,用ELISA方法 检测抗体效价,Western blot和免疫组织化学方法 检测抗体特异性及在小鼠组织中的表达情况.结果合成ELF3特异性多肽,并连接KLH后免疫实验兔,制备得到兔抗小鼠ELF3多克隆抗体,ELISA及Western blot检测结果显示此抗体效价及特异性高;Western blot和免疫组织化学检测结果显示ELF3在心、肝、肾组织中表达,尤其是细胞膜上表达明显.结论 本实验成功制备ELF3多克隆抗体,并证实ELF3在小鼠心、肝、肾组织细胞膜表达明显,这将为ELF3功能研究提供有力的工具.

华支睾吸虫颗粒蛋白在虫体及宿主中的表达

目的 探讨华支睾吸虫颗粒蛋白(CsGRN)在虫体和宿主中的表达.方法 使用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测华支睾吸虫成虫、囊蚴和虫卵及猫的肝脏、胆管组织和全血CsGRN基因mRNA表达水平;免疫组化检测CsGRN在成虫及宿主猫、人和实验感染的Balb/c小鼠肝脏中的定位.结果 CsGRN基因mRNA在虫体的各阶段都有表达,在感染的猫肝和胆管组织中高表达;CsGRN主要定位在成虫的睾丸、外膜和虫卵,在宿主人、猫和小鼠中主要分布在胆管上皮和肝细胞.结论 CsGRN可能参与虫体的生长发育,它作为分泌排泄抗原之一可能损害肝胆管组织,有进一步研究价值.

阴道毛滴虫两个Sir2同源基因的克隆和功能

目的 探讨寄生性原虫阴道毛滴虫细胞生长和衰老的相关基因.方法 从阴道毛滴虫的cDNA表达文库中分离出两个与酵母沉寂信息调节因子 (Sir2) 有较高同源性的cDNA克隆,分别命名为TvSir2和TvSir2-like,它们的编码框分别长915 bp和1116 bp.结果 序列分析显示这两个cDNA克隆与酵母Sir2同源性很高,其氨基酸序列中含有Sk2p及其同源蛋白三个特征性保守结构域.分别从这两株cDNA克隆中扩增出表达片段植入表达载体pET-41a,转化宿主菌E.coli BL21并用IPTG(isoprupylthio-β-D-galactoside)诱导表达到大量融合蛋白.用亲和层析法纯化的融合蛋白分别免疫豚鼠,获得的抗血清用Western-blot法识别到滴虫虫体全蛋白中大小为34 000 Mr和42 000 Mr的条带.免疫荧光法检测TvSir2和TvSir2-like蛋白位于细胞核外的内质网和高尔基复合体区域.结论 TvSir2和TvSir2-like克隆是酵酶Sir2的同源基因,为TvSir2和TvSir2-like在模式生物阴道毛滴虫的功能研究奠定了基础.

EOLA1多克隆抗体的制备及免疫定位

目的:制备兔抗人内皮高表达脂多糖相关因子1( EOLA1)多克隆抗体,探讨其在部分人体恶性肿瘤组织中的免疫定位.方法:构建重组质粒,转化大肠杆菌及诱导表达,抽提目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,免疫组织化学法检测EOLA1在部分人体恶性肿瘤组织中的表达.结果:成功制备重组质粒在大肠杆菌中表达人EOLAI蛋白,免疫家兔制备得到兔抗EOLA1多克隆抗体,免疫组织化学法检测显示EOLA1蛋白在乳腺癌组织癌细胞胞浆中有表达.结论:成功制备EOLA1多克隆抗体,证实EOLA1蛋白在乳腺癌组织癌细胞胞浆中有表达.