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血管生长素与治疗性血管生成的研究进展
血管生长素(angiogenin,ANG) 是一种分泌性的单链碱性蛋白质,由123个氨基酸组成,分子量为14.4kD,广泛分布在人体中.ANG属于核糖核酸酶超家族中的一员,具有低核糖核酸酶活性.研究证实,ANG是一种有效的促血管生成因子,参与血管生成的各个阶段,是其它血管生成因子诱导新血管生成的枢纽,在缺血性疾病的治疗方面显示出巨大的潜能.本文对ANG在治疗性血管生成方面的研究进展作一综述.
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血管生长素促血管生成机制及其与疾病关系的研究进展
血管生长素(angiogenin,ANG)是一种促使新血管生成的诱导剂,它属于核糖核酸酶超家族中的一员.ANG蛋白含123个氨基酸,相对分子量为14.4kD,在肿瘤细胞中首先发现,也存在于正常细胞中,可由多种细胞分泌,其核糖核酸酶活性较弱.研究证实,ANG可以在细胞间及细胞内发挥促血管生长作用.ANG与缺血性疾病、肿瘤、及其它疾病的关系已见不少报道.本文简述ANG促血管生成作用机制及其与疾病的关系.
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血管生成素-1与炎症关系的研究进展
1 引言人类内皮细胞平均总面积超过1000 m2,约为表皮总面积的600倍,广泛分布于血管腔内侧面,组成了一层较为稳定的屏障将血液与内皮下组织分隔开来.近的研究显示,血管内皮细胞在炎症过程中发挥着重要的作用,它可调节血管的通透性,影响炎症细胞的局部浸润.在炎症反应过程中,随着血管内皮细胞的激活,表面黏附分子的表达增加,炎症细胞附壁、移行,激活的内皮细胞通过氧自由基、钙离子超载等因素加重局部的损伤和炎症反应.炎症反应在许多疾病的发生、发展过程中发挥着重要的作用,人们很早就认识到类风湿性关节炎、急性肺损伤、银屑病等疾病与炎症反应密切相关.在动脉粥样硬化的进程中炎症反应也发挥着重要的作用.通过抑制炎症反应来减少组织器官损伤、控制疾病的进程一直是一种有效的治疗策略.血管生成素-1(Angiopoietin-1,Ang-1)是血管生长素家族成员之一,它可通过激活其受体酪氨酸激酶Tie-2抑制内皮细胞凋亡、促进内皮细胞生存,并促进内皮细胞出芽及迁移,稳定血管.越来越多的实验表明Ang-1在干预内皮细胞的炎症反应中发挥着重要作用.本文根据目前的研究现状,对Ang-1在炎症反应中的作用及其机理做一简要综述.
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血管生长素与超声心动图对冠心病心衰患者诊断的一致性研究
目的 探索冠心病患者进展为心力衰竭过程中,血浆血管生长素(ANG)水平与超声心动图表现的变化情况,以及二者对冠心病合并心衰的诊断效能.方法 选取2013年10月到2014年10月在复旦大学附属中山医院诊断为冠心病患者56例,其中25例合并慢性心力衰竭,其余31例为非心衰患者.对其进行血浆ANG浓度测定.并对这些患者心超报告进行分析,计算根据美国心脏超声协会即推荐16节段左心室室壁运动指数(LVWMI)积分.分析二者的相关性,并用受试者工作特征曲线(ROC)曲线评价二者对心衰诊断的作用.结果 单纯冠心病组与冠心病合并心衰组相比,N末端B型利钠肽(NT-proBNP)、ANG、LVWMI具有显著差异,两组ANG分别为(2905.0±741.6) pg/ml与(3977.6±963.2) pg/ml,LVWMI积分分别为1.989±0.383与1.361±0.274,二者与NT-proBNP均具有显著相关性(P＜ 0.01,Pearson相关检验).ANG与LVWMI对冠心病慢性心衰诊断的ROC曲线下面积分别为0.7935(95％可信区间0.66780～0.91930)、0.9168(95％可信区间0.84835～0.98520),二者合并后对冠心病心衰诊断的ROC曲线下面积为0.9200(0.84890～0.99110).结论 冠心病合并心衰患者血浆ANG水平较未合并心衰组显著升高,左心室节段收缩功能显著下降,二者是诊断冠心病合并心衰的良好指标.
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重组腺相关病毒介导的RNA干扰抑制血管生长素表达对肺腺癌细胞成瘤能力的影响
目的 通过腺相关病毒(AAV)介导的RNA干扰(RNAi)抑制肺腺癌细胞A549血管生长素(ANG)表达,观察其对癌细胞生长和成瘤能力的影响.方法 构建H1启动子驱动的表达针对ANG的小干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(AAV-shANG),转染A549细胞,同时以正常A549细胞以及转染AAV-Null的A549细胞作为对照,观察重组腺相关病毒介导的RNAi抑制ANG表达对A549细胞生长、致瘤、肿瘤细胞增殖、凋亡及肿瘤微血管密度的影响.用t检验分析各组间差别,所有数据均用x±s表示.结果 体外实验结果表明重组腺相关病毒AAV-shANG成功构建,重组腺相关病毒转染A549细胞72 h后ANG蛋白表达水平明显低于A549细胞组及AAV-Null组;转基因A549细胞细胞周期分析结果提示,正常A549细胞、AAV-Null转染细胞和AAV-shANG转染细胞的增殖指数(PI)分别为0.32±0.29、0.35±0.38和0.31±0.43,差异不明显.体内实验结果表明,AAV-shANG转染细胞组胸腺缺陷小鼠的成瘤体积、瘤质均明显低于两对照组.各组微血管密度分别为9.4±1.5、9.8±2.1和5.7±1.9,提示AAV-shANG转染细胞组与正常A549细胞和AAV-Null转染细胞组有明显差异.各组凋亡细胞的百分率分别为(7.7±3.1)%、(8.5±5.4)%和(17.1±8.6)%.AAV-shANG转染细胞组凋亡细胞的百分率明显高于正常A549细胞组和AAV-Null转染细胞组,各组细胞增殖核抗原(PCNA)阳性表达率分别为(84.8±9.7)%、(85.8±9.8)%、(70.4±10.1)%,AAV-shANG转染细胞组PCNA表达率低于两对照组.结论 AVV-siRNA表达能显著抑制肿瘤细胞ANG表达及肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长.
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血管生长素的差异表达对鉴别前列腺癌雄激素依赖性和非依赖性的临床意义的研究
目的:研究雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌中血管生长素(ANG)的差异性表达的临床意义,以了解雄激素非依赖性前列腺癌的发病机制.方法:研究时间为2013年7月至2015年7月,采用体外培养的方式分别培养雄激素依赖性(LNCaP细胞)和非依赖性(PC-3细胞)前列腺癌细胞株,并与正常健康人群进行对比;分别在细胞和组织水平上对ANG水平和表达情况进行分析归纳.结果:前列腺癌患者ANG阳性表达率显著高于正常健康人群(P＜0.05);雄激素依赖性前列腺癌患者各分期中ANG水平明显低于非依赖性患者,P＜0.05,统计学具有显著差异意义.结论:ANG在雄激素依赖性前列腺癌向非依赖性前列腺癌转化中具有主导作用,ANG可能成为肿瘤的标记物.
关键词： 雄激素依赖性前列腺癌 雄激素非依赖性前列腺癌 血管生长素 差异表达 -
基因重组人血管生长素衍生物Asp116His对缺血心肌再血管化的影响
在建立家兔心肌梗死模型的基础上,以基因重组人血管生长素衍生物Asp116His于缺血心肌边缘部作心肌多点注射.术后8～10天取注射点心肌切片作HE染色、VB染色及Ⅷ因子标记的免疫组化染色观察;术后18～20天,做非选择性冠脉造影.病理学检查,可见心肌间质内大量小血管结构,毛细血管明显增多,冠脉造影,示有侧支血管形成.本研究首次证实血管生长素衍生物Asp116His在心肌作用局部可引起明显新生血管形成,提示在心脏冠状血管内存在其有效作用位点.
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动脉注射血管生长素促进缺血肢体血管生长作用的研究
为研究重组人血管生长素(rhANG)动脉内注射对家兔缺血肢体血管生长的作用,制作家兔后肢缺血模型,于术后第11天经动脉内导管一次性注射不同剂量的rhANG.分别作肢体动脉造影、放射性核素血流及肢体肌肉毛细血管密度测定.结果发现,大剂量组、中剂量组与小剂量组和对照组相比,各项指标差别有非常显著性意义(P<0.01).提示动脉内注射rhANG对家兔缺血肢体血管生长有明显促进作用,并随ANG剂量增大而增大.
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重组腺病毒介导的血管生长素基因转染对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用
目的 观察重组腺病毒介导的血管生长素(ANG)基因转染对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织的作用.方法 制备重组血管生长素腺病毒(Ad-ANG,含绿色荧光蛋白基因)及重组绿色荧光蛋白腺病毒(Ad-GFP).清洁级雄性SD大鼠随机分成Ad-ANG治疗组和Ad-GFP对照组.线栓法制作脑缺血再灌注模型,缺血90min再灌24h后两组大鼠分别侧脑室注射Ad-GFP或Ad-ANG.Longa法观察两组大鼠神经功能缺失评分；于注射后1d、3d、7d和14d制备脑组织冰冻切片,观察脑内绿色荧光蛋白表达情况,并进行HE染色、vWF因子免疫组化染色、ANG免疫组化染色及细胞凋亡检测.结果 Ad-ANG治疗组在治疗后3d、7d神经功能缺失评分较Ad-GFP对照组有明显改善(P＜0.05)；两组大鼠侧脑室注射重组腺病毒后1d、3d时荧光显微镜下可见室管膜周围及脉络丛有较强的绿色荧光；HE染色可见Ad-ANG治疗组皮层神经元结构清晰,间质水肿、核同缩、核溶解程度较对照组明显减轻；ANG免疫组化结果显示Ad-ANG治疗组大鼠缺血脑组织ANG阳性细胞数在观察各时间点均显著高于Ad-GFP对照组(P＜0.01)；vWF染色及凋亡检测显示3d、7d、14d时Ad-ANG治疗组大鼠缺血侧脑内微血管密度显著高于Ad-GFP对照组(P＜0.01),凋亡细胞数显著少于Ad-GFP对照组(P＜0.05).结论 侧脑室注射方式转染Ad-ANG能使脑缺血大鼠脑内ANG阳性细胞数增加,并促使缺血脑区血管生成,减少神经元的凋亡,促进神经功能的恢复,对缺血再灌注损伤脑组织有保护作用.
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局灶性脑缺血大鼠脑内Angiogenin表达水平的变化
目的脑梗死患者存活时间与脑内血管增生程度相关.血管生长素(angiogenin)具有促血管生成作用.本研究旨在观察大鼠脑缺血后血管生长素在脑内表达水平的变化.方法大鼠大脑中动脉栓塞法(MCAO法)制作局灶性脑缺血模型,脑切片免疫组织化学染色检测血管生长素蛋白表达.结果血管生长素在正常大鼠脑中普遍弱阳性表达,脑膜、室管膜及血管染色较为明显.脑缺血后6h缺血脑区血管生长素表达水平明显增强(P＜0.01),缺血24h内血管生长素表达水平逐渐升高.结论脑缺血可诱导缺血脑区血管生长素蛋白表达增强.
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侧脑室注射重组人血管生长素对脑缺血再灌注大鼠的影响
目的 观察经大鼠侧脑室注射重组人血管生长素(Angiogenin,ANG)对脑缺血再灌注大鼠的影响.方法 线栓法制备大鼠腩缺血再灌注模型,大鼠随机分成4组:ANG治疗组、牛血清白蛋白对照组、MCAO对照组及假手术组,观察大鼠体重的变化,并于治疗3d后进行HE染色、细胞凋亡检测以及vWF因子免疫组织化学染色.结果 脑缺血再灌注3d后ANG治疗组大鼠与MCAO对照组及牛血清白蛋白对照组相比,体重显著降低(P<0.05),缺血脑区神经元变性、坏死、间质水肿以及胶质细胞增生程度减轻,凋亡阳性细胞数明显减少(P<0.05),微血管计数增加(P<0.05).结论 侧脑室注射ANG可改善脑缺血大鼠脑内间质水肿和神经元变性,降低凋亡细胞数量,增加微血管数量.ANG可降低脑缺血大鼠体重.
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血管生长素在前列腺癌和前列腺良性增生组织中的表达
目的 研究血管生长素(angiogenin,ANG)在前列腺癌和前列腺良性增生组织中的表达及其与前列腺癌生物学行为的关系.方法 采用免疫组化SP法对68例前列腺癌组织和38例前列腺良性增生组织标本ANG蛋白的表达进行检测,并对不同的年龄组、病理分级、临床分期之间的表达差异通过统计学分析进行比较.结果 免疫组化实验显示阳性染色为棕黄色和深棕色颗粒.ANG在前列腺癌组织中表达显著高于前列腺良性增生组织(P＜0.01).ANG表达随前列腺癌患者临床分期的升高而上调(P＜0.05);随着肿瘤组织Gleason病理分级的增加而呈升高趋势(P＜0.05);而在不同年龄组前列腺癌患者之间ANG表达无统计学差异(P＞0.05).结论 前列腺癌组织中ANG的表达在判断前列腺癌侵袭性、估计其预后中有一定意义.
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高表达血管生长素的自体骨髓基质细胞移植治疗猪缺血性心脏病
目的 将高表达血管生长素(ANG)的自体骨髓基质细胞移植于慢性心肌缺血猪模型,观察移植后血管新生程度及对心功能的影响.方法 建立猪慢性缺血性心脏病动物模型,随机分为3组:转染ANG重组腺病毒载体(Ad-ANG)的自体骨髓基质细胞移植组(组Ⅰ,n=11),单纯自体骨髓基质细胞移植组(组Ⅱ,n=10),注射无血清DMEM培养液的对照组(组Ⅲ,n=10).体外培养自体骨髓基质细胞,利用Ad-ANG转染培养细胞,用CM-DiI标记细胞,移植于模型猪心脏的缺血区域.观察指标包括:冠状动脉(冠脉)造影Rentrop分数及心脏射血分数、梗死区百分数、荧光显微镜下标记细胞、血管数量及ANG的表达和分泌.结果 与组Ⅱ及组Ⅲ相比,组Ⅰ冠脉造影Rentrop分数、心脏射血分数增高;缺血心肌区新生血管计数增高,可见大量CM-DiI标记的移植成活细胞,梗死区面积较小,ANG蛋白表达增高,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论 高表达ANG的自体骨髓基质细胞移植于慢性缺血心肌,移植细胞成活率高,能明显改善缺血心肌局部血运,改善心功能.
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重组腺相关病毒介导的RNAi抑制血管生长素表达对肺鳞癌细胞成瘤能力的影响
目的:通过腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的 RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制肺鳞癌细胞SK-MES-1的血管生长素(angiogenin,ANG)表达,观察其对癌细胞生长及成瘤能力的影响.方法:构建H1启动子驱动的表达针对ANG的小干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒AAV-shANG,转染SK-MES-1细胞;同时以正常SK-MES-1细胞以及转染AAV-Null的SK-MES-1细胞作为对照.培养72 h后,蛋白质印迹法检测3组细胞ANG 蛋白表达变化,并检测细胞周期.将以上3组细胞移植胸腺缺陷小鼠观察其生长和成瘤能力的变化,并进行微血管密度计数.结果:成功构建重组腺相关病毒AAV-shANG,转染SK-MES-1细胞后ANG蛋白表达水平为两对照组细胞的20%,细胞增殖指数未见差异.AAV-shANG转染细胞在胸腺缺陷小鼠中的成瘤体积、瘤质量和微血管密度均较两对照组细胞显著下降(P＜0.05).结论:腺相关病毒介导的shANG表达能有效抑制SK-MES-1细胞中ANG蛋白表达,抑制其成瘤能力,对肺鳞癌的治疗具有重要的意义.
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Ad.ANG体外转染骨髓基质细胞表达产物对血管内皮细胞生长的促进作用
目的:研究Ad.ANG转染骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的转染效率、产物表达和其表达产物的促血管内皮细胞生长作用.方法:体外培养扩增SD大鼠BMSCs,通过转染β-半乳糖苷酶基因评价腺病毒转染BMSCs的转染效率;通过Western印迹分析和ELISA检测血管生长素(ANG)在细胞内表达和细胞外分泌情况;通过细胞计数的方法研究转染Ad.ANG后的BMSCs培养上清的促内皮细胞生长作用.结果:腺病毒对于BMSCs具有很高的转染效率,转染倍数为50时,转染效率>95%,而且对细胞生长没有影响.Ad.ANG转染BMSCs后可以获得很高的表达水平,第7天达表达高峰[(1 086.808±83.301 pg/ml],15 d后仍可检测到蛋白表达.含有ANG的培养上清与对照组相比具有明显的促血管内皮细胞生长作用(P<0.01).结论:腺病毒可以安全、有效地转染BMSCs,其携带ANG基因可获得很高的瞬时表达水平,并能促进血管内皮细胞生长.
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人血管生长素衍生物的重组腺病毒制备
目的:构建并鉴定血管生长素(ANG)衍生物重组腺病毒,为心肌缺血区促血管生长因子基因转染研究作准备.方法:ANG衍生物D116H-ANG重组粘粒与腺病毒DNA末端肽复合物混合后以磷酸钙共沉淀法转染293人胚肾细胞株细胞.结果:酶切结果显示,重组粘粒中,D116H-ANG插入方向正确, 所获重组腺病毒带有ANG衍生物基因.结论:所获重组腺病毒为E1,E3缺陷型,可进一步用于基因治疗研究.
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基因重组人血管生长素衍生物Asp116His的原核表达
目的:在大肠杆菌内表达基因重组人血管生长素衍生物Asp116His(rhD116H-ANG)并恢复其天然活性.方法:采用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,重组构建pBV220/D116H-ANG表达载体,转化大肠杆菌TG1基因工程菌,温控表达,破菌提取包涵体,变性、溶解、纯化、复性、浓缩,以鸡胚绒毛尿囊膜法及RNA降解试验测活.结果:成功表达rhD116H-ANG,表达量约30%,经纯化、复性、测活,证实获得活性蛋白,并取得较高得率及复性效率.结论:本实验建立的原核表达体系是获取活性rhD116H-ANG的有效途径,为规模化制备奠定了技术基础.
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RNAi抑制食管癌TE-1细胞株血管生长素表达的实验研究
目的构建介导血管生长素(Angiogenin,ANG)短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA)表达的真核质粒载体,研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对食管癌细胞株TE-1中ANG表达的抑制作用.方法依据Tuschl等设计原则,以ANG为靶基因设计并合成有小发夹结构的两条DNA片段序列,经退火成互补双链,再克隆到载体pRNA-H1.1/Neo中构建重组质粒pRNA-H1.1/Neo-ANGahRNA.脂质体法转染重组质粒至食管癌TE-1细胞,以空质粒(pRNA-H1.1/Neo)转染为对照;半定量RT-PCR法及蛋白质印迹法分别观察TE-1细胞中ANG在核酸和蛋白水平表达量改变.结果①成功构建带ANG靶向的shRNA真核表达载体(pRNA-H1.1/Neo--ANGahRNA);②pRNA-H1.1/Neo-ANGahRNA转染TE-1细胞后,ANG在核酸和蛋白水平表达均较空载体pRNA-H1.1/Neo转染的对照组显著下降.结论成功构建真核表达质粒介导的ANG靶向RNA干扰重组质粒,转染TE-1细胞后能有效抑制ANG表达,为下一步利用RNAi技术抑制肿瘤血管形成以及局部侵袭和远处转移提供研究基础.
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心肌内注射转染血管生长素基因改善心肌梗死大鼠心功能的实验研究
目的 观察心肌内注射转染血管生长素基因对心肌梗死大鼠梗死面积、非梗死区心肌肥厚以及心功能的影响.方法 成年雄性Wistar大鼠,随机分为假手术组、MI-rAAV-lacZ组和MI-rAAV-ANG组.后2组以直视下结扎冠脉左前降支的方法建立心肌梗死模型,然后取rAAV-lacZ或rAAV-ANG载体在梗死区周围多点注射.1周和4周后分别测量心肌梗死面积.4周后超声心动图测量左室后壁厚度和左室射血分数(LVEF),颈动脉插管测量有创左室血流动力学指标.大鼠处死后左室称重,计算左室重量与体重比值.Western blot方法检测大鼠左室心肌组织ANG蛋白表达水平.结果 左前降支结扎1周时,MI-rAAV-lacZ组和MI-rAAV-ANG组大鼠梗死面积无明显差异.4周后,MI-rAAV-lacZ组大鼠梗死面积显著大于1周时,亦显著大于MI-rAAV-ANG组4周时.与假手术组相比,MI-rAAV-lacZ组大鼠左室后壁肥厚、左室重量增加.4周后,与MI-rAAV-lacZ组相比,MI-rAAV-ANG组左室心肌ANG蛋白表达显著增加,梗死区扩展程度减轻,后壁厚度和左室重量恢复至假手术组水平.与假手术组相比,所有心肌梗死大鼠4周后均表现出显著的左室功能不全,rAAV-ANG转染显著改善心肌梗死大鼠左室功能.结论 心肌内注射方式转染rAAV-ANG载体显著上调心肌梗死大鼠左室心肌ANG蛋白表达水平,抑制梗死区扩展和非梗死区肥厚,部分抑制心功能不全的发生发展.
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rAAV介导血管生长素基因转染改善心肌梗死大鼠左室重构
目的 观察腺相关病毒介导的血管生长素(ANG)基因转染对心肌梗死(MI)大鼠左室心肌组织ANG蛋白表达、毛细血管密度和左室重构的影响.方法 成年雄性Wistar大鼠,随机分为假手术组(sham-operation)、心肌梗死心肌内注射rAAV-lacZ组(MI-rAAV-lacZ)和心肌梗死心肌内注射rAAV-ANG组(MI-rAAV-ANG).直视下结扎冠状动脉左前降支建立MI模型,冠脉结扎后立即取rAAV-lacZ或rAAV-ANG梗死区周围四个点注射.四周后处死大鼠,左室称重,计算左室重量与体重比值.Western blot方法检测心肌组织ANG蛋白表达水平;免疫组化方法检测vWF表达以评价心肌组织毛细血管密度;组织学切片上测量非梗死区心肌细胞的横径和心肌间质纤维沉积指数.结果 与sham-operation组和MI-rAAV-lacZ组相比,MI-rAAV-ANG组大鼠左室心肌组织ANG水平显著升高;左室非梗死区毛细血管密度在MI-rAAV-lacZ组大鼠显著下降,而MI-rAAV-ANG组则与sham-operation组无显著差异;MI-rAAV-lacZ组大鼠表现出显著的左室非梗死区重构,包括左室重量增加、非梗死区心肌细胞横径增加、心肌间质纤维沉积增多,这些指标在MI-rAAV-ANG组与sham-operation组之间无显著差异.结论 用心肌内注射方式转染rAAV-ANG可显著上调MI大鼠左室心肌ANG蛋白表达,诱导新血管生成,改善MI后左室重构.
