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灯盏乙素对痴呆大鼠脑组织神经炎性反应的干预作用
目的:观察灯盏乙素对痴呆模型大鼠脑组织中几种炎性因子表达的影响,探讨其可能的抗炎治疗机制.方法:Wistar大鼠42只,随机分为5组,正常对照组、假手术组、学习记忆损伤模型组、灯盏乙素处理组和脑复康处理组.用双侧脑室注射β淀粉样蛋白(Aβ25-35)联合ip D-半乳糖方法建立痴呆大鼠模型；造模后次日分别用28 mg· kg-1灯盏乙素和365 mg·kg-1脑复康连续ig 20 d；实时定量聚合酶链法(RT-PCR)测定大鼠脑组织核因子(nuclear factor,NF)-κB p65表达的变化；免疫组织化学方法检测大鼠脑组织白介素-1β(IL-1β),白介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达.结果:与正常组和假手术组相比,模型组大鼠脑组织中NF-κB p65 mRNA表达水平上升了27％和31％ (P ＜0.05),IL-1β,IL-6,TNF-α表达的阳性细胞分值正常组(1.3±0.5,1.6±0.5,1.6±0.69)和假手术组(1.5±0.5,1.6±0.7,2.0±0.7).模型组明显上升(2.9±0.7,3.2±0.8,3.0 ±0.82),P＜0.05.灯盏乙素处理后NF-κB p65的mRNA表达水平下调了20％ (P ＜0.05),IL-1β,IL-6和TNF-α表达的阳性细胞分值明显下降(2.1±0.67,2.3±0.70,2.2±0.53),P＜0.05.结论:灯盏乙素可阻断痴呆大鼠脑组织中NF-κB p65的活化,抑制炎性因子释放,改善学习记忆能力,通过减轻神经炎症损伤起到神经保护的作用.
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粒细胞集落刺激因子改善阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆功能及抗炎作用机制
目的 探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对阿尔茨海默病(AD)大鼠认知障碍的改善作用及其对脑内炎症反应的影响.方法 45只雄性SD大鼠,随机分为3组,包括假手术组、模型组、G-CSF组,每组15只.采用β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)复制AD大鼠模型,并给予G-CSF治疗.观察并比较大鼠的学习记忆功能及脑组织病理学变化.采用Western blotting检测核因子κB p65(NF-κB p65)、磷酸化p-38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶-2(COX-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1β (IL-1β)蛋白的表达,采用Real-time PCR检测iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β mRNA水平.结果 模型组大鼠神经细胞数量明显减少,细胞核固缩明显,核仁不清.G-CSF组大鼠脑组织神经细胞核固缩现象均有显著改善.假手术组、模型组、G-CSF组逃避潜伏期分别为(35.68+6.73)s、(57.92+7.35)s及(40.27+8.91)s;目标象限游泳时间分别为54.72％±4.22％、36.73％±3.21％及44.68％±4.01％;穿过平台次数分别为(8.7±2.1)次、(3.9±1.6)次及(6.5±1.7)次;与模型组相比,假手术组、G-CSF组的逃避潜伏期均显著缩短,目标象限游泳时间显著增加,穿过平台次数显著增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).假手术组、模型组、G-CSF组NF-κB p65蛋白表达水平为0.144±0.033、0.502±0.035及0.473±0.061;p-p38 MAPK蛋白水平为0.194±0.021、0.511±0.039及0.266±0.048,与模型组相比,假手术组、G-CSF组NF-κB p65、p-p38MAPK蛋白水平均显著降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).与模型组比较,假手术组、G-CSF组iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β的蛋白和mRNA水平显著降低(P＜0.05).结论 G-CSF具有良好的抑制AD模型大鼠脑神经细胞凋亡,改善大鼠学习记忆功能障碍的作用,其作用可能通过抑制p38MAPK和NF-κB p65的信号通路的过度激活,下调iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β等炎性因子的表达,抑制脑内神经炎症状态而实现.
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胃癌细胞SGC7901中STAT1,NF-κB p65和caspase 8的关系
目的:探讨信号转导子与转录活化因子1(STAT1)、核因子κB(NF-κB)p65和凋亡因子caspase 8在胃癌细胞SGC7901中的关系.方法:SGC7901细胞经IFN-γ及STAT1反义寡核苷酸(STAT1ASON)处理后,应用RT-PCR方法检测STAT1,NF-κB p65和caspase 8在mRNA水平的改变.结果:IFN-γ(1000 U)处理SGC7901细胞,在0.5,3和24 h,STAT1和NF-κB p65在mRNA水平出现先下降后上升的变化,二者呈正相关关系(r=0.403,P=0.009);使用不同浓度的STAT1ASON处理SGC7901细胞24 h,在mRNA水平,STAT1和NF-κB p65呈负相关关系(r=-0.556,P=0.015);IFN-γ和不同浓度的STAT1ASON联合作用处理SGC7901细胞24 h,在mRNA水平,STAT1和NF-κB p65呈负相关(r=-0.783,P=0.002),caspase 8呈上升趋势,与STAT1呈负相关关系(r=-0.667,P=0.002),与NF-κB p65呈正相关关系(r=0.594,P=0.021).结论:IFN-γ能促进STAT1,NF-κB和caspase 8的表达,STAT1和NF-κB p65在mRNA水平上呈负相关;caspase 8与STAT1呈负相关关系,与NF-κB p65呈正相关关系.
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siRNA抑制NF-kB p65对Bcl-2及肝癌细胞凋亡的影响
目的:研究siRNA抑制NF-KB p65后Bcl-2在肝癌细胞中的变化及对肝癌细胞凋亡的影响.方法:选择肝癌细胞HepG2、SMMC7721和人胚胎肝细胞LO2细胞株,应用Western blot法分别检测NF-KB p65、Bcl-2在不同细胞中的表达;应用siRNA方法抑制NF-KB p65在肝癌细胞中的表达,观察NF-kB p65、Bcl-2在肝癌细胞中的变化及应用流式细胞仪观察肝癌细胞的凋亡情况.结果:Western blot法检测显示NF-1cB p65、Bcl-2在肝癌细胞HepG2、SMMC7721中的表达明显高于人胚胎肝细胞LO2(2.14±0.19,2.09±0.27 vs 0.54±0.11; 1.42±0.15,1.47±0.14 vs 0.60±0.08,均P＜0.05),而NF-κB p65、Bcl-2在肝癌细胞HepG2、SMMC7721中的表达差异无统计学意义;应用siRNA抑制NF-κB p65的表达后,应用Western blot法检测显示NF-κB p65在肝癌细胞HepG2、SMMC7721中的表达较未转染组明显下降(2.08±0.19vs 0.99±0.12; 2.03±0.17 vs 0.94±0.14,均P＜0.05),说明转染成功.随后应用Western blot法检测显示Bcl-2在肝癌细胞HepG2、SMMC7721中的表达较未转染组明显下降(1.37±0.05 vs 0.72±0.02; 1.44±0.03 vs 0.69±0.03,均P＜0.05),且肝癌细胞凋亡较未转染组明显增加(5.12％±0.61％ vs 37.87％±4.10％; 5.80％±0.71％ vs 40.19％±3.78％,均P＜0.05).结论:siRNA可以成功抑制NF-κB p65在肝癌细胞中的活性,进一步证实NF-κB p65对Bcl-2具有调控作用,他们共同参与了肝癌的发生发展过程.
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孕期PM2.5暴露影响子代大脑发育中HMGB1/NF-κB通路的作用及机制研究
目的探讨孕期PM2.5暴露影响子代大脑发育中HMGB1/NF-κB p65通路的作用.方法40只昆明小鼠孕鼠随机分5组,每组8只.气管滴注法向对照组注30 μL PBS,PM2.5低、中、高剂量组各注0.25920、1.56695、3.45600 μg/ μL PM2.5混悬液30 μL,孕期每3天注1次,共7次.空白组无处理.ELISA法检测子代大脑皮层肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)、核因子κB p65(NF-κB p65)浓度;Westernblot 、RT-PCR法检测HMGB1、NF-κB p65蛋白及mRNA变化.结果ELISA示与对照组相比,高、中剂量组IFN-γ、NF-κB p65升高而HMGB1下降(P＜0.05),高剂量组TNF-α升高(P＜0.05).Western blot示高、中剂量组与对照组相比,HMGB1下降且NF-κB p65上升(P＜0.05).PCR示HMGB1 mRNA无变化,高剂量组NF-κB p65 mRNA高于对照组(P＜0.05).结论孕期PM25暴露使子代鼠大脑皮层产生炎症,HMGB 1/NF-κB通路可能起重要作用.
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解淀粉芽孢杆菌致BALB/c小鼠肺炎及其IL-8、IL-33、 TNF-α、NF-κB p65表达的研究
目的 建立解淀粉芽孢杆菌导致BALB/c小鼠肺炎模型,观察IL-8、IL-33、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核因子κB(NF-κB) p65的表达水平.方法 24只无特定病原体级雌性BALB/c小鼠随机分为空白对照组、实验组和免疫抑制组,每组分为3小组,每小组8只.实验组、免疫抑制组接种同浓度解淀粉芽孢杆菌菌悬液,空白对照组接种50 μl0.9％氯化钠.接种后第7天分批处死动物,观察其BALF中IL-8、IL-33、TNF-α表达,以及BALF和肺组织中NF-κB p65表达水平.结果 实验组IL-8水平与空白对照组比较,差异有统计学意义(t=4.53,P＜0.01);实验组IL-33水平与空白对照组比较,差异有统计学意义(t=2.99,P＜0.01);实验组TNF-α水平与空白对照组比较,差异有统计学意义(t=8.56,P＜0.01).免疫抑制组IL-8水平与空白对照组比较,差异有统计学意义(t=8.22,P＜0.01);免疫抑制组IL-33水平与空白对照组比较,差异有统计学意义(t=5.53,P＜0.01);免疫抑制组TNF-α水平与空白对照组比较,差异有统计学意义(t=7.21,P＜0.01).免疫抑制组IL-8水平与实验组比较,差异有统计学意义(t=4.53,P＜0.01);免疫抑制组IL-33水平与实验组比较,差异有统计学意义(t=2.89,P＜0.01);免疫抑制组TNF-α水平与实验组比较,差异有统计学意义(t =4.99,P＜0.01).免疫组织化学NF-κB p65水平:免疫抑制组NF-κB p65水平与空白对照组比较,差异有统计学意义(t=5.369,P＜0.05);实验组NF-κB p65水平与空白对照组比较,差异有统计学意义(t=3.507,P＜0.05);免疫抑制组NF-κB p65水平与实验组比较,差异有统计学意义(t=2.566,P＜0.05).Western blotting NF-κB p65水平:实验组NF-κB p65水平与空白对照组比较,差异有统计学意义(t=6.039,P＜0.01);免疫抑制组与空白对照组比较,差异有统计学意义(t =9.951,P＜0.01);免疫抑制组与实验组比较,差异有统计学意义(t=6.423,P＜0.01).结论 IL-8、IL-33、TNF-α、NF-κB p65参与了解淀粉芽孢杆菌致BALB/c小鼠肺炎的发生与发展.
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姜黄素对NAFLD大鼠肝组织PPAR-γ和NF-κB p65mRNA及蛋白表达的影响
目的 研究姜黄素对高脂诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中肝过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)和核因子κB(NF-κB) p65 mRNA及蛋白表达的影响.方法 建立大鼠NAFLD模型,按照随机化原则分为5组:正常组、模型组、低剂量治疗组、中剂量治疗组、高剂量治疗组.正常组给予普通饮食,其余4组给予高脂饮食,同时分别用羧甲基纤维素钠(CMC)和低、中、高剂量姜黄素进行治疗.持续治疗12周后,处死各组大鼠并进行处理分析.血清生物化学方法检测大鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)的含量;HE染色对大鼠肝组织进行病理学观察;免疫组织化学检测大鼠肝组织PPAR-γ和NF-κBp65蛋白的表达情况;RT-PCR检测PPAR-γ和NF-κB p65 mRNA的表达情况.结果 治疗组(低、中、高剂量)大鼠血清中ALT、AST、TG、TC含量较模型组明显降低(P＜0.05).治疗组(低、中、高剂量)大鼠肝组织的脂肪变性程度较模型组明显减轻.与正常组比较,模型组肝组织PPAR-γ mRNA及蛋白的表达水平均明显降低(P＜0.05),而NF-κB p65 mRNA及蛋白的表达水平均明显升高(P＜0.05).与模型组比较,治疗组(低、中、高剂量)大鼠肝组织PPAR-γ的表达明显增加(P＜0.05),PPAR-γ的表达水平以高剂量治疗组升高更加明显(P＜0.01);与模型组相比,治疗组(低、中、高剂量)大鼠肝组织NF-κBp65的表达显著减少(P＜0.05),NF-κB p65的表达水平以高剂量治疗组降低更加明显(P＜0.01).结论 姜黄素可明显减轻高脂诱导的大鼠NAFLD肝组织的脂肪变性和炎性反应,其抗脂肪变性和抗炎的机制可能与姜黄素激活PPAR-γ的表达,从而抑制NF-κB p65的活性有关.PPAR-γ和NF-κB p65的表达参与了NAFLD的发生发展,控制这些信号分子的表达可能是姜黄素治疗NAFLD的重要机制之一.
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异甘草酸镁对H22肝癌荷瘤小鼠核因子-κB p65、肿瘤坏死因子-α、血管内皮生长因子表达的影响
目的 探讨异甘草酸镁(MGIG)对肝癌小鼠模型肝癌前病变的作用.方法 通过H22细胞皮下注射建立肝癌动物模型,在制模过程中给予MGIG 50 mg/kg和5-Fu 10 mg/kg进行干预,通过免疫组化法检测肝组织中的核因子(NF)-κB p65、血管内皮生长因子(TNF)-α和血管内皮生长因子(VEGF)表达,同时检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST).结果 MGIG+5-Fu组的NF-κB p65、TNF-α和VEGF表达和血清ALT、AST水平均小于5-Fu组和阳性对照组,差异有统计学意义(P<0.05％).结论 MGIG对小鼠肝癌病变有一定的抑制作用,这种作用可能与抑制肿瘤细胞炎症因子有关.
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NF-κB p65 siRNA对延迟性排斥反应的抑制作用
目的 探讨核因子kappa B(NF-κB) p65的小干扰RNA (siRNA)对延迟性排斥反应的抑制作用.方法血管内皮细胞(EOMA)分为7组:A组(空白对照),B组(阴性对照),C组(TNF-α处理),D组(siRNA处理),E组(scramble siRNA处理),F组(TNF-α+ siRNA处理),G组(TNF-α+scramble siRNA处理).用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000作为转染试剂将化学合成的小鼠NF-κB p65 siRNA转染入相应的EOMA细胞,24 h后在C组、F组和G组中加入TNF-α(终浓度为20 ng/ml).于TNF-α加入后的6h提取各组细胞总RNA,RT-PCR法测定EOMA细胞内E选择素(E-selectin)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、白细胞介素1α(IL-1α)和血管细胞黏附分子1(VCAM-1)水平.结果 F组EOMA细胞内E-selectin、ICAM-1、IL-1α和VCAM-1表达明显高于A组,的明显低于C组和G组(P＜0.01).结论 特异性siRNA抑制NF-κB p65表达可以有效抑制延迟性排斥反应.
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乌梅丸对溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用及其机制
目的 观察乌梅丸对溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用及对结肠黏膜组织中Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB) p65蛋白表达的影响.方法 采用2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene,DNCB)加丙酮局部灌肠法建立溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)大鼠模型.将60只健康SD大鼠随机均分为正常(生理盐水)对照组、阳性对照组[柳氮磺胺吡啶(salazosulfapyridine,SASP)]、模型组、3个乌梅丸剂量组(0.575 g/kg、1.15 g/kg、2.3g/kg),造模后给药15天,处死大鼠收集样本,观察结肠黏膜大体形态及组织学改变；应用免疫印迹(Western blot)法检测结肠黏膜组织中TLR4、NF-κB p65蛋白的表达水平.结果 乌梅丸2.3 g/kg剂量组减轻了大鼠肠道水肿程度,并减少了赘生物及溃疡的形成,作用优于SASP组；模型组结肠黏膜组织TLR4、NF-κB p65蛋白的表达明现高于正常组(P＜0.01),乌梅丸组和SASP组则低于模型组,其中乌梅丸2.3 g/kg剂量组尤其明显(P＜0.01).结论 乌梅丸对实验性大鼠溃疡性结肠炎有明显的治疗作用,其机制可能是通过抑制TLR4的表达,降低NF-κB p65的活性免疫调节,达到治疗目的.
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LXRα激动剂通过NF-κB途径抑制巨噬细胞NLRP3炎症小体活化导致成熟IL-1β升高
目的 探讨肝X受体α(LXRα)激动剂对巨噬细胞中Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体活化导致成熟白细胞介素1β(IL-1β)水平升高的影响及其机制,为探索同时具有抗炎和调脂能力的防治动脉粥样硬化药物新靶点提供实验支持.方法 THP-1细胞经佛波酯活化成为人源性巨噬细胞,在培养基中加入胆固醇晶体(1μg/L)为模型组,其它各组在模型组基础上分别加入高剂量(30 μmol/L)、中剂量(10 μmol/L)、低剂量(3.3μmol/L)的LXRα激动剂GW3965以及GW3965 10μmol/L+ GGPP 10 μmol/L、GGPP 10 μmol/L、GW3965 10 μmol/L+ ABCA1抗体(1:200)、GW3965 10μmol/L+载脂蛋白E抗体(1∶200),48 h后提取总RNA、总蛋白、核蛋白和培养基蛋白.利用real-time PCR和Western blot对相应指标的mRNA和蛋白水平进行检测.结果 模型组成熟IL-1β蛋白水平、NLRP3和Caspase-1的mRNA和蛋白水平与对照组有显著差异(P＜0.05);与模型组相比,GW3965中、高剂量组上述指标均有显著减低(P＜0.05),LXRα抑制剂GGPP能显著抑制GW3965的作用(P＜0.05),载脂蛋白E抗体及ABCA1抗体均对GW3965中剂量的活性无显著影响,单独使用GGPP处理的细胞各项指标与模型组无显著差异.结论 LXRα激动剂能够显著抑制巨噬细胞模型中由胆固醇晶体激活NLRP3炎症小体导致的IL-1β水平升高,且此作用与抑制核因子κB(NF-κB)信号通路有关.
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甘草酸对炎性刺激诱导气道黏蛋白5AC高表达的抑制作用
目的:了解甘草酸对中性粒细胞弹力蛋白酶(HNE)诱导的人气道上皮细胞(16HBE)黏蛋白(MUC)5AC高表达的抑制作用,探讨可能参与其中的信号转导通路.方法:体外培养16HBE细胞,给予HNE刺激,以甘草酸为干预因素.RT-PCR检测干预前后细胞中MUC5AC,p38,核因子κB (NF-κB) p65和核转录因子κB抑制蛋白α(inhibitor αof nuclear transcription factor κB,IκBα) mRNA含量,Western印迹分析磷酸化p38(p-p38)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)和磷酸化IκBα (p-IκBα)蛋白水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光法检测细胞内MUC5AC蛋白含量.结果:HNE刺激后,MUC5AC,p38和NF-κB p65的基因转录及蛋白和磷酸化蛋白表达水平较对照组均明显升高(p＜0.05),同时伴有IκBα mRNA表达和蛋白磷酸化水平的降低(p＜0.05).加入干预因素甘草酸后可显著抑制MUC5AC,p38和NF-κB p65的基因转录及蛋白和磷酸化蛋白的表达(P＜0.05),而IκBα的mRNA和蛋白磷酸化水平明显升高(p＜0.05).结论:甘草酸可通过下调P38和NF-κB的表达,并同时上调NF-κB与IκBα的结合,抑制HNE诱导的MUC5AC高表达,为气道黏液高分泌疾病的治疗提供新的方向.
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人参皂苷Re对球囊损伤所致大鼠血管内膜增生及NF－κBp65信号通路的影响
目的：研究人参皂苷Re对大鼠颈动脉球囊损伤所致血管内膜增生的作用及其对NF－κB p65炎症信号通路的影响。方法：40只SD大鼠随机分组为5组：假手术组，模型组，人参皂苷Re低、中、高剂量组。除假手术组外，其余组大鼠均用2F球囊导管建立颈动脉球囊损伤模型，制模后次日灌胃给药，假手术组和模型组给予等体积蒸馏水，人参皂苷低、中、高剂量组大鼠分别给予12．5、25、50 mg／kg人参皂苷Re。连续给药14 d后取损伤段颈动脉，HE染色观察血管形态学改变，并测定血管管腔面积（ lumen area，LA）、内膜面积（ intima area，IA）、中膜面积（ media area，MA），计算内膜／中膜面积比（ IA／MA）；real－time PCR法检测肿瘤坏死因子－α（ tumor necrosis factor－α， TNF－α）和白细胞介素－1β（ interleukin－1β，IL－1β）的mRNA水平；免疫组织化学法检测血管壁增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和核因子κB（nuclear factor－kappa B，NF－κB）p65蛋白的表达。结果：与假手术组相比，模型组大鼠血管腔明显变窄（P＜0．01），血管壁TNF－α、IL－1β的mRNA水平及PCNA、NF－κB p65蛋白的表达均明显增高（P＜0．05）；与模型组比较，人参皂苷Re中、高剂量组血管内膜增生明显减轻（P＜0．05），血管壁TNF－α和IL－1β的mRNA水平及PCNA和NF－κB p65的蛋白表达则明显下调（ P＜0．05）。结论：人参皂苷Re能减轻球囊损伤所致大鼠颈动脉内膜增生，其机制可能与抑制NF－κB p65炎症信号通路有关。
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穴位埋线对溃疡性结肠炎的疗效评价及对NF-κB和5-LOX表达的影响
目的:通过检测结肠黏膜NF-κB p65及5-LOX的表达情况,探讨穴位埋线对溃疡性结肠炎(UC)的治疗效果.方法:选取活动期轻、中度UC患者60例,随机分为三组,即埋线组、拉嗪组和联合组,每组20例,另设20例健康体检者作为对照组,于治疗前后评估临床症状及结肠镜下病变活动性,ELISA法测定血清IL-8和TNF-α血清水平.然后分别运用RT-PCR及免疫组化检测SP法检测结肠黏膜5-LOX和NF-κB p65的mRNA及其蛋白在各组治疗前后的表达情况.结果:治疗后三组临床症状和结肠镜下病变活动性较治疗前有明显改善(P＜0.05),且联合组的临床症状和结肠镜下病变活动性与穴位埋线组和美沙拉嗪组相比改善较为明显(P＜0.05).而且治疗后三组的IL-8和TNF-α血清水平明显低于对照组和治疗前.此外治疗前,三组患者结肠黏膜5-LOX和NF-κB p65的mRNA及蛋白表达亦明显高于对照组(P＜0.05),治疗6周后,5-LOX和NF-κB p65的mRNA及蛋白表达较治疗前有明显下降(P＜0.05).结论:穴位埋线疗法联合美沙拉嗪治疗活动期轻、中度UC的疗效较好,其机制可能是通过抑制5-LOX和NF-κB p65的表达而起到治疗作用.
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人核因子κBp65核定位信号缺失突变对A549细胞恶性表型的影响
目的 鉴定人核因子κB(NF-κB) p65核定位信号(NIs)缺失突变质粒即pcDNA3.1(+)-NF-κBp65△NLS(简称NF-κBp65△NLS)的表达功能,以及其对低表达NF-κBp65的A549细胞株即A549/NF-κBp65 shRNA细胞增殖、迁移和粘附能力的影响.方法 培养人A549/NF-κBp65 shRNA细胞株,分为对照组、转染pcDNA3.1(+)组、转染NF-κBp65△NLS组.应用间接免疫荧光、实时荧光定量-PCR和Western blot技术检测NF-κBp65的细胞内定位及mRNA、蛋白表达水平的变化;应用MTT、Transwell和细胞粘附实验分析转染NF-κBp65△NLS质粒对A549/NF-κBp65 shRNA细胞增殖、迁移、粘附能力的影响.结果 成功构建人NF-κBp65△NLS真核表达质粒.转染NF-κBp65△NLS质粒的A549/NF-κBp65 shRNA细胞与对照组及转染pcDNA3.1(+)组比较,NF-κBp65 mRNA表达水平明显上调(10.63±0.84比1.04±0.21和1.23±0.22,P＜0.01),NF-κBp65蛋白表达水平明显升高(1.07 ±0.06比0.53±0.02和0.59±0.04,P＜0.01),且NF-κBp65蛋白主要位于细胞浆内,在肿瘤坏死因子α刺激后NF-κBp65蛋白并未明显进入细胞核.与对照组及转染pcDNA3.1(+)组比较,转染NF-κBp65 △NLS质粒的A549/NF-κBp65 shRNA细胞的增殖、迁移和粘附能力均有不同程度增强.结论 通过基因突变技术构建无NLS的NF-κBp65真核表达质粒,可明显增强A549/NF-κBp65shRNA细胞株内NF-κBp65 mRNA和蛋白的表达水平,并使NF-κBp65蛋白定位于细胞浆内;同时,细胞浆内过表达NF-κBp65△NLS蛋白可明显增强A549/NF-κBp65 shRNA细胞的增殖、迁移和粘附能力,提示滞留于细胞浆内的NF-κBp65仍可通过影响NF-κB信号通路相关蛋白参与调节肺癌细胞的生物学行为.
