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双向电泳-质谱法探索实验性重症肌无力大鼠疾病相关蛋白
目的:分离和鉴定实验性自身免疫性重症肌无力大鼠血清差异表达蛋白,寻找并比较疾病相关蛋白,以进一步阐明重症肌无力的发病机制.方法:采用二维蛋白电泳技术分离正常组和模型组大鼠血清差异表达蛋白,凝胶经银染显色后,Bio-Rad凝胶扫描仪扫描,Imagemaster图像软件分析,差异蛋白点用基质辅助激光解析电离-两级飞行时间串联质谱法进行鉴定.结果:通过双向电泳,建立血清蛋白质双向电泳图谱,重症肌无力组血清双向电泳图谱可见678个蛋白点,而正常对照组可见702个蛋白点.选取9个具有明显差异的蛋白点进行质谱鉴定,共鉴定出5种蛋白质.结论:正常组和模型组大鼠间存在一定的差异表达蛋白,该类蛋白为一些与机体免疫应答、信息调控相关的蛋白质.
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建立人肾小管上皮细胞蛋白质组双向电泳的分离体系
背景:双向电泳分离技术是蛋白质组学研究的核心技术之一,但蛋白质样品的分离效果受各种实验条件的影响较大.因此,针对不同来源的蛋白样品进行实验条件的优化可获得具有较高分辨率的双向电泳图谱.目的:拟建立优化的人肾小管上皮细胞株蛋白质组双向电泳分离体系.方法:常规培养人肾小管上皮细胞株HK-2细胞并裂解提取全蛋白,按标准条件对蛋白质进行双向电泳分离,并对各个关键因素进行优化.等电聚焦采用缓慢升压模式,电泳参数根据Bio-Rad公司的预设方案进行调整.改良硝酸银法进行蛋白质斑点染色.采集电泳图谱并分析双向电泳图谱中蛋白斑点的数量、图像分辨率及背景条纹的变化.结果与结论:通过对实验条件的筛选和优化,成功建立了具有较高的分辨率和重复性的人肾小管上皮细胞蛋白质组双向电泳分离体系.其中,优化后的裂解液配方成分为1%TBP,4%CHAPS,0.2%Bio-Lyte,40mmol/L Tris,8mol/L尿素,2 mol/L硫脲:采用pH 4～7的IPG胶条;上样方式选择被动的水化上样.等电聚焦过程中使用预设的缓慢升压模式,充分聚焦后选用合适的电压模式进行SDS-PAGE电泳,然后采用改良硝酸银法进行染色,终获得了满意的蛋白质组双向电泳图谱.
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鹿茸再生及其蛋白质组学研究进展
背景:鹿茸是目前已知的惟一可以周期性再生的哺乳动物器官.这是一种来源于角柄骨膜并基于干细胞的再生过程.鹿茸又以角柄骨膜致敏区的干细胞作为再生基础,鹿茸及角柄骨膜中的蛋白质组,对于揭开鹿茸所具有的独特生物学活性以及再生机制具有重要的意义.目的:综述鹿茸再生和目前鹿茸蛋白质组学研究的两种主要途径与研究现状等.方法:应用计算机在PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)与CNKI数据库(http://www.cnki.net/)中进行检索.在PubMed数据库中的检索词为“deer antler,antler regeneration,antlerproteome”;在CNKI数据库中的检索词为“鹿茸再生,鹿茸蛋白质组”.将涉及到鹿茸再生组织学与形态学,鹿茸干细胞以及鹿茸蛋白质组学研究相关的文章找出来,内容无关与重复的文章排除掉,后纳入43条文献进行综述.结果与结论:在PubMed与CNKI数据库中通过初检与筛选共找到了43篇文献.鹿茸是能够周期性再生的,并且通过组织学等相关实验表明这种再生是来源于角柄骨膜干细胞的,而角柄骨膜分为致敏区与休眠区,两者是通过与皮肤接触的紧密程度来划分的.正是致敏区骨膜与其所覆盖皮肤的相互作用才终促使角柄骨膜干细胞发育成完整的鹿茸组织.同时,鹿茸及角柄骨膜中的蛋白质组在这些过程中起着重要作用.通过还原蛋白质谱的完整情况并进一步通过基因工程等后续手段来研究未知蛋白的功能对于了解鹿茸具有的独特生物学活性与再生作用奠定重要基础,同时对于相关蛋白质在哺乳动物器官再生中所具有的调节作用提供参考.
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突触蛋白质组学分析中双向电泳技术的优化
背景:双向电泳是突触蛋白质组学分析中流行通用的蛋白质分离方法之一.但文献中突触蛋白双向电泳对线性固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)胶条和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroph-oresis,SDS-PAGE)浓度的选择很多,尚未见统一标准.目的:对突触蛋白双向电泳的IPG胶条和SDS-PAGE凝胶浓度进行优化,以获得高质量的突触蛋白双向电泳图谱.方法:以大鼠海马突触蛋白为试材,比较pH 5.0-8.0与pH 3.0-10.0线性IPG胶条,线性与非线性pH 3.0-10.0IPG胶条,以及单一浓度10％与12％ SDS-PAGE对双向电泳的影响.此外,还使用计算机检索了1989至2013年中国知网及PubMed数据库中关于突触蛋白双向电泳的文献,对文献中选择的IPG胶条、SDS-PAGE凝胶浓度进行了统计和评价,并总结了突触蛋白在不同pH值IPG胶条和不同浓度SDS-PAGE凝胶的双向电泳图谱上的分布特征.结果与结论:结果表明,使用pH 3.0-10.0的非线性胶条及单一浓度10％ SDS-PAGE凝胶进行突触蛋白双向电泳较为适宜,电泳图谱质量好,实验操作便利;同时还推荐合并使用pH 4.0-7.0和pH 6.0-11.0的IPG胶条,以及线性梯度浓度9％-16％ SDS-PAGE凝胶,也适用于突触蛋白双向电泳分析.
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正常和退变腰椎间盘蛋白质的双向电泳和质谱鉴定
背景:近年来对于退变腰椎间盘组织蛋白质成分改变的研究取得了很大进展,但是对于正常和退变腰椎间盘整体蛋白质成分改变的分离和差异鉴定却鲜见报道.目的:建立正常和退变腰椎问盘蛋白质的双向电泳图谱,鉴定差异表达蛋白,探讨腰椎间盘退变的生物学机制.设计、时间及地点:对比观察,于2007-06/2008-12在南方医科大学病理生理实验室完成.材料:由自愿者提供的正常和退变腰椎间盘组织各6例,年龄21～45岁,其中男9例,女3例;取材范围L3-L5.方法:氯化铯梯度离心去除正常和退变腰椎间盘组织蛋白多糖,通过崮相pH梯度(IPG)等电聚焦和梯度聚丙烯酰胺双向电泳分离蛋白质,分析电泳图像,使用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪对差异蛋白质点进行分析鉴定.主要观察指标:正常腰椎间盘及退变腰椎间盘组织IPG等电聚焦双向凝胶电泳结果.结果:双向电泳显示正常和退变腰椎间盘蛋白质图谱差异显著,从中选取16个差异明显的位点进行质谱仪分析,确定了6种具有显著性意义的差异蛋白质.结论:双向电泳可有效地分离正常和退变腰椎问盘组织蛋白质,通过质谱仪鉴定可以确定其之间差异蛋白质的性质.
关键词： 腰椎间盘 退变 蛋白质组 双向电泳 基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪 -
腰椎间盘突出症推拿治疗前后血清蛋白质组学分析
背景：了解蛋白质在细胞和机体的作用方式和作用机制，以及腰椎间盘突出症相关蛋白质的研究，有助于进一步明确腰椎间盘突出症的演变过程和机制。
目的：采用双向电泳-串联飞行质谱技术分析腰椎间盘突出症患者的血清蛋白质组变化，筛选可用于腰椎间盘突出症诊治的生物标志物。
方法：采用前后自身对照法选取25例患者治疗前后血清分别混合而成。血清样本除去高丰度蛋白后进行双向凝胶电泳(2-DE)，比较前后2组血清蛋白质谱图，寻找差异蛋白点。用基质辅助激光解吸串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)技术，结合生物学软件和数据库检索对差异蛋白点进行鉴定。
结果与结论：初步筛选出6个差异蛋白点，经质谱鉴定得到3种蛋白质，酸性糖蛋白与腰椎间盘突出症免疫调节及化学性神经根炎症的发生发展和靶向(病变)部位相关。在腰椎间盘突出症治疗后酸性糖蛋白蛋白表达量减少(P<0.05)。结果说明，基于凝胶电泳的蛋白质组学分析可发现与腰椎间盘突出症相关的血清生物标志物酸性糖蛋白。 -
神经科疾病的蛋白质组学研究进展
蛋白质组(Proteome)的概念,由澳大利亚的M.R.Wilkins和K.L.Wiliams于1994年,在第1届国际双向电泳会议上首次提出.被定义为1个基因组、1个细胞或组织或1种生物体所表达的全部蛋白质.神经蛋白质组学是具潜力的研究热点.
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重度子痫前期胎盘组织中差异表达蛋白研究
目的 寻求与重度子痫前期发生相关的蛋白,为重度子痫前期发病机制研究奠定基础.方法 选择2008年1～3月在天津医科大学总医院产科住院分娩的重度子痫前期患者及正常妊娠妇女各8例,采集正常孕妇和重度子痫前期患者的胎盘组织,提取总蛋白后进行双向电泳技术进行分离.蛋白质凝胶图像经PDQuest软件分析后,获得差异蛋白质点.对差异蛋白质点进行时间飞行质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定.结果 与正常妊娠相比,重度子痫前期患者胎盘组织丰度差异表达相差2倍以上,并经Student's t-test检验差异有统计学意义的蛋白质点有14个(P<0.05),其中9个点在重度子痫前期组表达上调,另5个点表达下调.这些蛋白广泛参与细胞信号转导、细胞凋亡、应激反应、细胞结构、能量代谢等生理过程.结论 重度子痫前期的发生中,胎盘组织可能存在独特的蛋白表达模式.
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异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞蛋白双向电泳图谱的差异分析
目的 利用蛋白质组学方法,识别异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞(SM细胞)后差异表达的蛋白质,为进一步深入探讨异烟肼抑制分枝杆菌生长的作用机制及寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础.方法 观察不同浓度的异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌生长曲线,确定药物处理SM细胞的佳时间和浓度,并提取在佳处理时间和浓度条件下的SM细胞总蛋白,采用载体两性电解质pH梯度双向凝胶电泳技术分离异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞的总蛋白质,用PDuest7.3.1图像分析软件比较分析,以识别差异表达的蛋白质.结果 在空白对照组检出159个蛋白斑点,在异烟肼处理组检出221个蛋白斑点,在相对分子质量30 000～90 000和pH值4.5～6.0范围内,异烟肼处理组蛋白斑点数均多于空白对照组.结论 异烟肼处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞的蛋白质组具有差异,提示异烟肼处理后促进了某些特定基因的表达.
关键词： 异烟肼 耻垢分枝杆菌mc2155 双向电泳 蛋白质组比较 -
微波辐射后晶状体上皮细胞与未辐射晶状体上皮细胞蛋白质组双向电泳图谱比较
[目的]比较正常晶状体上皮细胞与微波辐射后晶状体上皮细胞蛋白质组双向电泳图谱差异,从蛋白质组水平初步探索微波辐射对人眼晶状体的损伤.[方法]体外培养人晶状体上皮细胞株,随机分为实验组和对照组,实验组用SAR值为4.0 W/kg的1800 MHz制式微波辐照2 h,对照组同一辐射箱培养但不辐射.辐照后立即提取总蛋白质,固相pH梯度(IPG)等电聚焦双向凝胶电泳进行蛋白质分离,银染显色的凝胶通过GS-800扫描仪获取图像,使用PDQuest专业图像分析软件分析电泳图像.[结果]正常晶状体上皮细胞与微波辐射后晶状体上皮细胞分别检出897个和981个蛋白质斑点.对2张电泳图进行匹配后,发现有4个蛋白质点在辐射后细胞蛋白质组图谱中上调表达,3个蛋白质点下调表达.[结论]初步建立了人晶状体上皮细胞比较蛋白质组学的实验方法;差异蛋白质的发现为深入理解辐射性白内障发病机制提供了有益的线索.
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乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞蛋白双向电泳图谱的差异分析
[目的]利用蛋白质组学方法,识别乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞后差异表达的蛋白质,为进一步探讨乙胺丁醇抑制分枝杆菌生长的作用机制及寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础.[方法]采用载体两性电解质pH梯度双向凝胶电泳技术分离乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞的总蛋白质,用PDQuest 7.3.1图像分析软件比较分析,以识别差异表达的蛋白质.[结果]空白对照组有268个斑点,Ethambutol(EMB)处理组有蛋白斑点195个,在相对分子质量和pI值分布的任一区域,EMB处理组蛋白斑点数均少于空白对照组,其中在EMB处理组中特异表达的蛋白质斑点有23个.[结论]乙胺丁醇处理前后耻垢分枝杆菌mc2155细胞的蛋白质组具有差异,这种蛋白质组的差异分析有助于进一步研究乙胺丁醇抑制分枝杆菌生长的作用机制并为寻找新的抗结核药物作用靶标奠定基础.
关键词： 乙胺丁醇 耻垢分枝杆菌mc2155 双向电泳 蛋白质组比较 -
肝素治疗烧伤的蛋白质组学研究
[目的] 利用蛋白质组学的方法,寻找肝素处理烧伤后差异表达的蛋白质,进一步探索肝素治疗烫伤过程的相关蛋白质,以期阐明肝素治疗烫伤的机制.[方法] 制作小鼠Ⅱ度烫伤模型,使用肝素外敷治疗,并在第3天从肝素组(烫伤后用肝素治疗)、烫伤组(烫伤后自然愈合)和对照组(未进行烫伤处理)中各取5只小鼠处死,提取烫伤及其周围皮肤组织的蛋白质,采用双向凝胶电泳(2-DE)技术分离各组的蛋白质,用考马斯亮蓝方法染色.通过凝胶成像系统获得双向电泳凝胶图谱后,用PD Quest图像分析软件比较分析,从而确定差异表达的蛋白质.选取差异明显的蛋白质点,经胰蛋白酶水解后,通过基质辅助激光解吸附飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)对其进行肽质谱分析并与数据库比对,鉴定待测蛋白质.[结果] 烫伤组共检测出75个蛋白质点,肝素组共检测出95个蛋白质点,其中肝素处理后上调2倍以上的蛋白质点有10个,下调2倍以上的点有4个.质谱分析初步鉴定表达差异大的蛋白质点为载脂蛋白A-I前体.[结论] 烫伤创面经肝素处理后表现出不同的蛋白质表达谱.
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“太溪”穴与肾脏组织双向电泳图谱比较研究
目的:利用双向电泳技术,观察足少阴肾经原穴“太溪”穴与肾脏组织蛋白质差异性.方法:健康8周龄雄性Wistar大鼠18只,随机分为太溪组、非经非穴组和肾脏组,每组6只.各组大鼠麻醉后,冰生理盐水心脏灌流,取出肾脏皮质、“太溪”穴部位及非经非穴部位1.5mm×1mm×0.5mm结缔组织进行蛋白双向电泳实验,根据重复性原则每组样本平行做三块双向凝胶电泳,对比各组双向电泳图谱的变化.结果:通过对“太溪”穴组织与非经非穴组织结缔组织蛋白比较,发现存在8个完全蛋白差异点；通过对“太溪”穴组织与肾脏皮质蛋白胶图的比较,共发现13对相关蛋白;通过对非经非穴处组织与肾脏皮质之间比较,发现10对相关蛋白.结论:非经非穴与“太溪”穴部位组织的蛋白组成有所不同；非经非穴与肾脏之间也有相关蛋白质,但较“太溪”穴与肾脏的相关蛋白点要少.
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针刺“太溪”穴对肾脏组织双向电泳图谱影响的实验研究
目的:利用双向电泳技术,观察针刺足少阴肾经原穴“太溪”穴前后肾脏组织双向电泳图谱的变化.方法:健康8周龄雄性Wistar大鼠18只,随机分为空白组、非经非穴组和针刺组,每组6只.非经非穴组每日针刺非穴点,针刺组每日电针双侧“太溪”穴,空白组大鼠在相同时间只予固定,不予针刺.1周后取出各组大鼠肾脏组织,提取肾脏组织总蛋白,进行双向电泳,比较分析各组肾脏组织双向电泳图谱的变化.结果:空白组和非经非穴组肾脏蛋白质未发现差异蛋白点；针刺组较空白组肾脏蛋白质显示9个3倍以上上调差异蛋白点,未发现下调蛋白质.结论:初步建立了大鼠肾脏组织蛋白质双向电泳的技术方法；针刺组大鼠蛋白质与空白组、非经非穴组存在明显差异,差异点的发现为下一步进行质谱分析奠定了基础.
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肺癌与良性胸腔积液蛋白质双向电泳图谱差异分析
目的:建立肺癌与肺良性胸腔积液的双向电泳图谱,分析二者表达蛋白质的差异及特点.方法:利用固相pH梯度双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离肺癌和肺良性胸腔积液中的总蛋白质.凝胶经银染色后用PDQUEST 6.2.1电泳分析软件对胸水中的蛋白质谱进行分析,识别差异表达的蛋白质.结果:肺癌与肺良性胸腔积液的蛋白质组分布的基本框架很相似,并可发现二者之间有差异蛋白点;两种胸腔积液电泳图谱平均蛋白质点数分别为326±16和343±12,平均匹配点数为286+14和298+21,匹配率87.7%,86.9%.差异蛋白点82个,其中37个在肺癌胸腔积液中高表达,24个在肺癌胸腔积液中低表达.有17个点仅在良性胸腔积液表达,4个点仅在肺癌胸腔积液表达.结论:用双向电泳法得到了分辨率较高且重复率较好的肺癌与肺良性胸腔积液蛋白质组图谱,二者存在一些表达差异蛋白质.
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利用小鼠感染模型筛选与鉴定幽门螺杆菌外膜蛋白抗原
目的:利用小鼠感染模型筛选与鉴定幽门螺杆菌SS1株的外膜蛋白抗原.方法:提取SS1株的外膜蛋白进行双向电泳,用幽门螺杆菌感染的小鼠血清作免疫印迹实验,将阳性反应蛋白点进行质谱鉴定分析,将肽质量指纹谱数据输入互联网上的蛋白质数据库进行检索.结果:获得32种抗原相关蛋白.通过与已有报道的幽门螺杆菌感染人抗原比较分析,发现大部分典型的保护性抗原在本实验中都可以检测到.结论:幽门螺杆菌感染的小鼠模型适用于人用保护性幽门螺杆菌抗原的筛选;而且此研究中得到的相关抗原蛋白对于寻找与鉴定幽门螺杆菌未知保护性抗原也有参考价值.
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衰老对外周血淋巴细胞蛋白质组影响的研究
目的:应用双向电泳和质谱技术,对不同年龄组外周血淋巴细胞蛋白质组进行分析,研究免疫衰老的本质,了解衰老在免疫细胞中的发生机制.方法:4组同一家族男性(祖父,父亲,儿子)血样,离心获得外周血淋巴细胞,提取细胞内全部蛋白质.用三种荧光染料标记后进行双向电泳,经不同激光扫描获得蛋白质图谱.经分析后得到差异蛋白质,挖取差异蛋白点经酶解后进行质谱测定及分析.结果:与青年组相比,老年组热休克蛋白70、波动蛋白、细丝蛋白、肌动蛋白、微管蛋白、肌球蛋白、α-烯醇化酶、Rho-二磷酸鸟苷分离抑制因子以及干扰素调节因子4表达均明显降低.而中年组未见明显差异.结论:衰老时淋巴细胞自我保护功能和抗氧化功能衰退,免疫细胞的结构发生退行性改变,糖酵解功能降低促使免疫细胞运动能力减弱,导致吞噬功能减弱,同时老年人淋巴细胞的凋亡加速,衰老个体在缺少IRF-4时,抗原提呈细胞的发育分化受到影响,机体的整体免疫能力受到影响,终导致综合免疫衰老效应.
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活血化瘀中药对内毒素诱导THP-1细胞增殖及蛋白质组的影响
目的:通过内毒素诱导的炎症细胞模型,筛选抗炎活血化瘀中药单体,并探讨蛋白质表达谱.方法:用LPS诱导THP-1细胞株增殖和产生TNF-α,作为内毒素诱导的炎症细胞模型.以此筛选活血化瘀中药单体抗炎成分,用双向电泳技术,分析差异蛋白点.结果:通过筛选活血化瘀中药单体发现丹参酮ⅡA对内毒素诱导的炎症细胞模型有明显抑制作用,双向电泳图象分析筛选出差异性明显的蛋白质点26个.模型组有16个蛋白点增高,丹参酮ⅡA组能下调13个蛋白点(占50%),有3个蛋白点进一步上调(占11.5%);在模型组下调表达的10个蛋白点(占38.5%),丹参酮ⅡA组均有不同程度上调趋势.结论:内毒素感染的细胞模型适合实验室小剂量中药单体的筛选,丹参酮ⅡA的抗炎作用与这些差异表达蛋白质有关,能够改善一些蛋白质的表达.
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原肌球蛋白3在大肠癌中的表达和意义
结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是我国肿瘤发病率上升快的肿瘤之一。全球每年结直肠癌新发病病例数可达94万，近50万人因结直肠癌死亡。结直肠癌患者无淋巴结转移的，术后五年生存率可达90％［1］，而发生淋巴结转移的，术后五年生存率仅为65％［2，3］。蛋白质组学技术在对实体肿瘤的分子标志物检测中显示出了特有的高灵敏度、特异度［4］。本研究以结肠腺癌组织、癌旁组织为研究对象，进行双向电泳和质谱分析，筛选结肠腺癌相关特异蛋白。
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比较蛋白质组学在肿瘤生物标记物研究中的应用策略
肿瘤是由多重因素引起的复杂疾病，受多种基因的调控。基因的表达方式错综复杂，从 mRNA 表达水平并不能准确预测蛋白质的表达水平，蛋白质的动态修饰和加工并非必须受基因序列的调控。而且蛋白质是细胞功能的真正执行者，可以动态反映生物系统，肿瘤细胞的形成必然涉及蛋白质组的变化。因此，利用蛋白质组学技术研究具有临床应用价值的肿瘤生物标记物具有重要的意义。其核心研究思路是通过分析肿瘤细胞／组织等样品中的蛋白质组，寻找肿瘤患者与正常人的蛋白质组的异同。所采取的技术方法-基于双向电泳-质谱（MS）分析的技术-具有精确、灵敏、重复性好等优点，现在已广泛应用于肿瘤生物标记物的研究。本文主要对近年来基于双向电泳-质谱的蛋白质组学分析方法在研究蛋白类肿瘤生物标记物方面进行综述。
