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日本血吸虫新基因精氨酸酶的扩增及序列分析
目的获取并真核克隆日本血吸虫新基因精氨酸酶全长cDNA.方法对本实验室曾获得精氨酸酶基因利用生物信息学进行分析,发现其5'端尚缺一段序列;根据已知序列设计引物,用5'端单巢式PCR从尾蚴文库中扩增,以获得精氨酸酶基因完整的阅读框(ORF);用生物信息学技术对获得的精氨酸酶编码基因进行结构与功能的分析;并将新基因的完整编码阅读框克隆入真核表达载体pCDNA3.1.结果用5'端单巢式PCR从尾蚴文库中获得了精氨酸酶5'端所缺序列,得到其完整的ORF,其ORF长1 095 bp,编码364个氨基酸.利用生物信息学技术鉴定其为日本血吸虫精氨酸酶的完整cDNA序列.重组质粒经双酶切DCR及测序鉴定证明日本血吸虫精氨酸酶真核表达质粒构建成功.结论成功获得、识别、扩增并克隆日本血吸虫精氨酸酶编码基因的全长cDNA.
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日本血吸虫p 50亲免素基因克隆、表达及纯化
目的扩增、原核克隆和表达日本血吸虫(Sj)p50亲免素基因全长cDNA,并进行表达产物的纯化.方法从成虫RNA中RT-PCR扩增Sjp50亲免素基因完整的编码阅读框后,将其克隆入pET 30 a(+)原核表达载体中,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导高表达后用亲和层析柱对表达产物进行纯化.结果将Sjp50亲免素基因成功克隆入pET 30 a(+)表达载体中;诱导表达并成功纯化出重组Sjp50亲免素蛋白.结论成功克隆Sjp50亲免素基因,并表达和纯化得到了p50亲免素蛋白,为研究Sjp50亲免素的功能及其进行疫苗等研究奠定了基础.
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日本血吸虫FKBP12基因的原核克隆表达及表达产物的纯化
目的扩增、原核克隆和表达日本血吸虫(Sj)FKBP12基因全长cDNA,并进行表达产物的纯化.方法从成虫RNA中RT-PCR扩增Sj FKBP12基因完整的编码阅读框后,将其克隆入pGEX-4T-1原核表达载体中,IPTG诱导高表达后用亲和层析柱对表达产物进行纯化.结果将SjFKBP12基因成功克隆入pGEX-4T-1表达载体中;诱导表达并成功纯化出重组FKBP12蛋白.结论成功克隆了Sj FKBP12基因,并表达和纯化得到了FKBP12蛋白,为研究FKBP12的功能及其进行疫苗等研究奠定了基础.
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日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(SjC FABP)核酸疫苗诱导小鼠免疫保护作用研究
目的研究日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白分子(SjC FABP)核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护性作用.方法根据SjC21.7分子基因序列合成1对特异性引物P1和P2,并使其5′端分别带有BamH1、Xho1的酶切位点序列,采用PCR方法从重组质粒SjC FABP-pUC19中扩增出特异性目的基因的开放阅读框序列,并在其翻译起始密码子处引入Kozark序列.限制性酶切后的基因片段被亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中,构建成重组真核表达质粒SjC FABP- pcDNA3.1,大量制备纯化的重组真核表达质粒.48只BALB/c小鼠分为对照组、实验组、加强组.对照组每只小鼠的股四头肌注射接种100 μg质粒pcDNA3.1 DNA,实验组以同样的方式注射100 μg重组质粒SjC FABP-pcDNA3.1 DNA,加强组除注射100 μg重组质粒SjC FABP-pcDNA3.1 DNA外,同时注射P35-pcDNA3.1,P40-pcDNA重组质粒各100 μg.每隔2周免疫1次,共免疫3次.第3次免疫后的第30天每只小鼠经腹部皮肤感染(45±1)条尾蚴,45 d后剖杀,计数各组小鼠肝虫卵数及成虫数.于免疫前及末次免疫后2周分别经尾静脉采血,测定抗体水平.在第2次免疫后第10天各组取2只小鼠处死,取股四头肌进行免疫组化分析.结果免疫组化分析显示实验组及加强组小鼠局部组织有特异性抗原蛋白表达.ELISA分析,免疫后实验组13只小鼠有8只出现特异性IgG抗体,而加强组14只小鼠有6只出现特异性抗体.与对照组相比,实验组获得33.80%的减虫率,10.87%减卵率;加强组获得了31.76%的减虫率,29.97%的减卵率.加强组的减卵率明显高于实验组,差异有显著性(P<0.05).结论 SjC FABP核酸疫苗能诱导BLAB/c小鼠产生一定水平抗血吸虫感染保护性作用.
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日本血吸虫FKBP12基因的克隆及其免疫组织定位
目的克隆日本血吸虫(Sj)FKBP12基因全长cDNA,并进行免疫组织定位.方法从成虫RNA中RT-PCR扩增SjFKBP12基因完整的编码阅读框后,将其分别克隆入pGEX-4T-1和pEGFP-N1载体中;DNA免疫后制备抗血清,间接免疫荧光法对FKBP12进行组织定位.结果将SjFKBP12基因成功克隆入pGEX-4T-1和pEGFP-N1载体中;FKBP12定位于Sj成虫的被膜上.结论成功克隆了SjFKBP12基因,并对FKBP12蛋白在Sj成虫中进行组织定位,为将其进行疫苗等研究打下了基础.
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日本血吸虫p50亲免素基因的扩增及其免疫学特性
目的扩增日本血吸虫(Sj)p50亲免素(IP)基因全长cDNA和DNA序列,进行原核克隆和研究其免疫学特性.方法从Sj成虫RNA中RT-PCR扩增Sjp50亲免素基因完整的编码阅读框,从Sj成虫基因组中扩增其DNA序列,对其cDNA序列和DNA序列进行比较分析,寻找内含子.将其cDNA序列克隆入pET30a(+)体中,原核表达并纯化表达产物,Western-blot比较重组蛋白与Sj体内相应天然蛋白的免疫原性和免疫反应性,间接免疫荧光法对p50亲免素进行组织定位.结果Sjp50IP基因DNA序列与cDNA相比,有6个内含子;重组p50IP与Sj体内的天然蛋白具有相同的免疫学特性,该蛋白位于Sj成虫的被膜上.结论成功扩增得到了Sjp50IP基因的全长编码区的cDNA序列和DNA序列,其DNA序列中有6个内含子;重组Sjp50IP的免疫学特性支持将该基因作为疫苗进行进一步的研究.
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日本血吸虫亲免素基因的扩增及序列分析
[目的]研究日本血吸虫亲免素基因编码序列的结构及进行初步的功能预测.[方法]用5'端和3'端锚定PCR从尾蚴文库中扩增,以获取日本血吸虫中国大陆株亲免素基因完整的开放阅读框(open readingframe,ORF);用生物信息学技术确认其是否为亲免素编码基因并进行结构功能的初步分析和预测.[结果]用5'端和3'端锚定PCR从尾蚴文库中获得了亲免素基因5'端和3'端所缺序列,得到的亲免素基因cDNA的总序列长为1 438 bp,其ORF长1 296 bp,编码431个氨基酸.利用生物信息学技术鉴定其为日本血吸虫亲免素基因的完整cDNA序列.并用RT-PCR从日本血吸虫尾蚴mRNA扩增出亲免素基因的ORF.[结论]成功获得了日本血吸虫亲免素编码基因的全长cDNA,为进一步的功能研究打下了基础.
