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日本血吸虫核糖体蛋白SjRibosomal_L18a及其B细胞表位的筛选和评价
目的 筛选获得日本血吸虫(Schistosoma japonicum)核糖体蛋白(SjRibosomal_L18a)编码基因,预测其B细胞表位.克隆、表达重组蛋白SjRibosomal_L18a,并比较分析其与合成的B细胞表位的潜在诊断价值. 方法 利用B细胞表位预测软件筛选日本血吸虫蛋白质序列,获取函数打分值较高且抗原表位片段多的免疫原性蛋白,合成B细胞表位片段.生物信息学方法分析免疫原性蛋白基因及其编码蛋白的相对分子质量(M3、等电点、亲水性、信号肽、跨膜区和功能结构域等理化性质.制备日本血吸虫各虫期阶段总RNA,逆转录PCR (RT-PCR)扩增目的基因,分析各虫期转录本丰度.将扩增产物克隆至原核表达载体pET-28a中,重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coli)BI21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸标记亲和层析法纯化重组蛋白.ELISA法比较分析重组蛋白和合成的B细胞表位的潜在诊断价值. 结果 预测软件筛选出免疫原性核糖体蛋白SjRibosomal_L18a以及2个B细胞表位(P1和P2).SjRibosomal_L18a基因开放阅读框(ORF)由531个碱基组成,编码176个氨基酸,不含跨膜区和信号肽,为Mr20 741,等电点为11.12.RT-PCR结果显示,各虫期均检测到SjRibosomal_L18a的转录本,且转录水平均较高.成功构建重组表达质粒SjRibosomal_L18a/pET-28a,诱导表达获得包涵体形式的重组蛋白,约为Mr26 069.ELISA检测结果显示,重组蛋白、P1和P2检测15份慢性血吸虫病患者血清和15份健康人血清的敏感性和特异性分别为53.3％ (8/15)和100％ (15/15)、60％ (9/15)和100％ (15/15)、73.3％ (11/15)和100％ (15/15). 结论 获得重组蛋白SjRibosomal_L18a及其免疫原性较高的表位片段P1、P2,P1和P2用于血清诊断的敏感性均高于重组蛋白.
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日本血吸虫硫氧还蛋白-1的克隆、表达和功能分析
目的 克隆、表达日本血吸虫硫氧还蛋白-1(SjTrx-1)编码基因,测定重组SjTrx-1蛋白的酶催化活性,分析SjTrx-1基因在血吸虫不同发育阶段的转录本差异,观察其在日本血吸虫成虫体内的组织分布情况. 方法 从日本血吸虫cDNA文库中挑选SjTrx-1的基因序列,应用PCR技术对目的片段进行体外扩增,并克隆人原核表达载体pET28a,重组质粒转化E.coli BL21 (DE3)细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物,二硫苏糖醇(DTT)/胰岛素还原法测定重组SjTrx-1蛋白的酶催化活性.纯化的重组SjTrx-1蛋白免疫新西兰白兔,以制备的免疫兔血清作为抗体,应用免疫荧光定位技术检测SjTrx-1在日本血吸虫成虫体内的分布情况.制备日本血吸虫各虫期的总RNA样品,利用RT-PCR方法扩增目的片段,分析SjTrx-1基因在各发育阶段的转录本丰度. 结果 构建了重组表达载体SjTrx-1/pET28a,在E coli中实现了重组SjTrx-1蛋白的可溶表达,其相对分子质量(Mr)约为38000,与预测的融合蛋白大小相符.经组氨酸标签亲和层析法获得纯化重组蛋白SjTrx-1,并测定了其体外的酶催化活性.虫期转录特异性分析显示,该基因在各个虫期均存在转录,其中胞蚴、童虫和成虫阶段的丰度较高,毛蚴和尾蚴中含量相对较低.荧光定位结果显示,SjTrx-1蛋白在虫体内分布广泛,且无组织特异性. 结论 SjTrx-1在日本血吸虫虫体内分布广泛,在胞蚴、童虫和成虫阶段的丰度较高.
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日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白基因的克隆表达及鉴定
目的 克隆、表达日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白(SjTollip)基因,并研究该基因在日本血吸虫各虫期的转录表达情况.方法 从日本血吸虫cDNA文库中挑出Toll样受体相互作用蛋白基因进行体外扩增,并克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物.制备日本血吸虫各虫期阶段总RNA和重组SjTollip蛋白免疫新西兰白兔的免疫兔血清,利用RT-PCR和蛋白质免疫印迹分析SjTollip基因在日本血吸虫各期转录表达的差异及重组SjTollip蛋白的免疫原性.结果 构建了重组原核表达载体SjTollip/pET-28a,诱导获得以包涵体形式表达的不可溶重组蛋白,相对分子质量约为24000,与预测的融合蛋白相对分子质量相符.纯化后的重组蛋白rSjTollip可被日本血吸虫感染兔血清识别.虫期转录特异性分析显示,该基因在尾蚴和雄虫中转录水平较低.免疫印迹分析结果显示,在虫卵、尾蚴、童虫、雄虫、雌虫各发育阶段都检测到该蛋白,但童虫和雌虫中表达水平明显升高.结论 SjTollip基因在日本血吸虫各发育阶段转录表达水平有较大差异,其有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点.
