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一起暴发性病毒性脑炎的病原学调查
目的 分离鉴定引发2010年河南省一起病毒性脑炎暴发的病原，并进一步分析该病原体分离株外壳蛋白1(VP1)区基因特征。方法 于2010年4月河南省平顶山市鲁山县病毒性脑炎暴发期间，采集8例住院患儿的粪便标本（共8份），其中3例患儿同时采集脑脊液标本（共3份），未采集到脑脊液标本的5例患儿中4例采集了血清标本（共4份）。对标本进行病毒分离和肠道病毒(EV)组合血清鉴定，对阳性分离物采用逆转录PCR方法扩增VP1区基因、测定核苷酸序列并进行亲缘进化分析。结果 采集的脑脊液、血清、粪便标本共15份，荧光定量PCR检测结果显示，11份标本EV通用检测阳性，其中2份粪便标本分离到2株病毒毒株，EV组合血清鉴定血清型别均为柯萨奇病毒(Cox)阳性，VP1区全长基因序列均为849 bp，与Cox B5的核苷酸相似性为77.1％～96.9％,氨基酸相似性为95.8％ ～ 100％，遗传发育树分析与D基因型属同一分支。结论 CoxB5是引起本次河南省平顶山市鲁山县病毒性脑炎暴发的病原体，其基因型为D基因型。
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柯萨奇病毒A16型YY157株在Vero细胞中培养与增殖特性的研究
目的 探索柯萨奇病毒A16型(CVA16) YY157株在非洲绿猴肾(Vero)细胞中培养与增殖的合适条件.方法 把CVA16 YY157株接种于Vero细胞适应性传代,挑斑纯化后,在不同条件下培养并比较其对病毒滴度的影响.结果 CVA16 YY157株在Vero细胞中培养能导致细胞病变(CPE),可形成蚀斑.将此CVA16病毒以0.01 ～0.1MOI接种于Vero细胞,并在低于2％牛血清浓度的培养基,35℃培养60 h,CPE可达90％以上;此条件下收获培养液上清,可得到较高滴度的病毒.结论 初步建立了CVA16 YY157株在Vero细胞中培养与增殖的方法,为其下一步的大规模培养及疫苗制备奠定了基础.
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无菌性脑膜炎暴发中柯萨奇B3病毒的基因特征分析
目的 明确2008年山东省临沂市郯城县无菌性脑膜炎暴发的病原,对分离到的柯萨奇B3病毒的基因特征、遗传变异规律及进化来源进行分析.方法 采集暴发病例的粪便、脑脊液标本,应用RD、Hep-2细胞进行病毒分离;阳性分离物分别采用中和试验、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和核苷酸序列测定方法进行定型,后与GenBank中检索到的其他CVB3毒株进行同源性分析,并构建VP1完整编码区亲缘进化树研究其遗传进化规律.结果 共采集22份粪便和120份脑脊液标本,分离到病毒35株,经鉴定34株为CVB3,1株为ECH030.34株CVB3分离株VP1区部分序列(381 bp)核苷酸同源性为90.5%～100%,氨基酸同源性为98.4%～100%;与Nancy原型株的核苷酸同源性为79.5%～81.6%,氨基酸同源性为98.4%～99.2%.012/2008TC/SD/CHN和177/2008TC/SD/CHN与安徽2008年分离的Fuyang19株同源性高,核苷酸同源性分别为98.2%和91.0%,氨基酸同源性分别为99.2%和98.9%;进化树分析显示,中国大陆分离株独处一支,且呈单源性发生关系.结论 此次脑膜炎暴发的病原是CVB3.它与其他的中国分离株同源性高,与国外分离到的CVB3具有不同的基因特征.
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柯萨奇病毒IgM抗体胶体金免疫层析快速诊断试纸条的研制
目的 建立一种快速检测柯萨奇病毒IgM抗体的胶体金免疫层析试纸条,并优化制备中各关键步骤的实验条件.方法 以柠檬酸三钠还原法制备20 nm的胶体金溶液,标记羊抗人IgM,制备免疫胶体金复合物,组装胶体金免疫层析快速诊断试纸条.结果 用柠檬酸还原法制备的20nm胶体金溶液呈亮红色.胶体金标记羊抗人IgM低稳定量是1 μg/ml,适稳定量为1.5 μg/ml.适pH为8.2.血清标本检测结果与进口ELISA试剂盒比较差异无统计学意义.结论 胶体金免疫层析试纸条制备质量不但与抗原抗体的质量、层析材料的选择、胶体金的制备与标记等因素密切相关,而且缓冲系统、辅助添加剂的选择与优化也非常重要.
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2005年四省、区的柯萨奇病毒A组16型血清流行病学研究
目的 了解2005年中国广东、黑龙江、新疆和云南四省、区1～5岁年龄儿童中的柯萨奇病毒A组16型(CVA16)抗体水平,为防控CVA16引起的手足口病的流行提供科学依据.方法 随机挑取上述四省、区2005年1～5岁年龄儿童血清503份进行CVA16的微量中和实验.结果 CVA16抗体阳性率在广东、黑龙江、新疆和云南分别为41.90%、9.40%、40.00%和34.40%.平均抗体滴度(GMT)均较低(平均为1:6.1),广东、黑龙江和云南各省内各年龄组间GMT差异无统计学意义(F值分别为0.97、0.40、1.06,P均>0.05),而四省、区间比较,黑龙江与其他三个省、区GMT差异有统计学意义(F=10.61,P<0.00).结论 2005年或以前CVA16已经在四省、区存在局部流行,但是不同省、区间的CVA16流行传播范围和程度不相同;1～5岁年龄段儿童是CVA16的易感人群.
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2010年湖北省急性出血性结膜炎病原鉴定及基因进化分析
目的 鉴定引起2010年湖北省急性出血性结膜炎(acute hemorrhagic conjunctivitis,AHC)疫情的病原体,并对其进行基因进化分析.方法 采集20份门诊AHC患者眼结膜拭子,对其进行病毒分离,随后通过PCR方法分别检测阳性分离物中肠道病毒70型(human enterovirus D-70,EV-D70)和柯萨奇A24变异株(Coxsackievirus A24 variant,CV-A24v).对CV-A24v分离株进行VP1区和3C区全序列测定,分析其与全球流行CV-A24v的基因进化关系.结果 20份标本中有11份病毒分离阳性,PCR检测表明这11份病毒分离物为CV-A24v.基于3C区和VP1区构建的基因进化树表明湖北CV-A24v属于GenotypeⅣ基因型的Cluster 3(GⅣ-C3),而且在GⅣ-C3内湖北CV-A24v分属于A和B两个传播链.结论 本研究表明2010年至少有两个CV-A24v传播链在湖北同时流行.
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短双链RNA对柯萨奇B组3型病毒体外感染的抑制作用研究
目的 利用RNA干扰技术,在细胞、蛋白和基因水平上观察短双链RNA对柯萨奇病毒体外感染Hela细胞的增殖抑制作用、对病毒RNA复制和蛋白合成的影响.方法 应用病毒致细胞病变作用保护实验、空斑形成减少实验、Western Blot、RT-PCR等方法,在体外检测其抗CVB3病毒作用.结果 设计、合成的8条SiRNA中,针对基因组2B、VP4、2A、3C区的SiRNA-2、SiRNA-3、SiRNA-6、SiRNA-7具有不同程度的抑制病毒作用.其中,病毒基因组2B的SiRN-2作用效果好,对Hela细胞CVB3感染72 h后致细胞病变和空斑形成的抑制率为95%,抑制病毒蛋白的合成,病毒基因的复制水平也显著降低,在病毒0.1、0.01、0.001、0.0001 MOI感染水平上对CVB3致细胞病变作用的抑制率分别为30%、70%、88%和99%(48 h).结论 针对CVB3基因组2B的SiRNA-2具有较强的抑制柯萨奇B3型病毒感染的作用.
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EB病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和柯萨奇病毒感染和多发性硬化复发关系的研究
目的 探讨0EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒-1(HSV-1)、柯萨奇病毒B组Ⅰ-Ⅵ型近期活动性感染和复发.缓解型多发件硬化(RR MS)复发的关系.方法 采用酶联免疫吸附法检测34例RR MS患者和200名正常对照者血浆EB病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒-1、柯萨奇病毒B组Ⅰ-Ⅵ型IgM抗体,比较病例组和对照组间上述病毒近期活动性感染率的差别,并对病例组病毒近期活动性感染者和无活动性感染者的临床资料进行分析比较.结果 两组问EB病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒-1及柯萨奇病毒B组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ型IgM抗体阳性率的差异无统计学意义.RR MS组和对照组间柯萨奇病毒B组Ⅳ型、Ⅴ型IgM抗体阳性的差异有统计学意义(分别为3/34和0/200,P<0.05;2/34和0/200,P<0.05).病例组中任一病毒近期活动性感染者和无活动性感染者相比,其年龄、病程、发作次数、入院体温、血白细胞分类计数(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)、糖皮质激素应用与否及EDSS分值间的差异均无统计学意义.结论 RR MS患者复发期柯萨奇病毒B组Ⅳ型、Ⅴ型近期活动性感染率较高,但近期病毒活动性感染和症状的严重度无关,未发现EBV、CMV、HSV与RR MS复发的关系.
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113例实验室确诊手足口病流行病学特征和临床特点分析
目的 了解不同病原类型以及普通、重症病例手足口病患儿的流行特征及临床特点.方法 采用描述流行病学方法对113例实验室确诊手足口病病例的流行病学特征和临床特点进行详细分析.结果 113例手足口病确诊病例流行特征与同期疫情流行特征基本相同,不同病原类型以及普通、重症病例手足口病部分临床特点存在差异.结论 应根据本病特点开展防控工作,早期识别重症病例,重点应做好暴发疫情的调查处置,减少重症和死亡病例.
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用逆转录PCR-核酸探针杂交法对柯萨奇B组病毒分型诊断
目的建立一种逆转录PCR-核酸探针杂交法对柯萨奇B组病毒(CVB1～6)进行分型诊断.方法一对通用PCR引物,它能有效扩增所有CVB1～6型的特异性DNA片段;另选取6条各型特异性寡核苷酸探针,将它们分别共价结合在不同的微孔板上.经过一次PCR扩增,扩增后的产物分别与包被有不同探针的微孔板进行杂交检测,从而有效鉴别CVB各型. 结果本法与ELISA法的分型比较显示它们具有很好的一致性,无错误分型.对152例IgM抗体阳性标本的检测,该方法阳性率为71.7%. 结论本法可准确对CVB进行分型,为CVB的临床诊断及流行病学调查提供了一种有效的方法.
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黑龙江省克山病病区内外环境硒水平及人群柯萨奇B组病毒感染现况调查
目的 了解黑龙江省克山病病区内外环境硒水平及柯萨奇B组病毒(CVB)人群感染情况,为采取有针对性的防治措施提供依据.方法 在克山病病区设立病区病例组和病区对照组,在非病区设立非病区对照组,采集血液样品用于检测血硒及CVB IgM抗体,同时采集病区和非病区土壤、粮食用于硒测定;硒的测定采用氢化物发生原子荧光光度法.CVB IgM抗体采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测.结果 病区土壤、玉米、小麦、大豆含硒量[(0.092±0.011)、(0.003±0.001)、(0.005±0.003)、(0.006±0.001)mg/kg]均低于非病区[(0.198±0.016)、(0.012±0.004)、(0.037±0.007)、(0.037±0.008)mg/kg],二者比较差异均有统计学意义(t值分别为17.007、8.551、15.842、12.109,P<0.01).病区病例组血硒[(34.803±13.302)μg/L]低于病区对照组[(41.235 ±13.571)μg/L],二者比较差异有统计学意义(P<0.05);病区病例组、病区对照组、非病区对照组的CVB感染阳性率分别为90.0%(36/40)、68.3%(41/46)、45.8%(22/48),病区和非病区CVB感染的比值比(OR)为3.957,95%可信区间为1.898～8.246;病区病例组和病区对照组CVB感染的OR值为4.171,95%可信区间为1.298～13.404;CVB感染组与未感染组血硒水平比较,差异无统计学意义(t=1.179,P>0.05).结论 黑龙江省克山病病区仍存在低硒及CVB感染情况.
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柯萨奇B组病毒感染与云南省地方性猝死的关系
目的探讨柯萨奇B组病毒(Coxsackievirus B,CVB)感染与云南省地方性猝死的关系.方法根据流行病学现场调查和临床检查资料,在病区设立病例组和内对照组,在非病区设立外对照组.酶联免疫法(ELISA)检测3组人群近期CVB感染情况及CVB阳性患者CVB1～6型的分布.结果CVB非特异性IgM抗体阳性率在内对照组为88.5%,外对照组为29.2%,两组之间差异有统计学意义(x2=33.975,P＜0.01);病区CVB非特异性IgM抗体阳性率在病例组为92.0%,内对照组为88.5%,两组之间差异无统计学意义(x2=0.248,P＞0.05).CVB阳性患者亚型分布,在病区内以CVB5(53.3%)、CVB6(34.8%)为主,CVB3未检出,CVB1(2.2%)、CVB2(1.1%)、CVB4阳性患者(8.7%)有少量检出;在非病区内以CVB1(42.9%)为主,CVB3、CVB5未检出.结论CVB感染与云南省地方性猝死有一定的关联,CVB感染是云南省地方性猝死的可疑危险因素.
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柯萨奇B5病毒所致无菌性脑膜炎暴发的病原学鉴定及基因特征分析
目的 对2009年山东省临沂市起无菌性脑膜炎暴发所分离的病原体进行鉴定,并分析其基因特征.方法 采集无菌性脑膜炎患者脑脊液标本42份,分离病毒；RT-PCR扩增阳性分离物,测定VP1核苷酸序列,与GenBank中其他毒株进行同源性分析,并构建VPI基因亲缘进化树.结果 分离到肠道病毒17株,经肠道病毒组合血清中和试验和分子分型鉴定为柯萨奇B5病毒(CVB5).CVB5分离株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为92.3％～100.0％和98.7％～100.0％,与CVB5原型株(Faulkner株)的核苷酸和氨基酸的同源性分别为81.0％～82.4％和9 6.6％～97.0％.VP1区亲缘进化树分析显示,全球CVB5可分为A、B、C、D共4个基因型,引起本次无菌性脑膜炎暴发的CVB5属于基因型D,但位于不同的传播链中.结论 CVB5是此次临沂市无菌性脑膜炎暴发的病原体,分离株之间有较大的遗传差异,但均属于D基因型.
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内皮间充质转化与急性病毒性心肌炎早期心肌纤维化的关系
目的:探讨心脏内皮间充质转化(EndMT)与急性病毒性心肌炎心肌纤维化形成的关系.方法:28只Balb/c小鼠随机分为对照组(n=8)、心肌炎组(n=10)和心肌炎+重组人骨形成蛋白7 (rh-BMP7)干预组(干预组,n=10).心肌炎组和干预组小鼠1次性腹腔接种柯萨奇病毒B3( CVB3),对照组小鼠腹腔注射等量病毒培养液,对照组和心肌炎组小鼠次日一次性腹腔注射生理盐水0.1ml,干预组小鼠腹腔注射等量rh-BMP7(300 μg/kg)以抑制转化生长因子(TGF-β1)；7d后处死小鼠取心脏,以苦味酸天狼星红染色后计算心脏胶原容积积分(CVF),实时RT-PCR法和Western blot方法检测小鼠心脏中TGF-β1、内皮细胞标志物(CD31和VE-cadherin)、成纤维细胞特异蛋白( FSP-1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原(Collα1)的基因和蛋白表达情况.结果:与对照组比较,心肌炎组小鼠心肌坏死区出现明显心肌纤维化,也出现了以内皮细胞表型( CD31、VE-cadherin)丢失、间充质细胞表型蛋白(FSP-1、α-SMA)和胶原Collα1增多为特征的EndMT现象；同时,TGF-β1表达明显增高；抑制TGF-β1可以同时逆转EndMT和心肌纤维化.结论:EndMT参与急性病毒性心肌炎心肌纤维化的形成,TGF-β1是重要介导因子.
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小鼠IFN-γ基因佐剂对分泌型柯萨奇病毒B3 VP1核酸疫苗免疫作用的影响
目的: 构建小鼠IFN-γ真核表达质粒,观察其对分泌型柯萨奇病毒B3(CVB3)核酸疫苗的影响. 方法: 以RT-PCR扩增小鼠IFN-γ基因,构建真核表达重组质粒pcDNA3/mIFN-γ,检测其在cos-7细胞内的表达;将分泌型pcDNA3/sVP1, pcDNA3/sVP1+ pcDNA3/mIFN-γ肌注免疫小鼠,每2 wk注射1次,共3次,每次免疫后13 d取血测血清抗体水平. 末次免疫后2 wk,以500 TCID50的CVB3腹腔内感染,观察小鼠的存活情况. 结果: 成功构建了pcDNA3/mIFN-γ并能有效表达;pcDNA3/sVP1组和pcDNA3/sVP1+pcDNA3/mIFN-γ组均能诱导小鼠产生中和抗体,抗体滴度随免疫次数的增加而提高,但两组小鼠抗体滴度和生存率无显著性差异;混合质粒注射组血清的病毒滴度明显低于pcDNA3/sVP1组,且心肌病理损伤明显减轻. 结论: IFN-γ作为基因佐剂,在一定程度上增强了分泌型 CVB3 VP1基因疫苗的免疫保护作用.
