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结核分枝杆菌北京基因型菌株的流行特征及其与耐药的关系——2007年全国结核病耐药基线调查资料分析
目的 探讨结核分枝杆菌北京基因型菌株的流行特征及其与耐药的关系.方法 2007年我国开展全国结核病耐药基线调查,调查覆盖除香港、澳门和台湾地区外的全国31省(自治区、直辖市),含70个调查点.本研究对来自基线调查的3861例涂阳结核病患者的分离菌株进行分析,采用比例法进行药物敏感性试验,以间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)方法对结核病患者的分离株进行基因分型.采用Epi Info 3.5.1建立数据库,SAS9.1软件进行统计学分析,以卡方检验分析不同变量之间的关系,以P＜0.05为有统计学意义.结果 北京基因型菌株在我国广泛流行,占总分离菌株的63.97％(2470/3861).感染北京基因型菌株与年龄(＜30岁和≥60岁:OR=0.9604,95％CI=0.7995～1.1536;30～岁和≥60岁:OR=1.0620,95％CI=0.9071～1.2434,x2=0.3885,Ptrend=0.6977)、性别(OR=1.1526,95％CI=0.9973～1.3321,x2=3.7024,P=0.0543)无关;北京基因型菌株与抗结核药物INH(OR=0.9020,95％CI=0.766～1.0619,x2=1.5356,P=0.2153)、RFP(OR=1.0017,95％CI=0.8166～1.2288,x2=0.0003,P=0.9868)、Sm(OR=0.9406,95％CI=0.8139～1.08711,x2=0.6869,P=0.4072)、EMB(OR=0.9222,95％CI=0.7205～1.1804,x2=0.4140,P=0.5199)、Ofx (OR=0.9624,95％ CI=0.6923～1.3378,x2=0.0520,P=0.8196)和Km(OR=1.1666,95％CI=0.7624～1.7852,x2=0.5049,P=0.4774)任何耐药均无关联;与单耐INH(OR=0.9955,95％CI=0.7206～1.3753,x2=0.0007,P=0.9783)、RFP(OR=0.9615,95％ CI=0.4880～1.8944,x2=0.0129,P=0.9096)、EMB(OR=0.5533,95％CI=0.2023～1.5136,x2=1.3675,P=0.2422)、Ofx (OR=0.8445,95％CI=0.3965～1.7984,x2=0.1926,P=0.6608)、Km(OR=1.7779,95％CI=0.4440～7.1203,x2=0.6791,P=0.4099)也均无关联;与耐多药(MDR) (OR=0.9884,95％CI=0.7594～1.2284,x2=0.0110,P=0.9166)和广泛耐药(XDR)(OR=1.1502,95％CI=0.5372～2.4626,x2=0.1300,P=0.7185)均无显著性关联.结论 我国是北京基因型菌株的高流行区,感染北京基因型菌株与年龄、性别无关,北京基因型菌株与耐药无关.
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基因芯片技术在结核分枝杆菌耐药检测及菌种鉴定中的应用
目的 应用基因芯片技术快速检测结核分枝杆菌的耐药基因型以及分枝杆菌菌种基因型,探讨基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性和基因型的临床价值.方法 应用菌种分型基因芯片技术和间隔区寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing,Spoligotyping)技术对长沙市中心医院2011年1月至2012年12月的临床标本分离菌株137株进行菌种鉴定.对鉴定为结核分枝杆菌的菌株应用绝对浓度法进行利福平和异烟肼药物敏感性检测.并进一步对结核分枝杆菌临床分离株(利福平耐药、异烟肼耐药、敏感株)应用耐药基因芯片技术对rpoB、katG、inhA基因的野生型位点及各突变位点进行检测.即rpoB基因中1个或多个位点的碱基突变为利福平耐药,katG、inhA基因任何基因中的1个或多个位点的碱基突变为异烟肼耐药.Spoligotyping法和基因芯片法菌种鉴定比较应用Kappa检验,绝对浓度法和基因芯片法药物敏感性比较采用x2检验和Kappa检验,均以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 (1)与绝对浓度法比较,对利福平敏感和异烟肼敏感的菌株45株,耐药基因芯片法检测鉴定为敏感株、即野生型的rpoB基因42株,符合率为93.3％(42/45)(不符合的1株为511T-C突变,1株为531C-T突变,1株为516A-T突变);katG基因45株,符合率为100.0％ (45/45);inhA基因43株,符合率为95.6％(43/45)(不符合的2株为inhA-15C-T突变).(2)与绝对浓度法比较,对利福平轻度耐药的耐药菌株18株,耐药基因芯片检测鉴定为rpoB基因突变型的16株,符合率为88.9％(16/18),且与531、516、526、511位点突变相关.对利福平高度耐药的耐药菌株19株,耐药基因芯片检测全部鉴定为rpoB基因突变型,符合率为100.0％(19/19),且与531、516、526、511位点突变相关.(3)与绝对浓度法比较,对异烟肼轻度耐药的耐药菌株13株,耐药基因芯片检测鉴定为katG基因突变型的12株,符合率为92.3％(12/13),与315G-C和315G-A位点突变相关.inhA基因突变型0株.对异烟肼高度耐药的耐药菌株9株,耐药基因芯片检测鉴定为katG基因全部为突变型,符合率为100.0％(9/9),与315G-C和315G-A位点突变相关.inhA基因突变型0株.(4)与Spoligotyping法比较,137株临床分离株中104株分离株基因芯片法检测鉴定为结核分枝杆菌复合群,33株基因芯片法检测出7株鸟分枝杆菌、15株胞内分枝杆菌、1株偶然分枝杆菌、10株龟或脓肿分枝杆菌,与Spoligotyping法比较,结核分枝杆菌复合群一致性为100.0％(104/104),鸟分枝杆菌一致性为77.8％(7/9),胞内分枝杆菌一致性为93.8％(15/16),偶然分枝杆菌一致性为0.0％(0/0),龟或脓肿分枝杆菌一致性为100.0％(8/8).经Kappa检验,Kappa=0.95,U=30.6,P＜0.05.结论 耐药基因芯片检测法与绝对浓度法有高度的一致性,且利福平耐药与rpoB基因的531、516、526、511位点突变相关.异烟肼耐药与katG基因的315位点突变相关,没有发现inhA相关的耐药位点突变.基因芯片方法可快速、准确地检测临床分离株的菌种基因型和耐药性.
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新型胶颗粒芯片技术检测痰标本中结核分枝杆菌及其耐药性的研究
目的 评估一种新型胶颗粒芯片技术[TruArray胶颗粒芯片(Gel element arrays),简称为“TruArray芯片”]用于痰标本中结核分枝杆菌及利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药性的检测效能.方法 选取2016年8月在首都医科大学附属北京胸科医院就诊的149例疑似肺结核患者痰标本,分别进行涂片镜检、BACTEC MGIT 960快速液体培养系统(简称“MGIT 960”)、TruArray芯片和GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)检测,对液体培养阳性菌株进行测序菌种鉴定、MGIT 960药物敏感性试验(简称“药敏试验”)和耐药相关基因测序,分析TruArray芯片检测痰标本中结核分枝杆菌及其耐药性的检测效能.结果 液体培养、GeneXpert和TruArray芯片对结核分枝杆菌的检出率分别为32.2％(48/149),53.7％(80/149)和57.0％(85/149),TruArray芯片和GeneXpert两种方法检出率差异无统计学意义(x2 =0.34,P=0.560),但TruArray芯片检测阳性率高于液体培养(x2=18.59,P＜0.01).以MGIT 960试验结果为标准,TruArray芯片检测痰标本中结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为97.9％(47/48)和61.4％(62/101);以GeneXpert检测结果为标准,TruArray芯片检测结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为97.5％(78/80)和88.4％(61/69).以MGIT 960药敏试验结果为标准,TruArray芯片检测RFP耐药的敏感度和特异度分别为91.7％(11/12)和96.8％(30/31);以GeneXpert检测结果为标准,TruArray芯片检测RFP耐药的敏感度和特异度为85.0％(17/20)和97.9％(47/48);以耐药基因测序结果为标准,TruArray芯片检测RFP耐药的敏感度和特异度分别为92.3％(12/13)和100.0％(30/30).以MGIT 960液体药敏试验结果为标准,TruArray芯片技术检测INH耐药的敏感度和特异度分别为78.6％(11/14)和93.8％(30/32);以耐药基因测序结果为判断标准,TruArray芯片检测INH耐药的敏感度和特异度分别为100.0％(11/11)和94.3％(33/35).结论 TruArray芯片检测技术快速、可靠,在结核病及耐多药结核病快速诊断方面具有非常好的应用前景.
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结核分枝杆菌抗原对人单核细胞核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白12表达的影响
目的 研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原对人单核细胞中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白12(NLRP12)表达的影响,为深入研究NLRP12在结核病中的作用奠定实验基础.方法 采集15例活动性肺结核患者和15名健康人的抗凝血,分离外周血中单核细胞,用Mtb抗原H37Rv全菌裂解液、早期分泌靶抗原6 (EAST-6)和培养分泌蛋白10(CFP-10)的抗原多肽刺激,提取单核细胞的总RNA,采用荧光定量PCR方法检测NLRP12 mRNA的表达,采用配对t检验分析刺激前后单核细胞NLRP12的表达差异.以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 全菌裂解液、EAST-6和CFP-10抗原多肽刺激后的活动性肺结核患者单核细胞与未刺激前的单核细胞相比,其NLRP12 mRNA的表达显著下调,由未刺激前的(1.8±1.26)×10-2分别下降到(1.09±0.78)×10-2(t=3.826,P＜0.01)和(1.14±0.87)×10-2(t=3.695,P＜0.01).全菌裂解液、EAST-6和CFP-10抗原多肽刺激后,健康人单核细胞中NLRP12 mRNA的表达与未刺激前相比也降低,由未刺激前的(1.65±0.99)×10-2分别降至(1.2±0.87)×10-2(t=1.909,P＞0.05)和(1.38±1.02)×10-2(t=1.151,P＞0.05),差异无统计学意义.结论 Mtb抗原体外刺激能够抑制活动性肺结核患者单核细胞NLRP12的表达.
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环介导等温扩增技术检测痰样结核分枝杆菌临床价值评价
目的 评价环介导等温扩增技术(LAMP)检测痰标本中结核分枝杆菌的效果和临床价值.方法 收集深圳市慢性病防治中心2013年4 9月350例结核病专科门诊就诊者的痰标本,其中肺结核患者216例(初诊患者93例,其中涂阳患者41例,涂阴患者52例;随访治疗患者123例),非结核病患者134例(含非结核分枝杆菌感染11例).用涂片法、罗氏培养法、实时PCR法和LAMP法检测样本中的结核分枝杆菌,以临床诊断为标准,用SPSS 17.0软件进行统计学分析,计算LAMP对初诊患者的检出率和检测敏感度和特异度.不同方法之间检测效率的比较采用x2检验,P＜0.05为差异有统计学意义.LAMP与实时PCR法检测的一致性评价采用Kappa检验.结果 上述4种方法检测初诊肺结核患者痰样的敏感度分别为44.1％(41/93)、52.7％(49/93)、48.4％(45/93)、48.4％(45/93),L AMP检测敏感度与实时PCR一致;高于涂片法,低于罗氏培养法,但差异均无统计学意义(x2=0.75,P＞0.05;x2=0.75,P＞0.05).LAMP对初诊涂阳患者的总检出率为90.2％(37/41),对初诊涂阴患者的检出率为15.4％(8/52),诊断肺结核的特异度为100.0％(134/134).对123例治疗随访的患者,涂片、培养、实时PCR和LAMP 4种方法单次检测的阳性率分别为26.0％(32/123)、14.6％(18/123)、31.7％(39/123)和30.9％(38/123).LAMP和实时PCR检测总体一致率为96.9％(339/350),Kappa值为0.91.结论 LAMP检测痰样本结核分枝杆菌用于结核病诊断具有良好的特异度,总体检测效能和实时PCR具有很高一致性,具有临床应用价值.
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TREK Sensititre(R) MYCOTB检测结核分枝杆菌对一、二线抗结核药物的敏感性研究
目的 本研究旨在评价TREK Sensititre(R) MYCOTB(简称“MYCOTB”;一种含有一、二线抗结核药物冻干粉的商品化药敏板)检测一、二线抗结核药物的敏感性的效能.方法 采用随机数字表法选取来自国家结核病参比实验室的151株结核分枝杆菌临床分离株,采用MYCOTB方法对一、二线抗结核药物[包括氧氟沙星(ofloxacin,Ofx)、莫西沙星(moxifloxacin,Mfx)、利福平(rifampin,RFP)、阿米卡星(amikacin,Am)、链霉素(streptomycin,Sm)、利福布汀(rifabutin,Rfb)、对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid,PAS)、乙硫异烟胺(ethionamide,Eto)、环丝氨酸(cycloserine,Cs)、异烟肼(isoniazid,INH)、卡那霉素(kanamycin,Km)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)]进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”).并使用Middlebrook 7H10琼脂比例法(APM)作为对照,研究评估MYCOTB的敏感度、特异度、可行性及两种药敏试验方法的一致率.结果 8/12种药物(Ofx、Mfx、RFP、Sm、Rib、Eto、Km及EMB)的敏感度≥90％,其余4种药物除Cs外,敏感度均≥80％.另外,除Rfb的特异度为86.8％外,其余药物的特异度均≥90％.9/12种药物(Ofx、Mfx、RFP、Am、Sm、PAS、Eto、Cs及Km) MYCOTB和APM的绝对一致率≥94％.10/12种药物(Ofx、Mfx、RFP、Am、Sm、PAS、Eto、Cs、Km及EMB)的MYCOTB和APM的条件一致率≥96％.MYCOTB的平均判读时间为10d,10/12种药物(Ofx、Mfx、RFP、Am、Sm、Rfb、PAS、Eto及EMB)双人判读的一致率≥94％.结论 MYCOTB方法检测Mtb对一、二线抗结核药物的敏感性试验是可行、可靠的.
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117株结核分枝杆菌临床分离株对注射用抗结核药物耐药水平的研究
目的 对临床Mtb菌株进行链霉素(Sm)、卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)的药物敏感性试验(简称“药敏试验”),了解其耐药程度和交叉耐药水平.方法 采用微孔板Alamar blue试验(microplate Alamar Blue assay,MABA),检测117株Mtb临床分离菌株的Sm、Km、Am和Cm的体外低抑菌浓度(MIC)值.Sm、Km、Am、Cm的临界浓度分别为2、4、1、2.5μg/ml.将Sm、Km、Am的MIC值大于临界浓度≤16 μg/ml、32～64 μg/ml、＞64μg/ml分别为低度耐药、中度耐药、高度耐药;Cm的MIC值大于临界浓度≤20μg/ml、40～80 μg/ml、＞80μg/ml分别为低度耐药、中度耐药、高度耐药.结果 117株临床分离株中,83株耐Sm,其中63株(75.9％)为高度耐药,18株(21.7％)为低度耐药,2株(2.4％)中度耐药;23株耐Km和19株耐Am的耐药株中分别有78.3％(18/23)和94.7％(18/19)高度耐药,其余分别为两药的低度耐药菌株,未发现中度耐Km或Am的菌株;14株Cm耐药株的MIC值都在5～20 μg/ml,未发现高度耐药株.83株Sm耐药的菌株中有27.7％ (23/83)和22.9％(19/83)分别对Km和Am耐药,71.1％(59/83)对Am和Km均敏感.Km耐药株和Am耐药株中分别有78.3％(18/23)和94.7％(18/19)同时耐Km和Am(x2=1.157,P＞0.05),且对Km和Am均高度耐药;5株对Km低度耐药,但对Am敏感.Am耐药株和Cm耐药株中,分别有68.4％(13/19)和92.9％ (13/14)同时耐Am和Cm.结论 耐Sm或Km或Am的Mtb临床分离株绝大多数为高度耐药,耐Cm的Mtb临床分离株以低度耐药为主;绝大多数的Sm高度耐药株仍对Am、Km敏感;高度耐Am或Km的菌株互为为完全交叉耐药,Km低度耐药的菌株对Am敏感;Am高度耐药株多数对Cm为低度耐药,绝大多数Cm耐药株对Am高度耐药.
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县级运送痰标本到地市开展基因芯片耐药检测的成本分析
目的 分析区县级结核病防治机构(简称“结防机构”)运送痰标本到地市开展基因芯片耐药检测的成本,为完善耐多药结核病患者发现策略提供数据基础.方法 选取中国不同地区3个具有代表性的项目点,包括江苏连云港,河南开封和重庆永川,收集2011年1月至2012年2月期间数据,采用简单法,根据运送次数、单次运输成本及运输标本数计算单位患者标本运输成本;采用简单法和时间-观察法对3个项目地区基因芯片检测成本进行分析.结果 自2011年1月至2012年2月,连云港、开封和永川三地单位患者运输成本分别为72.47元、84.67元和117.00元,其中运输成本与单次运输患者例数相关,其中单次运输患者例数较少的永川(1.71例/次,552/323)单位患者运输成本高,而单次运输患者较多的连云港(2.76例/次,712/258)单位患者运输成本低.此外,完成基因芯片检测的单位成本为141.56元,其中扩增占全过程总成本的69.0％(97.63元);其次为杂交,占总成本的11.9％(16.79元).在各试验过程中均以试剂、耗材及管理成本所占比例较高,分别占总成本的60.2％(85.26元)、17.5％(24.78元)和12.7％(18.00元).考虑到标本运输和基因芯片检测,完成1例患者检测的总成本约为230.84元,运输频次从每2周4次减少至每2周1次时,标本运输成本占总成本由33.5％降低为11.2％.结论 本研究表明,影响县级机构运送痰标本开展耐药结核病快速检测成本的主要因素包括单次标本运输例数和基因芯片价格.综合考虑运输成本和检测效果,运输频次为2周1次为宜.此外,标本转运开展结核病快速检测模式更适合于人口稠密的中东部地区.
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2012年青岛市结核病耐药性监测分析
目的 全面了解青岛市耐药结核病流行现状和特点,为制定和完善防控措施提供依据.方法 2012年1月1日至2012年12月31日,依据WHO和国际防痨和肺部疾病联合会(IUATLD)结核病耐药监测指南,收集青岛市2012年连续新发涂阳肺结核患者938例和同期新登记的复治涂阳肺结核患者42例,对成功分离的980例结核分枝杆菌菌株,采用比例法对利福平(R)、异烟肼(H)、链霉素(S)、乙胺丁醇(E)等4种药物进行药物敏感性试验.采用SPSS 18.0进行统计学分析,率的比较采用卡方检验,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 2012年青岛市新发涂阳肺结核患者与复治涂阳肺结核患者的总耐药率为22.45％(220/980),初治患者耐药率为21.75％(204/938),复治患者耐药率为38.10％(16/42);总耐多药率为4.69％(46/980),初治患者耐多药率为4.05％(38/938),复治患者耐多药率为19.05％(8/42),复治患者耐多药率明显高于初治患者耐多药率(X2=20.21,P＜0.01).结论 青岛市耐药疫情仍然较重,面临耐多药结核病的挑战,结核病耐药谱呈多态性和复杂性,需采取更全面、更积极的干预措施遏制耐药结核病疫情.
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北京地区对卷曲霉素和阿米卡星耐药结核分枝杆菌的rrs和tlyA基因突变研究
目的 探讨北京地区结核分枝杆菌卷曲霉素(Cm)和阿米卡星(Am)耐药与rrs基因和tlyA基因突变相关性.方法 采用比例法对保存的临床菌株进行Cm和Am药敏试验测定,并对其中的临床菌株rrs基因和tlyA基因进行PCR、测序分析.筛选得到了10株Am耐药菌株、25株Cm耐药菌株、15株Am和Cm交叉耐药菌株,并选择了30株敏感菌株作为对照分析.数据采用SPSS 17.0进行统计分析,组间率的比较采用Fisher精确概率法检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 tlyA基因突变结果显示,Cm耐药菌株有6株突变(24.0％,6/25),与敏感菌株相比差异有统计学意义(P＜0.05),Am耐药菌株、Am和Cm交叉耐药菌株与敏感菌株相比差异无统计学意义(P＞0.05);在m基因检测中,Am耐药、Cm耐药、Am和Cm交叉耐药突变率分别有30.0％(3/10)、8.0％(2/25)和26.7％(4/15),敏感菌株中也有10.0％(3/30)突变株,3组耐药菌株与敏感菌株比较,差异均无统计学意义(F=2.353、0.06、1.161,P值均＞0.05).在3组中,rrs基因A1401G突变位点突变比例分别是10.0％(1/10)、8.0％(2/25)和13.3％(2/15),1株在Am和Cm交叉耐药双位点突变,共计6株A1401G位点突变菌株,与敏感菌株比较无统计学意义(P＞0.05).另一突变位点C1402T在Am、Am和Cm交叉耐药中各1株.结论 结核分枝杆菌tlyA基因可能与Cm耐药相关,与Am耐药不相关;rrs基因A1401G和C1402T突变可能与Am和Cm交叉耐药有关.
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131株耐多药结核分枝杆菌对利福布丁与利福平交叉耐药的研究
目的 观察利福布丁对MDR-TB菌株的抑菌效力及其与利福平的交叉耐药性,了解对利福布丁与利福平交叉耐药菌株rpoB基因突变特征.方法 采用间隔抽样法,从2007-2008年全国结核病耐药基线调查的401株MDR-TB菌株中抽样,传代后获得131株MDR-TB菌株.用微孔板Alamar blue法测定利福平和利福布丁对MDR-TB菌株的低抑菌浓度(MIC),采用直接测序法检测MDR-TB菌株rpoB基因突变,分析rpoB基因突变对两者交叉耐药性的影响.采用SPSS 11.0软件进行统计分析,交叉耐药率比较采用x2检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 在131株MDR-TB菌株中,利福平MIC中位数值为256μg/ml,利福布丁MIC中位数值为2 μg/ml.通过测定MIC的方法,利福平与利福布丁交叉耐药率为76.47％(91/119).在MDR-TB菌株中,发生rpoB基因突变113株(86.26％,113/131),包括531、526、516、513、511、522、533等7种单位点突变,其中以密码子531(56.50％,74/131)、526(16.03％,21/131)突变为常见.不同rpoB基因突变的MDR-TB菌株,526、531位点突变出现利福平与利福布丁交叉耐药的比例高,分别占90.48％(19/21)、78.38％(58/74),与无突变组(44.44％,8/18)比较,差异均有统计学意义(x2值分别为9.641、8.223,P值均＜0.05).结论 利福布丁与利福平存在交叉耐药性,但利福布丁有更强的抑菌能力.MDR-TB菌株不同rpoB突变类型,利福平与利福布丁交叉耐药性不同.
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结核分枝杆菌对氯法齐明耐药的体外诱导实验研究
目的 利用浓度梯度倍增的氯法齐明(clofazimine,Cfz)体外诱导获得结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)耐药株,并进行耐药机制的初步研究.方法 选取Mtb标准株H37Rv,从亚低抑菌浓度(subminimal inhibitory concentration,sub-MIC) [1/8 MIC(按照Cfz的MIC值为0.12 μg/ml配置)、1/4 MIC、1/2 MIC …]开始,在Cfz浓度倍增的7H11固体培养基上进行传代培养,逐步诱导菌株对Cfz的耐药性,并通过药物敏感性试验和全基因组测序来进行验证;同时利用Alamar blue微板分析法(microplate Alamar blue assay,MABA)测定诱导耐药菌株对10种抗结核药物(INH、RFP、EMB、Mfx、Lzd、Cs、Cm、TMC207、TBI-166、Cfz)的MIC情况.结果Mtb标准株经诱导后对Cfz的MIC值是诱导前的32～64倍(诱导前Cfz的MIC值是0.12 μg/ml).对10种抗结核药物敏感性试验显示,Cfz诱导耐药菌株对TMC207 (Bendaquiline)及TBI-166产生交叉耐药.耐药株在7H9液体培养基中进行无药连续培养10代后,测定其MIC值无明显变化,MIC数值都稳定在32MIC～64MIC之间,对此诱导耐药株进行全基因组测序共检测到195个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisma,SNP)突变和19个插入缺失(InDel)突变.结论从亚MIC药物浓度开始,逐渐递增的长期药物刺激能够诱导结核分枝杆菌对氯法齐明的获得性耐药,获得的耐药株耐药性稳定.
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改良萋-尼染色法检测分枝杆菌的效果评价
目的 评估改良萋尼染色液染色镜检分枝杆菌在痰涂片中的检测效能.方法 2014年6月至2014年9月于北京结核病控制研究所和广州市胸科医院顺序纳入就诊,按照临床症状和体征、临床相关检测判断为可疑肺结核病患者835例痰标本共1024份(北京结核病控制研究所435例505份痰标本,广州市胸科医院400例519份痰标本),分别涂片进行传统萋-尼染色法(三步法)镜检、改良萋-尼染色法(二步法)镜检和简单法固体罗氏培养(L-J法),比较两种染色方法结果的一致性,并以L-J法结果为金标准,比较两种染色法阳性检出率的差异、诊断的准确性及可操作性.结果 改良萋-尼染色法和传统萋-尼染色法的阳性检出率分别为1l.62％(119/1024)和11.91％(122/1024),差异无统计学意义(X2=3.18,P＞0.05),两法有良好的一致性(Kappa＞0.75);以L-J法结果为金标准,改良萋-尼染色和传统萋-尼法检测结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为52.94％(90/170)和56.47％(96/170);97.66％(834/854)和96.96％(828/854).以上两种方法的ROC曲线下面积分别是0.76和0.77,有中等的诊断价值.结论 改良萋-尼染色法在检出分枝杆菌方面比传统萋-尼染色法有较好的敏感度与特异度,对于诊断肺结核有较好的诊断价值.
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三种方法进行结核分枝杆菌-乙胺丁醇药物敏感性试验的比较
目的 比较3种以细菌培养为基础的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)方法检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇的药物敏感性.方法 采用改良罗氏培养基比例法(L-J法)、Bactec MGIT 960检测系统法(960法)和微孔板Alamar blue显色法[低抑菌浓度法(MIC法)]同步对126株结核分枝杆菌临床分离株进行乙胺丁醇药敏试验,比较分析3种方法的药敏试验结果.试验数据采用SPSS 17.0软件进行分析处理.Kappa值在0.4～0.75为一致性较好,Kappa值≥0.75为一致性极佳,Kappa值＜0.4为一致性差.结果 3种方法总体一致率为75.4％(95/126).若以L-J法测定结果为判断标准,则960法和MIC法的敏感度、特异度和一致率分别为62.8％(49/78)、100.0％(48/48)、77.0％(97/126)和82.1％(64/78)、97.9％(47/48)、88.1％(111/126),MIC法与L-J法一致性极佳(Kappa=0.76),而960法与L-J法比较显示一致性较好(Kappa=0.56).若以960法测定结果为判断标准,则L-J法和MIC法的敏感度、特异度和一致率分别为100.0％(49/49)、62.3％(48/77)、77.0％(97/126)和98.0％(48/49)、77.9％(60/77)、85.7％(108/126),L-J法和MIC法均显示与960法有较好一致性(Kappa≥0.70).若以MIC法测定耐药结果为判断标准,则L-J法和960法的敏感度、特异度和一致率分别为98.5％(64/65)、77.0％(47/61)、88.1％(111/126)和73.8％(48/65)、98.4％(60/61)、85.7％(108/126).3种方法的不一致性主要表现在MIC值4.0～16.0μg/ml的药物浓度范围.结论 3种方法对乙胺丁醇进行药敏试验具有较好的一致性,但也存在一定差异.L-J法和960法均与MIC法具有较高一致性,且MIC法性价比更高,适于耐乙胺丁醇结核病的早期诊断.
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基因芯片检测耐利福平结核分枝杆菌准确性的Meta分析
目的 对基因芯片方法在检测耐利福平结核分枝杆菌的准确性进行系统评价,为基因芯片技术应用于临床检测耐药结核分枝杆菌的必要性提供证据.方法 计算机检索The Cochrane Library(2014年第1期)、PubMed、EMbase、Wanfang Data、CNKI数据库,检索时限均为建库至2014年2月.由2位研究者根据纳入与排除标准独立筛选文献、提取资料,采用评价诊断准确性质量研究(quality assessment of diagnostic accuracy studies, QUADAS)条目评价纳入研究论文的方法学质量,检出相关文献223篇,按照标准纳入22篇文献.采用Meta-DiSc1.4软件对其敏感度(SEN)、特异度(SPE)、阳性似然比(十LR)、阴性似然比(-LR)、诊断比值比(DOR)进行异质性检验和合并分析,绘制汇总受试者工作特征(SROC)曲线,计算曲线下面积(AUC).结果 共纳入22篇文献(包括一篇多中心研究文献),25个研究,包括4879株经传统药敏试验鉴定结核分枝杆菌菌株,其中耐RFP菌株(1314株)、敏感菌株(3565株).基因芯片技术检测Mtb对RFP耐药的SEN合并为0.89[95 ％CI (0.87～0.91)]、SPE合并为0.98[95％ CI(0.97～0.98)]、+LR为30.89[95％CI (22.15～43.06)]、-LR为0.10[95％ CI (0.07～0.15)]、DOR合并为354.06[95％CI (212.09～591.07)]、AUC为0.9833.结论 基因芯片方法具有较好的诊断价值;以传统药敏法为金标准,基因芯片方法特异度、敏感度,诊断OR值均较高,说明其在Mtb对RFP耐药检出率较高,可作为临床结核分枝杆菌耐药检测的辅助手段.
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快速生长分枝杆菌肺病94例临床分析
目的 探讨快速生长分枝杆菌肺病的临床特点、药物敏感性试验(简称"药敏试验")情况、治疗及其转归.方法 回顾性分析94例广州市胸科医院2008年1月至2014年6月确诊为快速生长分枝杆菌肺病的临床资料.结果 本组患者中,73.4％(69/94)存在基础肺部疾病,其中60.6％(57/94)为肺结核,41.5％(39/94)为支气管扩张.胸部CT检查显示病灶多侵犯双侧,占75.5％(71/94).支气管扩张型72例,薄壁空洞40例.共分离出276株菌株,63.4％(175/276)为龟-脓肿分枝杆菌复合群.药敏试验显示阿米卡星、克拉霉素的敏感度高,分别为87.7％(242/276),80.1％(221/276).98.9％(93/94)患者治疗后症状缓解.参照药敏试验结果,52.1％(49/94)患者采用3～4种敏感药物经规律治疗6个月后痰菌转阴,但仍有47.9％(45/94)患者的痰菌持续阳性.结论 快速生长分枝杆菌肺病临床症状缺乏特异性,胸部CT检查可见病灶多侵犯双侧,薄壁空洞为主,多侵犯上叶,伴双肺散在支气管扩张,阿米卡星、克拉霉素的药物敏感度高,早期完善菌种鉴定及药敏试验有助于制订该病的诊疗计划.
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结核分枝杆菌北京基因型亚型的流行及与耐药性的关系研究
目的 通过分析Mtb北京基因型基因组NTF(noise transfer function)区插入序列IS6110,揭示北京基因型在进化过程中所形成的古代株和现代株2个亚型在天津市的流行情况及其与耐药表型的关系.方法 收集2012-2014年天津市临床分离的816株Mtb菌株.采用PCR试验分析菌株基因组中差异区域(Region of difference,RD) RD207和RD105片段是否有缺失,以鉴定是否为北京基因型.通过检测北京基因型菌株基因组NTF区中IS6110插入序列的数目,了解北京基因型菌株中古代株和现代株所占的比例,并进一步分析这两种亚型与菌株耐药表型间的关系.计数资料采用卡方检验进行分析,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 在所分析的816株临床分离的Mtb菌株中,764 (93.63％)株为北京基因型菌株.764株北京基因型菌株中,110株(14.40％)为古代株,654株(85.60％)为现代株.现代株中仅有1株为北京基因型W株.在古代株和现代株中,耐异烟肼菌株分别占26.36％(29/110)和10.70％(70/654)(x2=20.47,P＜0.01);耐利福平菌株分别占14.55％(16/110)和6.57％(43/654)(x2=8.40,P＜0.01);耐乙胺丁醇菌株分别占8.18％(9/110)和3.21％(21/654),(x2=6.17,P＜0.05).此外,MDR-TB患者中古代株和现代株分别占13.64％(15/110)和4.74％(31/654)(x2=13.17,P＜0.01).结论 Mtb北京基因型中的现代株是天津市的主要流行株,但古代株与耐药结核病的关系更为密切,提示在天津市,对抗结核药物产生耐药并不是导致北京基因型广泛流行的主要因素.
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传统培养法与PCR-荧光探针法鉴定分枝杆菌的对比研究
目的 比较传统培养法和PCR-荧光探针法在分枝杆菌的鉴定中有无差异.方法 对1552株分枝杆菌临床分离株同时用传统培养法对硝基苯甲酸(PNB)、噻吩二羧酸肼(TCH)培养基生长试验及PCR-荧光探针法进行鉴定,结果有差别的菌株用16SrRNA基因测序的方法进行确认.结果 两种方法非结核分枝杆菌的符合率为75.4％(46/61),结核分枝杆菌复合群的符合率为99.0％(1491/1506),总体符合率为99.0％(1537/1552).两种方法检测结果不同的15株样本经16SrRNA基因测序进行鉴定,PCR-探针法与16SrRNA结果一致的有14株,另外1株经传代分离纯化后测序结果为结核分枝杆菌和戈登分枝杆菌的混合菌.非结核分枝杆菌对PNB培养基的敏感度为21.7％(13/60),有0.1％(1/1492)的结核分枝杆菌复合群对PNB表现耐受性.对PNB敏感的13株非结核分枝杆菌中,有76.9％(10/13)为堪萨斯分枝杆菌.结论 部分非结核分枝杆菌使用PNB-TCH生长试验进行鉴定时会出现误判,而PCR-荧光探针法鉴定结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的准确性较高.
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高通量结核分枝杆菌蛋白可溶表达筛选平台的构建与应用
目的 为了改变结核分枝杆菌蛋白质的结构与功能研究由于受结核分枝杆菌蛋白难以可溶性表达和纯化的影响而进展缓慢的问题.方法 将多个能促进可溶性表达的蛋白标签与高通量的Gateway克隆技术相结合,构建结核分枝杆菌蛋白可溶性表达快速通量的筛选平台.挑选46个不同分子量且已知以包涵体形式表达或者不表达的结核分枝杆菌蛋白的基因,分别克隆到带有N-末端的氮源利用物质A(N utilization substance A,NusA)、小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier-1,SUMO)、麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)、硫氧还蛋白(thioredoxin A,TrxA)、酰基载体蛋白(acyl carrier protein,ACP)五种蛋白标签基因的载体上,进行融合表达,分析比较各标签促进可溶性表达的效果.结果 融合NusA标签后,19个蛋白以可溶性形式表达,占总样本的41％(19/46);同时融合SUMO、MBP、TrxA、ACP标签后,可溶性表达的蛋白也分别达到总样本数的22％ (10/46)、26％(12/46)、26％(12/46)、22％ (10/46).结论 结核分枝杆菌蛋白可溶性表达快速通量筛选平台的建立,实现了结核分枝杆菌重组蛋白可溶性表达的快速通量筛选,为更进一步研究结核分枝杆菌蛋白、特别是重要药物靶标蛋白的结构与功能创造了条件.
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346例肺结核患者结核分枝杆菌耐药性调查及耐多药结核病影响因素分析
目的 了解当今结核分枝杆菌的耐药情况,并探讨引起耐多药结核病患者产生的危险因素.方法 收集我院2014年1-12月346例肺结核患者临床诊疗信息及其临床分离株,其中男209例,女137例,年龄14～87岁,平均年龄(36.98±0.97)岁.采用比例法检测结核分枝杆菌对抗结核药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、氧氟沙星、卡那霉素)的敏感性,采用多因素非条件logistic回归分析耐多药肺结核患者的相关影响因素.P＜0.05为差异有统计学意义.结果 346株结核分枝杆菌菌株中,耐药率为28.0％(97/346);初治患者耐药率为20.1％(54/268),复治患者耐药率为55.1％(43/78),复治患者耐药率明显高于初治耐药率(x2=28.71,P＜0.01).耐多药率为15.0％(52/346);复治患者耐多药率为44.9％(35/78),初治患者耐多药率为6.3％(17/268),复治患者耐多药率明显高于初治耐多药率(x2 =70.299,P＜0.01).广泛耐药率为2.6％(9/346);复治患者广泛耐药率[6.4％(5/78)]高于初治患者广泛耐药率[1.5％(4/268)](x2=5.767,P＜0.05).患者耐多药单因素分析表明,不同性别、年龄组耐多药率差异无统计学意义(x2值分别为0.635、3.110,P值均＞0.05).患者耐多药多因素分析表明,复治患者耐多药率高于初治患者(OR=9.439,95％CI=4.317～20.639,x2=70.299,P＜0.01)、结核病合并糖尿病的患者耐多药率高于非合并糖尿病患者(OR=4.018,95％CI=1.038～15.551,x2=6.630,P＜0.05)、不规律用药的患者耐多药率高于规律用药患者(OR=3.91,95％CI=1.385～11.041,x2=18.492,P＜0.01).结论 当前石家庄市耐多药结核疫情处于全国较高水平.合并糖尿病、反复多次治疗及不规律用药等可能是导致患者耐多药的危险因素.
