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电针对帕金森病模型大鼠黑质区细胞外信号调节激酶和肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β mRNA的影响
目的:观察电针对帕金森病模型大鼠黑质内细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK 1/2)信号通路及炎性反应因子肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)的作用,探讨针刺治疗帕金森病的作用机制.方法:雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、电针组,各8只.模型组和电针组经颈背部注射鱼藤酮(1 mg/kg,溶于一定比例二甲亚砜和生理盐水中,浓度0.25 mg/mL)造模14d.电针组电针“风府”和“太冲”,治疗14d.造模过程中观察各组大鼠的行为学变化,各组大鼠相应处理结束后的第2天行敞箱实验以测试大鼠的自主活动能力和运动的协调性,采用免疫蛋白印迹法检测大鼠黑质区酪氨酸羟化酶(TH)、磷酸化ERK 1/2(p-ERK 1/2)、TNF-α、IL-1β蛋白表达情况.结果:模型组大鼠表现出明显的帕金森病症候群特征,治疗后,大鼠的异常行为明显改善.敞箱实验结果显示,模型组大鼠水平运动、垂直运动能力较正常组和假手术组明显降低(P＜0.05);电针治疗后,大鼠运动能力较模型组明显增强(P＜0.05).与正常组、假手术组相比,模型组大鼠黑质区TH蛋白表达明显减少(P＜0.05),p-ERK 1/2、TNF-α、IL-1β蛋白表达明显增加(P＜0.05);与模型组相比,电针组大鼠黑质区TH蛋白表达明显增加(P＜0.05),p-ERK 1/2、TNF-α、IL-1β蛋白表达明显减少(P＜0.05).结论:电针可以通过调节帕金森病模型大鼠体内丝裂原活化蛋白激酶/ERK 1/2通路,降低p-ERK 1/2在帕金森病模型大鼠黑质区的表达,进而减少TNF-α、IL-1β的蛋白表达,对帕金森病的发生发展起到一定的调节作用.
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胡黄连苷Ⅱ对脑缺血损伤大鼠ERK1/2信号通路的影响
目的 探讨胡黄连苷Ⅱ对脑缺血损伤后细胞外调节蛋白激酶1/2 (ERK1/2)通路的影响及其神经保护作用机制.方法 应用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,按随机数字表将96只造模成功大鼠分为模型组、治疗组、脂多糖(LPS)组和U0126组,每组再分为缺血6、12、24 h3个亚组.治疗组缺血后2h腹腔注射胡黄连苷Ⅱ(20 mg/kg).LPS组在缺血后2h腹腔注射LPS(20 mg/kg)和胡黄连苷Ⅱ(20 mg/kg).U0126组在缺血后2h腹腔注射U0126-EtOH (20 mg/kg)和胡黄连苷Ⅱ(20 mg/kg).模型组和对照组同步腹腔注射等体积的生理盐水.采用改良的神经功能评分(mNSS)法评价大鼠神经行为功能;HE染色观察神经细胞形态结构;原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡;免疫组织化学和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测脑组织pERK1/2表达.结果 大鼠脑缺血损伤后,随着时间的延长,模型组大鼠神经功能缺损评分升高,皮质区神经细胞损伤加重,凋亡细胞增多,pERK1/2蛋白表达较对照组明显增强(P＜0.05).治疗组和U0126组大鼠皮质区神经元细胞损伤较轻,凋亡细胞,pERK1/2表达较模型组明显降低(P＜0.05).LPS组大鼠神经元细胞早期损伤较重,凋亡细胞与pERK1/2表达水平较高,但后期pERK1/2表达水平有所下降,大鼠神经行为功能损伤略有恢复.结论 脑缺血损伤后激活ERK1/2通路介导神经细胞凋亡和炎症反应,胡黄连苷Ⅱ可能通过降低ERK1/2通路的活化,抑制神经细胞凋亡和炎症反应而保护神经系统.
关键词： 胡黄连苷Ⅱ 脑缺血 炎症反应 凋亡 细胞外调节蛋白激酶1/2 -
白细胞介素-25对白细胞介素-17A促类风湿关节炎滑膜成纤维细胞细胞外调节蛋白激酶1/2和MMP-3表达的拮抗作用的研究
目的 研究分析IL-25对RA滑膜成纤维细胞(FLS)分化的影响以及对细胞外调节蛋白激酶(ERK)和MMP-3表达中的作用.方法 培养RA和健康人FLS并鉴定,检测二者间ERK1/2和MMP-3蛋白的差异.RA-FLS分别用IL-17A (10 ng/ml)、不同浓度的IL-25(0.01、0.1、1和10 ng/ml)与IL-17A(10 ng/ml)共刺激24h,蛋白质印迹法检测不同组间ERK1/2和MMP-3蛋白表达.不同组间独立样本t检验.结果 ERK1/2蛋白在RA-FLS中表达(1.71±0.17)高于健康人滑膜细胞(0.50±0.15),差异具有统计学意义(t=-9.13,P＜0.01).同时,MMP-3蛋白在RA-FLS中表达(0.50±0.13)高于健康人滑膜细胞(0.17±0.05),差异具有统计学意义(t=-4.10,P＜0.05).RA-FLS在IL-17A刺激后ERK1/2蛋白(0.77±0.22)和MMP-3蛋白(0.59±0.13)表达较无刺激组(0.18±0.35、0.04±0.03)增强,差异具有统计学意义(t=-4.69,P＜0.01和t=-7.47,P＜0.01),且随共刺激中IL-25浓度的增加能部分抑制IL-17A对RA-FLS中ERK1/2蛋白(0.54±0.26、0.48±0.18、0.48±0.23、0.23±0.06)和MMP-3蛋白(0.58±0.09、0.59±0.14、0.21±0.04、0.04±0.02)的刺激,差异有统计学意义(t=4.22,P＜0.05;t=4.95,P＜0.01;t=7.47,P＜0.01).结论 IL-25可部分抑制IL-17A对RA-FLS中ERK1/2和MMP-3蛋白的刺激,可能通过此途径参与RA的发展,可作为IL-17A治疗RA的新靶点.
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软骨细胞迁徙能力与自体细胞软骨移植中整合的相关性
背景：在关节外科中常用自体细胞软骨移植技术修复软骨缺损，整合不良是导致修复失败的原因之一。软骨细胞迁徙能力被证明和整合有相关性，某些通路如Src-磷酸化磷脂酶Cγ1-细胞外调节蛋白激酶1/2已经被证实和软骨细胞的迁徙能力相关，但是否和整合相关还是个未知数。目的：阐明软骨细胞迁徙通路在自体细胞软骨移植中和整合之间的相关性。方法：将来源于猪膝关节的软骨细胞分成4组，为Src、磷酸化磷脂酶Cγ1、细胞外调节蛋白激酶1/2抑制组以及正常组，通过博伊登小室来量化4组软骨细胞的迁徙能力。将处理后的软骨细胞与软骨环建立共培养模型培养28 d后，进行组织学、生物化学、生物力学、免疫蛋白印迹以及细胞示踪等分析来观察正常组与抑制组之间的差异。结果与结论：当用抑制剂处理软骨细胞后，软骨细胞的迁徙能力明显下降。在软骨细胞软骨环共培养28 d后，免疫印迹蛋白分析表明通路抑制剂一直存在于整个培养周期中。同时正常组迁徙到整合区域中的软骨细胞数量和距离以及分泌的胶原、基质和力学强度明显高于其他3个抑制组。说明可以通过Src-磷酸化磷脂酶Cγ1-细胞外调节蛋白激酶1/2通路调节软骨细胞的迁徙能力从而影响软骨的整合能力。
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细胞外调节蛋白激酶1/2磷酸化对嗜心性柯奇病毒B3型感染心肌细胞H9C2能力的影响
目的 探讨细胞外调节蛋白激酶1、2 (extracellular regulated protein kinases 1、2,ERK1、2)磷酸化对嗜心性柯萨奇病毒B3型(coxsackie virus B3,CVB3)感染心肌细胞H9C2能力的影响.方法 通过检测CVB3对心肌细胞H9C2的半数感染量(TCID50)确定病毒的作用浓度,用该浓度CVB3分别作用心肌细胞H9C2 0、20、40和60 min,检测细胞中ERK1/2的磷酸化情况.将ERK1、2的磷酸化激动剂Ceramide C6作用于H9C2细胞,同时加入CVB3,检测TCID50.结果 确定CVB3对H9C2细胞的TCID50为10-7.1,该浓度CVB3作用心肌细胞H9C2 40和60 min时,细胞中磷酸化ERK1、2表达量低,明显低于0min (P＜0.01).加入激动剂Ceramide C6后,CVB3感染心肌细胞H9C2的TCID50为10-6.47.结论 ERK1、2磷酸化可抑制CVB3感染心肌细胞H9C2的能力,本实验为病毒性心肌炎发病机制的研究奠定了基础.
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硫酸软骨素对实验性慢性氟中毒脑损害大鼠的保护作用及机制研究
目的 观察细胞外调节蛋白激酶(Erk)1/2、磷酸化(phospho)-Erk1/2、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9在实验性慢性氟中毒大鼠脑组织中的改变及硫酸软骨素的治疗作用与机制.方法 采用成组设计及细胞培养方法,将人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞分为对照组(正常培养液)、染氟组(氟离子:4.0 mool/L)和硫酸软骨素处理组(氟离子:4.0 mmol/L、硫酸软骨素:0.4 g/L).染氟24h,电子显微镜观察SH-SY5Y细胞超微结构变化;染氟72 h,锥虫蓝染色观察细胞存活数量并计算细胞存活率.15只清洁级SD大鼠,按体质量(100～120 g)采用随机数字表法分为对照组(饮用自来水,含氟量＜0.5 mg/L)、染氟组(氟离子:10.0 mg/L)和硫酸软骨素处理组(氟离子:10.0 mg/L,染氟90 d后0.66 mg/kg硫酸软骨素连续腹腔注射5 d),每组5只,实验周期为95 d.采用Morris水迷宫方法检测大鼠行为学变化,蛋白质免疫印迹法检测脑组织中Erk1/2、phospho-Erk 1/2、MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平,免疫组织化学法检测大鼠脑组织海马CA2区phospho-Erk 1/2、MMP-2、MMP-9的表达及分布.结果 细胞体外培养结果显示,电镜下硫酸软骨素处理组细胞内吞饮小泡较多,有线粒体及内质网肿胀但相对染氟组较少.硫酸软骨素处理组SH-SY5Y细胞存活率[(92±23)％]和细胞数[(7.83±1.38)×106个/ml]明显高于染氟组[(55±2)％、(2.19±1.26)×106个/ml,P均＜0.05].动物实验结果显示,对照组与硫酸软骨素处理组大鼠趋向式搜索次数(2.20±1.09、3.40±1.34)高于染氟组(0.40±0.54,P均＜0.05).染氟组phospho-Erk1/2的蛋白表达(3.26±0.88)较对照组和硫酸软骨素处理组升高(1.53±0.28、2.36±0.87,P均＜0.05).免疫组织化学结果显示,硫酸软骨素处理组phospho-Erk1/2平均灰度值(220.20±3.09)显著高于对照组和染氟组(100.00±0.00、130.98±1.27,P均＜0.05);染氟组MMP-2平均灰度值(294.52±5.18)显著高于对照组和硫酸软骨素处理组(100.00±0.00、117.95±1.55,P均＜0.05);染氟组和硫酸软骨素处理组MMP-9平均灰度值(993.64±3.66、1 167.30±2.39)均显著高于对照组(100.00±0.00,P均＜0.05).结论 Erk1/2通路可能通过调节MMP-2和MMP-9表达维持细胞生存内环境稳定.硫酸软骨素对慢性氟中毒所致的神经损害具有一定的拮抗作用.
关键词： 氟 硫酸软骨素 细胞外调节蛋白激酶1/2 基质金属蛋白酶-2 基质金属蛋白酶-9 -
右美托咪定预处理对大鼠肝缺血/再灌注损伤的作用
目的 探究细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)在右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)预处理减轻大鼠肝缺血/再灌注损伤中的作用.方法 采用随机数字表法将24只成年健康雄性SD大鼠分为4组(每组6只):对照组(S组)、肝缺血/再灌注损伤(hepatic ischemia/reperfusion injury,HI/RI)组(HI/RI组)、Dex预处理组(D组)、丝裂原活化蛋白激酶(methyl ethyl ketone,MEK)抑制剂U0126组(U组).再灌注6 h末,测定血清ALT、AST活性,病理学H-E染色,检测Cleaved casepase-3(Western blot法)和ERK1/2(免疫组织化学法)的表达水平,并计算凋亡指数(TUNEL法).结果 与HI/RI组比较,D组ALT和AST的活性降低,Cleaved casepase-3的表达明显下调,细胞凋亡指数降低(P<0.05),磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(phosphorylate extracellular signal-regulated kinases 1/2,p-ERK1/2)的表达明显上调(P<0.05).与D组比较,U组ALT和AST的活性升高,Cleaved casepase-3的表达明显上调,细胞凋亡指数升高(P<0.05),由Dex诱导的p-ERK1/2的表达明显上调被抑制剂U0126显著抑制(P<0.05).结论 Dex预处理降低肝脏的casepase-3的表达,减轻HI/RI的炎症反应,Dex通过上调p-ERK1/2的表达发挥保护作用.
关键词： 右美托咪定 缺血/再灌注损伤 肝脏 细胞外调节蛋白激酶1/2 凋亡 -
大鼠蛛网膜下腔出血后海马区磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2表达与细胞自噬的关系
目的 探讨大鼠蛛网膜下腔出血(SA H)后海马区细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)表达与神经细胞自噬的关系. 方法 采用枕大池二次注血法制作SA H大鼠模型,将120只雄性SD大鼠采用数字表法分成假手术组(Sham)、SA H组、U0126(ERK1/2抑制剂)低剂量组及U0126高剂量组.低剂量和高剂量U0126组分别于造模前30 min侧脑室注射U01265和10 g/L.水迷宫行为学测试大鼠的行为学变化;光镜观察海马区神经细胞形态结构;免疫组织化学法和免疫印迹法检测海马区磷酸化 ERK1/2(p-ERK1/2)和自噬标志蛋白(Beclin-1及LC3-Ⅱ)的表达水平. 结果 与Sham组比较,SA H组大鼠在72 h的逃避潜伏期时间明显延长、穿台次数明显减少(P<0.05),各时间点神经元存活比率均明显降低,且SA H组p-ERK1/2,Beclin-1及LC3-Ⅱ表达均增加,于24 h达高峰;与 SA H 组比较,低、高剂量 U0126组大鼠相应时间点的潜伏期明显延长、穿台次数明显减少(P<0.05),各时间点神经元存活比率均明显降低,且p-ERK1/2,Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达及存活神经细胞比率降低(P<0.05);与低剂量U0126组比较,高剂量U0126组的大鼠相应时间点的逃避潜伏期明显延长、穿台次数明显减少(P<0.05),p-ERK1/2及存活神经细胞比率降低(P<0.05),但2组间的Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白比较差别均无统计学意义(P>0.05). 结论 大鼠SA H后海马区p-ERK1/2激活对神经细胞有保护作用,且这种保护作用与神经细胞自噬有关.
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鼻咽癌组织中 ERK1／2、p-ERK1／2和 MMP-9蛋白的表达变化及其相关性
目的：观察细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2（p-ERK1/2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）在鼻咽癌（NPC）组织中的表达及相关性，并探讨其意义。方法采用免疫组织化学染色SP法检测75份NPC组织（ NPC组）和27份鼻咽黏膜慢性炎组织（炎性组）中ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9蛋白的表达，分析三者在NPC组织中表达的相关性。结果 NPC组ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9蛋白阳性表达率均显著高于炎性组（P均＜0．01），χ2值依次为19．8、17．1、21．3；NPC组织中ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9蛋白三者间的表达呈正相关（P均＜0．01），其中ERK1/2与p-ERK1/2、MMP-9蛋白的r值分别为0．58、0．34，p-ERK1/2、MMP-9蛋白的r值为0．34。结论 ERK1/2、p-ERK1/2和MMP-9蛋白在NPC组织中呈高表达且三者间呈正相关，p-ERK1/2可能通过调节MMP-9表达参与NPC侵袭、转移。
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马铃薯提取液对人卵巢癌细胞株 HO-8910增殖及磷酸化 ERK1／2蛋白表达的影响
目的：观察马铃薯提取液对人卵巢癌细胞增殖及磷酸化细胞外调节蛋白激酶1／2（ ERK1／2）蛋白表达的影响。方法培养人卵巢癌细胞株HO-8910，待98％细胞生长状态良好、长满96孔细胞培养板时开始实验。将细胞分为实验1、2、3、4组及对照组。实验1、2、3、4组分别加入13、25、50、100μL／mL的马铃薯提取液，对照组不添加。各组分别于培养24、48、72 h采用MTT法检测光密度值（ OD值），计算细胞增殖抑制率。收集各组细胞，分别于培养0、10、20、40 min采用Western blotting法检测磷酸化ERK1／2蛋白。结果培养24 h时实验4组细胞增殖抑制率高于实验1、2、3组（P均＜0．05）；培养48 h时实验3、4组细胞增殖抑制率高于实验1组，实验4组细胞增殖抑制率高于实验2组（P均＜0．05）；培养72 h时实验2、3、4组细胞增殖抑制率高于实验1组（P均＜0．05）。培养20、40 min时实验3组细胞中磷酸化ERK1／2蛋白相对表达量低于同组培养0、10 min时（P均＜0．05）；培养20、40 min时实验3组细胞中磷酸化ERK1／2蛋白相对表达量低于同时点实验1、2、4组（P均＜0．05）。结论马铃薯提取液可抑制人卵巢癌细胞增殖，并下调细胞内磷酸化ERK1／2蛋白表达。
关键词： 马铃薯提取液 卵巢癌 人卵巢癌细胞 细胞增殖 细胞外调节蛋白激酶1/2 -
肾上腺素受体激动剂对新生大鼠心肌细胞胞质型磷脂酶A2的活化作用
目的 探讨肾上腺素受体(adrenergic receptor,AR)激动剂对培养的新生大鼠心肌细胞胞质型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2,cPLA2)的磷酸化效应及机制.方法 分别用β-AR激动剂异丙肾上腺素(10 μmol/L)和α1-AR激动剂苯肾上腺素(10 μmol/L)处理培养的新生大鼠心肌细胞,Western blot法检测cPLA2及丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)磷酸化水平随时间变化的效应曲线.结果 α1-AR激活引起心肌细胞内cPLA2磷酸化水平显著增高,此效应可能由p38 MAPK及ERK1/2的磷酸化介导;β-AR激活可引起p38 MAPK及ERK1/2的磷酸化,但不伴有cPLA2的磷酸化.结论 实验结果揭示了心肌细胞中α1-AR激动在调控cPLA2活性方面的重要作用.
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小檗碱减轻幽门螺杆菌诱导的人胃黏膜上皮细胞损伤
目的:探讨小檗碱(Ber)对幽门螺杆菌(Hp)诱导的人胃黏膜上皮细胞GES-1损伤的保护作用及机制.方法:采用Hp感染GES-1细胞,加入小檗碱(5,10和20μmol/L)和细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)抑制剂PD98059(20μmol/L)共培养.MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,ELISA法检测细胞白细胞介素(IL)-1β及IL-8的水平,比色法检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性并以Western blot法检测细胞Bax、Bcl-2、p-ERK1/2的蛋白水平.结果:与对照组比较,Hp可抑制GES-1细胞活力、促进GES-1细胞凋亡、诱导GES-1细胞分泌IL-1β和IL-8、增加LDH活性、增加GES-1细胞内p-ERK1/2及Bax蛋白水平并降低Bcl-2蛋白水平,差异均有统计学显著性(P<0.05);与Hp感染组比较,中、高剂量小檗碱均可逆转Hp对GES-1细胞活力、细胞凋亡、细胞IL-1β及IL-8分泌、LDH活性和GES-1细胞内p-ERK1/2、Bax及Bcl-2蛋白水平的影响,差异均有统计学显著性(P<0.05);与高剂量小檗碱组比较,PD98059联合小檗碱可进一步逆转Hp对GES-1细胞上述指标的影响,差异均有统计学显著性(P<0.05).结论:小檗碱可通过抗炎、增加细胞活力和抗凋亡来减轻Hp诱导的GES-1细胞损伤,其机制可能与抑制ERK1/2通路有关.
关键词： 小檗碱 幽门螺杆菌 细胞外调节蛋白激酶1/2 人胃黏膜上皮细胞 -
IQGAP1在血管紧张素Ⅱ诱导足细胞凋亡中的作用及其机制探讨
目的 研究IQ结构域GTP酶活化蛋白1(IQ domain GTPase-activating protein 1,IQGAP1)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导足细胞凋亡中的作用以及可能的分子机制.方法 体外培养条件永生性小鼠足细胞(MPC),以不同浓度(0、10-12、10-10、10-8、10-6mol/L) AngⅡ处理MPC或10-8 mol/L AngⅡ刺激不同时间(0、1、3、6、12、24 h),采用流式细胞术检测细胞凋亡率,免疫荧光、Western印迹法检测IQGAP1的表达及分布.IQGAP1 siRNA转染以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路(包含p38、JNK和ERK1/2 3条主要通路)抑制剂SB202190(10 μmol/L)、SP600125(25 μmol/L)或U0126(10 μmol/L)预处理MPC后,分别检测MAPK信号蛋白磷酸化水平及细胞凋亡率,并采用免疫共沉淀法研究IQGAP1与ERK1/2结合水平的变化.结果 (1)AngⅡ可以诱导足细胞凋亡,且凋亡率随着刺激时间和刺激浓度的增加而进一步增加.(2)正常足细胞IQGAP1主要分布于细胞膜和胞质,随AngⅡ刺激浓度和刺激时间的增加,胞膜和胞质IQGAP1表达逐渐增高,且随剂量和时间增高.(3)SB202190、SP600125或U0126分别预处理足细胞,可显著降低AngⅡ诱导的足细胞凋亡(P＜0.05),但不影响IQGAP1蛋白表达.(4)IQGAP1 siRNA转染足细胞显著下调ERK1/2磷酸化水平(P＜0.05),降低IQGAP1与ERK1/2结合量(P＜0.05),并抑制AngⅡ诱导的细胞凋亡(P＜0.05),但对于p38以及JNK通路无显著影响.结论 IQGAP1通过ERK1/2 MAPK信号通路介导AngⅡ诱导的足细胞凋亡.
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血管紧张素Ⅱ诱导肾小球IQGAP1表达改变及细胞凋亡
目的 研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)输注对大鼠肾小球ras GTP酶活化蛋白(IQGAPl)表达及细胞凋亡的影响,探讨IQGAP1在AngⅡ诱导肾小球细胞凋亡中的作用.方法 36只雄性Wistar大鼠按随机数字法分为正常对照组、生理盐水输注组和AngⅡ输注组,每隔7d测量大鼠血压及尿蛋白量.分别于实验第14天、第28天处死动物取肾,PAS染色观察肾组织病理学改变；免疫组化、免疫荧光法观察IQGAP1在肾小球的表达及分布；Western印迹法检测肾组织IQGAP1、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)及细胞外调节蛋白激酶1/2 (ERK1/2)蛋白表达；TUNEL法检测肾小球细胞凋亡.结果 AngⅡ输注组大鼠血压升高,实验第14天达峰值并维持在较高水平；第7天出现蛋白尿,且随时间的延长尿蛋白量持续增加,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).AngⅡ输注组出现轻度系膜细胞增殖和系膜基质增加,生理盐水输注组和正常对照组均未见明显病理改变.TUNEL检测结果显示,AngⅡ输注后肾小球细胞凋亡显著增加；Western印迹发现,AngⅡ输注组大鼠肾小球caspase-3活化明显增加,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).正常对照组IQGAP1呈低水平表达并沿毛细血管袢线性分布,AngⅡ输注后IQGAP1表达量显著增加(P＜0.05),且其蛋白表达量与caspase-3活化量呈正相关(r=0.689,P＜ 0.05).与对照组比较,AngⅡ输注组磷酸化的ERKl/2(p-ERKl/2)表达量显著增加(P＜ 0.05),且与IQGAP1蛋白表达呈正相关(r=0.658,P＜0.05).结论 IQGAP1表达上调可能通过激活ERKl/2信号通路参与AngⅡ诱导肾小球细胞凋亡的病理过程.
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大鼠蛛网膜下腔出血后细胞外调节蛋白激酶1/2激活介导海马区神经细胞自噬
目的 探讨大鼠蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后海马区细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)激活与神经细胞自噬的关系.方法 120只雄性SD大鼠随机分成假手术组、SAH组、ERK1/2抑制剂U0126组、自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin,Rap)组.采用枕大池二次注血法制作SAH大鼠模型;U0126组和Rap组分别于造模前30min侧脑室注射U0126(5μg/μL)和Rap(10nmol/μL).光镜观察海马区神经细胞形态结构;免疫组化法和实时荧光定量PCR法检测海马区磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、ERK1/2 mRNA和自噬标志蛋白(Beclin-1和Beclin-1mRNA、LC3-Ⅱ和LC3mRNA)表达水平.结果 与假手术组比较,SAH组神经细胞死亡率增加(14.9％±5.7％,28.3％±9.8％,44.2％±10.9％)(q值依次为27.56、35.65、44.81;均P＜0.05),ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA水平增加(1.83±0.01,2.82±0.06,1.34±0.04;1.46±0.02,1.76±0.02,1.35±0.02;1.52±0.04,1.89±0.01,1.31±0.04)(q值依次为42.99、60.66、48.08,71.26、72.46、49.50,48.49、82.40、41.18;均P＜0.05),p-ERK 1/2、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白水平增加(均P＜0.05);与SAH组比较,U0126组神经细胞死亡率增加(19.6±6.5％,36.2±7.7％,58.2±12.7％)(q值依次为9.59、10.43、14.66;均P＜0.05),U0126组ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA表达降低(1.23±0.02,1.40±0.02,1.12±0.02;1.22±0.04,1.48 ±0.06,1.24 ±0.03;1.34 ±0.04,1.33 ±0.02,1.14 ±0.04)(q值依次为75.66、65.35、31.11,37.18、26.70、15.56,16.79、51.85、22.58;P＜0.05),p-ERK 1/2、Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白水平降低(P＜0.05);与SAH组比较,Rap组神经细胞死亡率降低(9.1％±4.6％,18.8％±8.6％,28.21％±9.2％)(q值依次为11.86、12.54、16.74;均P＜0.05),Rap组Beclin-1 mRNA和LC3mRNA增加(1.78±0.02,2.27±0.05,1.86±0.04;1.97±0.06,2.31 ±0.08,1.85±0.00)(q值依次为49.57、48.63、72.12、41.96、38.88、71.73;P＜0.05),Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白增加(P＜0.05),ERK1/2 mRNA变化差异无统计学意义(q值依次为2.63、2.65、2.83,P＞0.05),p-ERK1/2蛋白变化差异无统计学意义(P＞0.05).结论 SAH后激活的ERK1/2激活,可促进Beclin-1和LC3-Ⅱ表达介导神经细胞丢失.
关键词： 蛛网膜下腔出血 细胞外调节蛋白激酶1/2 自噬 微管相关蛋白-1 -
黄荆子木脂素3对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用及对蛋白激酶Akt、ERK1/2信号通路的影响
目的:研究黄荆子木脂素3对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用,及其与丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)、细胞外调节蛋白激酶1/2 (ERK1/2)信号通路的关系.方法:以人肝癌HepG2细胞为研究对象,采用MTT法检测空白对照组和0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0 μmol/L黄荆子木脂素3组(n=3)细胞作用48 h后的增殖抑制率；采用细胞计数法检测黄荆子木脂素3(10.0 μmol/L)组、5-氟尿嘧啶(5-FU,10.0 μmol/L)组、溶媒(含0.1％二甲基亚砜的完全培养基)组、空白对照组(n=3)细胞作用24、48、72 h后的活细胞数量；采用蛋白印迹法检测溶媒组、黄荆子木脂素3(10.0 μmol/L)组、磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂LY294002(10.0 μmol/L)组及其混合组(n=3)细胞作用24 h后的磷酸化(p-)Akt和p-ERK1/2蛋白表达.结果:与空白对照组比较,1.0～30.0 μmol/L黄荆子木脂素3组对细胞的抑制率明显升高(P＜0.01)；与溶媒组和空白对照组比较,黄荆子木脂素3组作用不同时间的活细胞数量均明显减少(P＜0.01)；与5-FU组比较,黄荆子木脂素3组作用72 h后的活细胞数量明显增加(P＜0.01)；与溶媒组比较,黄荆子木脂素3组、LY294002组及其混合组细胞内p-Akt和p-ERK1/2蛋白表达均明显降低(P＜0.01),但后3组间差异无统计学意义.结论:黄荆子木脂素3呈浓度和时间依赖性抑制HepG2细胞的增殖,其机制可能与抑制Akt、ERK1/2蛋白磷酸化水平有关.
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环磷酸鸟苷/蛋白激酶G信号通路的激活与再灌注损伤挽救激酶信号通路的关系
目的:观察脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)激活环磷酸鸟苷/蛋白激酶G(cyclic guanosine monophosphate/proteinkinase G,cGMP/PKG)信号通路的心肌保护作用是否与细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinase1/2,ERK1/2)、磷酸酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)蛋白激酶的激活有关.方法:将84只新西兰兔随机分为7组(n=12):假手术组;对照组;BNP组;BNP+LY294002组(LY294002为PI3K抑制剂);LY294002组;BNP+PD98059组(PD98059为ERK1/2抑制剂);PD98059组.除了假手术组只开胸不结扎冠状动脉外,其余6组均于结扎左回旋支45 min后恢复左回旋支血流,进行再灌注180 min.全程观察血流动力学及心电变化;实验终末,各组随机抽取6只兔子心脏做左室梗死面积测定,采用伊文思蓝和氯化三苯基四氮唑双染色法测定心肌梗死面积;每组另外6只兔子心脏取梗死边缘区组织,Western blot方法测定p-Akt/Akt、P-ERK1/2/ERK1/2的表达.结果:心率(heart rate,HR)和平均动脉压(mean arterial blood pressure,MABP)在基线水平上无明显差异(P＞0.05).与基线水平相比,HR和MABP在缺血以及再灌注时期有明显下降(P＜0.05),而在再灌注时期维持较稳定的水平.各组之间HR、MABP差异无统计学意义(P＞0.05);与对照组相比,BNP组心律失常发生率明显减少(P＜0.003 125).与BNP组比较,BNP+LY294002组、LY294002组、BNP+PD98059组及PD98059组心律失常明显增加(P＜0.003 125),BNP+LY294002组和LY294002组,BNP+PD98059组和PD98059组差异无统计学意义(P＞0.003 125);假手术组无心肌梗死.与对照组比较,BNP组心肌梗死范围明显减少(P＜0.05).与BNP组比较,BNP+LY294002组、LY294002组、BNP+PD98059组及PD98059组梗死面积明显增加(P＜0.05).BNP+LY294002组和LY294002组,BNP+PD98059组和PD98059组差异无统计学意义(P＞0.05);与对照组比较,BNP组Akt、ERK1/2的磷酸化水平明显增加(P＜0.05).与BNP组相比,BNP+LY294002组Akt的磷酸化水平及BNP+PD98059组ERK1/2的磷酸化水平分别明显降低(P＜0.05).BNP+ LY294002组和LY294002组Akt的磷酸化水平,BNP+PD98059组和PD98059组ERK1/2的磷酸化水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论:BNP激活cGMP/PKG信号通路,对心肌缺血再灌注损伤产生保护作用,且该通路的激活与再灌注损伤挽救激酶通路的激活有关.
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蒲公英甾醇对氧化损伤心肌细胞保护作用研究
目的 在缺血-再灌注所致氧化损伤模型中观察蒲公英甾醇对小鼠心肌细胞(CSC)的保护作用及机制.方法 使用小鼠CSC细胞作为研究对象,分为正常对照组,缺血-再灌注损伤(I/R)组,蒲公英甾醇治疗缺血-再灌注损伤组(治疗浓度分别为5、10、30 μmol/L)及阳性对照组.通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)测定细胞活力,RT-PCR测定天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3),B淋巴细胞瘤-2(Bel-2)基因水平,生化法测定超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MAD)水平,Western blot测定细胞外信号调节的蛋白激酶1/2 (ERK1/2)水平.结果 MTT测定显示30 μmol/L蒲公英甾醇组I/R损伤的CSC细胞活力增加(P＜0.05).RT-PCR研究结果表明:10、30 μmol/L的蒲公英甾醇组Caspase-3 mRNA表达减少,与I/R组比较差异有统计学意义(P＜0.05);30μmol/L的蒲公英甾醇组Bcl-2 mRNA表达回升,与I/R组比较差异有统计学意义(P＜0.05).生化法测定表明:30 μmol/L的蒲公英甾醇诱导的SOD水平提高,MAD水平降低,与I/R组比较差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot测定显示,30 μmol/L蒲公英甾醇使损伤的CSC细胞磷酸化ERK1/2与总ERK1/2比值增加(P＜0.05).结论 蒲公英甾醇可能是通过上调ERK1/2表达抑制I/R引起的SCS细胞氧化损伤.
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ERK1/2与p38信号通路介导三七皂苷R1抗H2O2致心肌细胞损伤作用
目的:研究三七皂苷R1对过氧化氢(H2O2)诱导乳鼠心肌细胞损伤的影响及对细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinase,ERK1/2)与p38通路的调节.方法:以50 μmol/L H2O2干预原代培养心肌细胞3h建立氧化损伤模型,分别观察0.1、1、10 μmol/L三七皂苷R1对细胞活力、凋亡及细胞内过氧化物酶LDH、MDA及SOD的表达情况,再检测p-ERK1/2 及p-p38蛋白水平;分别以ERK1/2与p38通路特异性阻断剂干预细胞,观察两者对心肌细胞的影响.结果:三七皂苷R1显著增加细胞活力,抑制细胞凋亡,降低LDH与MDA浓度,增加SOD活性,并且能明显降低p-ERK1/2与p-p38表达,以10 μmol/L三七皂苷R1干预效果明显(P＜0.01).阻断ERK1/2与p38通路后,细胞活力增加,凋亡率降低,LDH与MDA浓度降低,SOD活性明显增加.结论:三七皂苷R1能显著减轻H2O2诱导心肌细胞损伤,增加细胞活力,降低凋亡率,主要与调节ERK1/2及p38信号通路有关.
关键词： 三七皂苷R1 心肌细胞 细胞外调节蛋白激酶1/2 P38 氧化应激 -
槲皮素抑制人胚肺成纤维细胞ERK1/2的激活和PDGF的表达
目的 探讨槲皮素对人胚肺成纤维细胞(HELF)表达血小板源性生长因子(PDGF)和细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的调节作用.方法 以支气管肺泡灌洗法收集硅肺患者肺泡巨噬细胞(AM),在体外用含有Si02(50 μg/mL)的DMEM培养基和不含SiO2的DMEM培养基培养18 h,收集AM上清液,加入不同浓度槲皮素.用组织贴块法获取培养HELF,将HELF分为5组:空白对照组、AM组、SiO2联合AM处理组、槲皮素(10、20、40)μmol/L组.WST-1法检测HELF增殖情况,Western blot法检测HELF中PDGF的表达,免疫细胞化学法检测HELF中p-ERK1/2的表达.结果 与SiO2联合AM处理组、AM组相比,各浓度槲皮素组都能抑制HELF增殖,且随浓度增大抑制作用增强,差异有统计学意义(P＜0.01).各种浓度槲皮素均能降低HELF中PDGF的表达、减少HELF中p-ERK1/2的量,呈现剂量-效应关系,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 槲皮素可以抑制人胚肺成纤维细胞PDGF表达和ERK1/2的激活.
