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乙型肝炎病毒复制对肝癌细胞Arid2基因表达的影响
目的:初步研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染及其复制对肝癌细胞中抑癌基因Arid2 (AT-rich interactivedomain 2)表达的影响.方法:采用携带HBV基因组1.1倍体的复制型重组腺病毒Ad-HBV l.1感染Huh7细胞,或者四环素诱导的HBV复制细胞模型HepAD38细胞,观察HBV瞬时或稳定复制细胞模型中Arid2的表达变化;进一步采用HBV各元件乙型肝炎病毒S蛋白(hepatitis B virus S protein,HBs)、乙型肝炎病毒DNA聚合酶(HBV-pol)、乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis Bvirus core protein,HBc)、乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)的过表达质粒转染Huh7细胞,明确病毒自身编码蛋白对Arid2表达的调控作用.在上述细胞模型中,运用Southern-blot、ELISA、real-time PCR的方法验证HBV的感染与复制情况,通过RT-PCR、Western blot检测肝癌细胞抑癌基因Arid2表达水平的变化.结果:HBV瞬时转染或稳定复制细胞模型中,Ad-HBV1.1感染的Huh7细胞mRNA和蛋白表达水平明显降低,Western blot结果显示Arid2蛋白表达水平降低了46.10％(P＜0.05);在HBV稳定复制的HepAD38细胞中,Arid2蛋白表达水平降低了37.63％(P＜0.05).转染HBV 4种病毒编码蛋白过表达质粒的Huh7细胞中,过表达HBs、HBx组较其他实验组Arid2表达水平明显降低,Western blot结果显示Arid2蛋白表达水平在HBs组降低了54.55％(P＜0.05),在HBx组降低了46.38％(P＜0.05).结论:HBV的感染和复制导致肝癌细胞中Arid2的表达水平下调,Arid2基因的表达与HBV复制水平呈负相关,其中HBs、HBx对Arid2的下调作用较明显.
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HBx-shRNA重组腺病毒的构建及功能鉴定
目的:构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标签的乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X pro-tein,HBx)特异性shRNA重组腺病毒,并对其干扰效果进行鉴定.方法:将前期构建的真核表达载体pGenesil-1-HBx-shRNA和pGenesil-1-Scramble sequence的表达启动子U6连同shRNA亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建pAdTrack-CMV-U6-HBx-shRNA和对照pAdTrack-CMV-U6-Scramble sequence穿梭质粒;酶切及DNA测序鉴定后,经PmeⅠ线性化后转化入感受态AdEasier细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence,PacⅠ酶切后转染AD293细胞获得重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA和Ad-U6-Scramble sequence;扩增病毒,测定滴度;以RT-PCR和real-time PCR鉴定重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA对HBx的干扰效果.结果:酶切鉴定得到阳性pAd-U6-HBx-shRNA和pAd-U6-Scramble sequence重组质粒;转染到AD293细胞并包装成功;RT-PCR以及real-time PCR表明,重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA携带的干扰片段能够明显干扰HBx表达(P=-0.01).结论:成功构建了HBx特异性shRNA重组腺病毒Ad-U6-HBx-shRNA,它能抑制HepG2.2.t5细胞中的HBx的表达,为研究HBx作为肝癌基因治疗作用的一个靶点以及机制奠定基础.
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HBX在肝癌细胞中通过下调miR-199a增强AKT的表达
目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBX)调节miR-199a的表达在HBV相关性肝癌发生中的分子机制.方法 重组HBX腺病毒(Ad-HBX)感染人肝癌HepG2细胞,HBX的siRNA转染稳定表达HBV基因的人肝癌HepG2.2.15细胞,荧光定量PCR方法检测HBV相关性肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、miR-199a、AKT的mRNA表达水平及运用Western blot检测肝癌组织标本和肝癌细胞中HBX、AKT的蛋白表达水平;分别用miR-199a mimics和miR-199a inhibitor的转染肝癌细胞后,荧光定量PCR方法检测肝癌细胞中AKT的mRNA表达水平及运用Westem blot检测肝癌细胞中AKT的蛋白表达水平.结果 miR-199a在HepG2.2.15细胞中表达水平显著低于HepG2细胞,并且证实其表达下调受到了HBX的调控(P＜0.05),HepG2.2.15细胞中AKT表达水平显著高于HepG2细胞(P＜0.05),在HepG2.2.15细胞中过表达miR-199a能明显下调AKT表达水平以及在HepG2细胞中抑制miR-199a能明显上调的AKT表达水平(P＜0.05),此外,miR-199a的表达量在HBV相关性肝癌组织比相应的癌旁组织表达降低.结论 HBX可以通过miR-199a调节AKT导致HBV相关性肝癌发生.
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表达HBx的肝前体细胞的小鼠肝内移植模型的构建
目的 构建表达乙肝病毒X基因(HBx)的肝前体细胞,并经小鼠门静脉注射建立肝内移植模型,为进一步研究HBx对肝前体细胞的作用和影响及其在原发性肝癌发病机制中的作用奠定了基础.方法 分别将表达HBx基因的重组腺病毒Ad-HBx-GFP和空载体Ad-GFP转染小鼠肝前体细胞,再经小鼠门静脉注射后3、7、14 d取血清和肝组织,检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)变化情况,观察绿色荧光蛋白表达情况,免疫组织化学法观察HBx阳性染色,并取表达高峰在第7天的肝组织,进行Western blot法和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法分别检测HBx的蛋白及mRNA表达.结果 成功构建了表达HBx并靶向针对肝前体细胞的小鼠模型,绿色荧光蛋白表达量、免疫组化阳性细胞数量及血清ALT均在注射后第7天达到高峰,RT-PCR及Western blot均检测到第7天14-19/Ad-HBx-GFP组小鼠肝组织目的基因及蛋白的特异性表达,与14-19/Ad-GFP组及生理盐水注射组相比结果具有统计学差异.结论 成功构建了表达HBx并靶向针对肝前体细胞的小鼠模型,操作可靠,重复性好,效果稳定,不仅对探讨原发性肝癌的发生机制奠定了基础,也为肿瘤动物模型的构建提供了新的思路.
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HBx及其突变体X17-3对Hippo信号途径表达的影响
目的 初步探寻HBx及其不同突变体表达与Hippo信号途径的关系,以及对细胞凋亡的影响.方法 HBx及其突变体载体转染人正常肝细胞系L02,转染48h后,提取总蛋白,Western blot检测细胞中Hippo信号途径MST1、YAP(yes-associated protein)的表达,磷酸化和去磷酸化的情况.采用Annexin V/PI标记流式细胞术检测细胞凋亡.结果 HPx及其突变体载体转染L02细胞48 h后,Western blot结果显示细胞MST1表达下调,p-MST1/2表达上升(P＜0.05)；YAP表达上升,p-YAP表达下调(P＜0.05).Annexin V/PI标记法流式细胞术结果显示HBx及其突变体能促进L02细胞发生凋亡(P＜0.05),其介导的细胞早期凋亡尤为明显.结论 HBx通过Hippo信号通路途径调控下游致癌基因YAP的表达.结合HBx介导的L02细胞凋亡这一结果说明HBx可能通过多种途径调节细胞周期.
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乙肝病毒X蛋白对油酸钠诱导HepG2细胞脂质沉积的影响
目的 探讨乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virusX protein,HBx)是否增加油酸钠诱导HepG2细胞的脂质沉积.方法 将质粒pIRES2-eGFP-HBx瞬时转染入HepG2细胞中,建立表达HBx的细胞模型(HepG2-HBx)；以转染空载体pIRES2-eGFP( HepG2-pIRES2)和HepG2细胞(HepG2)作对照.观察转染后绿色荧光蛋白(GFP)的表达；转染后16 h开始用油酸钠处理各组细胞24、48 h(分别命名为HBx/OA组、空/OA组、G2/OA组),细胞内甘油三酯(TG)含量测定及油红O染色了解细胞内脂质沉积情况；在油酸钠处理细胞24h,RT-PCR法检测SREBP-1和LXRα的mRNA表达水平,Westernblot检测HBx、LXRα及FAS蛋白表达水平.结果 转染后16 h HepG2-HBx细胞和HepG2- pIRES2细胞中开始有GFP的表达,提示转染成功；仅在HepG2-HBx细胞内有HBx表达,表明HepG2-HBx细胞模型构建成功.在相同油酸钠处理的条件下,HBx/OA组细胞内脂质含量和TG含量与对照组相比均明显增加(P＜0.01).在油酸钠处理细胞24h,HBx/OA组细胞内LXRα、SREBP-1的mRNA表达量和LXRα、FAS蛋白表达量较对照组均明显增加(P ＜0.01/0.05).结论 HBx通过上调HBx-LXRα-SREBP1/FAS通路脂质合成相关基因表达,可能增加HepG2-HBx细胞对外界脂代谢紊乱因素的易感性,从而增加油酸钠诱导HepG2细胞脂质沉积.
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HBx抑制RXRα表达对肝细胞癌DNMT3a表达的影响及初步机制研究
目的 探讨维甲酸X受体α(retinoid X receptor α,RXRα)在乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)上调肝细胞癌DNA甲基转移酶3a(DNA methyltransferases 3a,DNMT3a)表达中的作用及机制.方法 采用RT-PCR和Western blot检测12例正常肝组织、56例HBV阳性的肝细胞癌和癌旁组织中DNMT3a、RXRα的基因和蛋白表达变化;在培养的SMMC-7721细胞中,转染HBx基因和RXRα基因,观察对其DNMT3a表达的影响;在转染HBx基因的SMMC-7721细胞中,分别加入信号通路阻断剂,观察何种信号通路在HBx调节RXRα的表达中发挥作用.结果 与正常肝组织相比,肝癌组织与癌旁组织中DNMT3a的基因和蛋白表达量显著升高(P＜0.01),肝癌组织与癌旁组织中RXRα的基因和蛋白表达量显著降低(P＜0.01);在SMMC-7721细胞中,HBx的过表达使RXRα的蛋白表达量显著降低(P＜0.01),DNMT3a的蛋白表达量显著升高(P＜0.01),而RXRα与HBx共转染,则可降低HBx升高的DNMT3a蛋白表达量(P＜0.01);MKK/MEK抑制剂PD98059和p38 MAPK抑制剂SB203580可显著升高HBx下调的RXRα基因和蛋白表达(P＜0.01).结论 HBV产生的HBx蛋白可能通过MAPK信号通路,降低RXRα表达,引起促癌基因DNMT3a蛋白含量增加.
关键词： 肝细胞癌 乙型肝炎病毒X蛋白 维甲酸X受体α DNA甲基转移酶3a -
HBx下调miR-16家族表达促进肝癌细胞恶性转化
目的 乙型肝炎病毒X (hepatitisB virusX protein,HBx)蛋白通过调控蛋白编码基因表达而广泛参与人原发性肝细胞癌(简称肝癌)的发生和进展.本研究将HBx的调控功能拓展到非编码RNA领域,探讨HBx能否调控宿主肝癌细胞内microRNA (miRNA)的表达,进而参与肝癌细胞生长及恶性转化.方法 利用高通量芯片分析及实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)鉴定HBx在肝癌细胞内诱发的miRNA表达变化.通过系列蛋白和mRNA表达分析,细胞周期及凋亡实验以及萤光素酶报告实验来检测miR-16家族表达抑制后HepG2肝癌细胞的生物学变化.结果 芯片分析结果显示,HBx在HepG2细胞内诱发了大量的miRNAs表达变化,其中miR-16家族的低表达能在HepG2、SK-HEP-1及Huh7肝癌细胞中得到重复.同时,HBx显著上调miR-16家族的靶基因CCND1的表达.c-myc介导了HBx相关miR-16家族沉默,外源表达的miR-16/15a能通过阻滞细胞周期进展和诱导凋亡而抑制HepG2-hbx(稳定表达HBx)细胞的增殖、克隆形成及非贴壁生长能力.反之,沉默miR-16表达能促进HepG2细胞的周期进展和生长.结论 HBx能在体外改变肝癌细胞的miRNA表达谱,尤其是沉默miR-16家族表达.c-myc高表达介导了HBx下调miR-15a/16的过程且是HBx促进HepG2细胞恶性转化所必须的.因此,miR-16家族可能成为HBV相关肝细胞癌的治疗靶点.
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乙肝病毒X蛋白增强小鼠体内HBV的转录及复制
目的 观察小鼠体内乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBx)对HBV基因转录和复制水平的影响.方法 应用高压射体内转染法将野生型HBV重组质粒、HBx表达缺失的HBV重组质粒及HBx表达质粒DNA通过尾静脉快速注射入小鼠体内,应用Southern和Northem印迹分别检测小鼠肝组织中HBV DNA复制中间体及HBV mRNA水平.结果 野生型HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组小鼠肝组织中均检测到HBV的复制与转录;HBx表达缺失的HBV重组质粒注射组HBV基因转录和复制水平较野生型HBV重组质粒注射组、HBx表达缺失HBV重组质粒与HBx表达质粒共注注射组弱,生理盐水注射组未检测到HBV的转录与复制.结论 HBx的表达缺失可导致体内HBV基因转录和复制水平的下降,而外源HBx的表达可逆转这种因HBx表达缺失引起的HBV复制及转录的减弱,提示HBx增强小鼠体内HBV基因转录和复制.
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EpCAM和CD13在不同肝癌细胞系中的表达和乙型肝炎病毒X蛋白对其表达的影响
目的:探讨肝癌干细胞标记物EpCAM和CD13在不同肝癌细胞系中的表达及乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对EpCAM和CD13表达的影响.方法:Western blot检测正常肝细胞系(LO2细胞)和肝癌细胞系(Huh7,Bel-7404,Hep3B,QSG-7701细胞)中肝癌干细胞标记物EpCAM和CD13的表达情况,同时建立稳定转染HBx基因的Bel-7404 (Bel-7404/HBx)细胞系,用Real-time PCR和Western blot检测转染后EpCAM和CD13表达情况.结果:EpCAM和CD13在不同的肝癌细胞系中表达水平完全不同;转染HBx基因后EpCAM的mRNA和蛋白表达水平明显上调,分别为对照组的(2.04±0.16)和(2.03±0.25)倍;而CD13的mRNA和蛋白表达水平明显下调,分别为对照组的(69±8)％和(55±7)％.结论:肝癌干细胞可能存在多个干细胞亚群,在不同的肝癌细胞中干细胞标记物的表达水平不同,而HBX对不同亚群的影响也不同.
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稳定表达HBx的肝前体细胞株的构建及其对增殖的影响
目的 构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝前体细胞株,检测对肝前体细胞增殖,细胞周期及Wnt/β-catemn信号通路的影响.方法 重组质粒pSEB-Flag-HBx与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组逆转录病毒,并感染小鼠肝前体细胞HP14.5,稻瘟菌素(blasticidin)筛选出稳定表达HBx基因的细胞克隆并扩大培养(HP14.5/HBx组),设HP14.5/Rv(空质粒pSEEB-Flag感染组)及空细胞组HP14.5组为对照组.MTS比色法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测细胞周期中各时相所占的比例,荧光定量PCR检测cyclin D1和c-myc mRNA的表达量,Western blot法检测HBx、GSK3β、p-GSK3β(ser-9)、β-catenin、cyclin D1以及c-myc等蛋白的表达.结果 RT-PCR和Western blot法检测到HBx基因和蛋白阳性表达,与对照组相比,HP14.5/HBx细胞增殖活力显著增加(P＜0.05)；G1细胞比例明显减少(P＜0.05),S期和G2细胞比例显著升高(P＜0.05)；cyclin D1和c-myc mRNA的表达量显著升高(P ＜0.05); GSK3β蛋白水平表达无明显变化(P＞0.05),p-GSK3β、β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平显著升高(P＜0.05).结论 成功筛选出稳定表达HBx的肝前体细胞株,HBx通过活化Wnt/β-catenin信号途径促进肝前体细胞的增殖.
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HBx诱导小鼠肝前体细胞上皮-间质转化
目的 探讨乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)能否诱导肝前体细胞(HPCs)发生上皮-间质转化(EMT).方法 将重组质粒pSEB-Flag-HBX与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组逆转录病毒,并感染小鼠肝前体细胞HP14.5,经稻瘟菌素(blasticidin)筛选,获得稳定表达HBx的HP14.5细胞.观察其形态变化,通过实时定量PCR(real time-PCR)及Western blot法检测其间质细胞标志物和上皮标志物在mRNA和蛋白水平的表达量,并采用划痕实验检测其细胞迁移能力的变化.结果 HP14.5细胞稳定表达HBx蛋白后细胞由多角形变为长梭形；与对照组相比,神经钙黏素(N-cadherin)、Snail、vimentin的mRNA和蛋白水平表达均升高,具有统计学差异(P＜0.05)而上皮性钙黏素(E-cadherin)、细胞角蛋白18(CK18)的mRNA和蛋白表达量显著降低(P＜0.05；同时其迁移能力显著升高(P＜0.05).结论 HBx能诱导肝前体细胞发生EMT,并增强其迁移能力.
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乙型肝炎病毒X蛋白对患者发展为肝癌的影响
乙型肝炎病毒感染对患者发展为肝硬化和肝细胞癌起重要作用.乙型肝炎病毒导致肝癌的发病机理尚未完全阐明.有些证据表明乙型肝炎病毒X蛋白在肝癌发病机制中起关键作用.该文综述了乙型肝炎病毒X蛋白导致肝细胞癌变的各种机理.
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在肝癌细胞中HBx对缺氧诱导因子-1α表达的影响
目的揭示在常氧和缺氧状态下,缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在HepG2中的表达及HBx对HIF-1α表达的调节.方法对肝癌细胞HepG2及HBx转染的HepG2分别进行常氧和缺氧培养,其中缺氧状态用1%O2、5%CO2和94%N2模拟,缺氧时间分别为1 h,2 h,4 h,8 h,16 h,32 h.采用免疫印迹检测HIF-1α表达.结果在常氧状态下,HepG2细胞中HIF-α几乎无表达而HBx转染的HepG2明显表达.二者在缺氧1 h开始均表达,8 h达到高峰,16 h后逐渐下降,测量二者缺氧8 h时的表达,发现HBx转染的HepG2细胞中HIF-α的表达增高.结论在常氧状态下,HBx可诱导HIF-1α在HepG2细胞中表达.在缺氧状态下,HIF-α在HepG2细胞中表达与缺氧的时间相关且HBx可增强缺氧状态下HIF-1α在HepG2细胞中表达.提示HBx可能通过HIF-1α通路在肝癌的形成过程中发挥重要的作用.
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乙型肝炎病毒X蛋白对肝癌细胞侵袭与迁移能力的作用及机制
目的 探讨乙型肝炎病毒X(HBx)蛋白对肝癌细胞侵袭与迁移能力的作用及机制.方法 采用回顾性队列研究方法.收集2014年7月至2015年7月徐州医科大学附属医院收治的30例肝肿瘤患者[20例肝细胞癌(简称肝癌)、10例肝脏良性肿瘤)]的临床病理资料.收集20例肝癌患者(均有HBV感染史)行手术切除的肝癌组织及10例肝脏良性肿瘤患者(均无HBV感染史)的瘤旁组织(瘤体包膜外组织).采用免疫组织化学染色检测肝癌组织与瘤旁组织中人类表皮生长因子受体3(ErbB3)蛋白表达.采用Western blot检测肝癌组织与瘤旁组织中ErbB3蛋白和HBx蛋白相对表达量,以及转染绿色荧光蛋白(GFP)质粒的肝癌细胞株HepG2和转染GFP-HBx质粒的HepG2中ErbB3蛋白相对表达量.采用RT-PCR检测转染GFP质粒的HepG2和转染GFP-HBx质粒的HepG2中ErbB3 mRNA相对表达量.采用铺基质胶Transwell法检测HepG2侵袭能力,不铺基质胶Transwell法检测HepG2迁移能力.正态分布的计量资料采用x±s表示,组间比较采用独立样本t检验.采用Pearson检验进行相关性分析.结果 (1)免疫组织化学染色检测ErbB3蛋白表达情况:20例原发性肝癌患者的肝癌组织及10例肝脏良性肿瘤患者的瘤旁组织中ErbB3蛋白平均光密度(MOD)相对值分别为2.54± 1.33和0.99±0.29,两者比较,差异有统计学意义(t=6.542,P＜O.05).(2) Western blot检测ErbB3蛋白和HBx蛋白表达情况:10例原发性肝癌患者的肝癌组织及10例肝脏良性肿瘤患者的瘤旁组织中ErbB3蛋白相对表达量分别为0.79±0.13和1.10±0.28,HBx蛋白相对表达量分别为1.07±0.17和0,两者上述指标比较,差异均有统计学意义(t=3.229,19.486,P＜0.05).Pearson检验结果显示:肝癌组织中ErbB3蛋白与HBx蛋白表达成正相关(r=0.637,P＜O.05).(3) Western blot和RT-PCR检测HepG2中ErbB3蛋白表达及转录水平情况:转染GFP质粒的HepG2和转染GFP-HBx质粒的HepG2中ErbB3蛋白相对表达量分别为0.75±0.11和1.10±0.10,两者比较,差异有统计学意义(t=4.291,P＜O.05).转染GFP质粒的HepG2和转染GFP-HBx质粒的HepG2中ErbB3 mRNA相对表达量分别为0.38±0.03和0.94±0.07,两者比较,差异有统计学意义(t=11.703,P＜O.05).(4)ErbB3蛋白对HepG2侵袭、迁移能力的影响:铺基质胶Transwell法检测转染His质粒的HepG2和转染His-ErbB3质粒的HepG2穿膜细胞数分别为(271±18)个和(463±31)个,两者比较,差异有统计学意义(t=8.202,P＜0.05).不铺基质胶Transwell法检测转染His质粒的HepG2和转染His-ErbB3质粒的HepG2穿膜细胞数分别为(315±38)个和(549±34)个,两者比较,差异有统计学意义(t=8.310,P＜0.05).结论 HBx蛋白可通过上调ErbB3蛋白表达,促进肝癌细胞侵袭与迁移.
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乙型肝炎病毒X蛋白对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性小体的激活及机制研究
目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx蛋白)对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体活性的影响及其促进HBV相关性肝细胞肝癌(HCC)的作用机制.方法 采用实验研究方法.将HepG2细胞株分为5组:空白对照组(未转染质粒),空载质粒组[转染pE绿色荧光蛋白(GFP)-N1空载质粒],全长HBx蛋白组(转染pEGFP-N1-X质粒),HBx1-127组(转染pEGFP-N1-X1-127质粒),HBx1-101组(转染pEGFP-N1-X1-101质粒).(1)采用Western blot检测HBx蛋白和NLRP3炎性小体蛋白[采用脂多糖+ ATP干预空白对照组HepG2细胞]的表达.(2)分别采用格列本脲、吡咯烷二硫代甲酸铵盐(APDC)干预全长HBx蛋白HepG2细胞,采用ELISA检测IL-1β和IL-18的表达.(3)采用流式细胞仪检测活性氧的表达.正态分布的计量资料以(x)±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验.结果 (1) Western blot检测结果显示:①空白对照组、空载质粒组、全长HBx蛋白组、HBx1-127组、HBx1-101组HepG2细胞中HBx重组质粒融合蛋白的相对表达量分别为0.07±0.03、0.92 ±0.13、0.84±0.11、0.30±0.06、0.29±0.05,其中HBx1-127组和HBx1-101组HepG2细胞中分别为HBx1-127蛋白和HB1-x101蛋白的表达.5组比较,差异有统计学意义(F =61.790,P＜0.05).其中全长HBx蛋白组分别与空白对照组、HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t=12.070,7.465,7.801,P＜0.05);全长HBx蛋白组与空载质粒组比较,差异无统计学意义(t=0.867,P ＞0.05);HBx1-127组和HBx1-101组比较,差异无统计学意义(t=0.146,P＞0.05).②空白对照组、全长HBx蛋白组、HBx1-127组、HBx1-101组、脂多糖±ATP组HepG2细胞中NLRP3炎性小体蛋白的相对表达量分别为0.29±0.06、0.83±0.14、0.27±0.06、0.27±0.05、0.90±0.16,5组比较,差异有统计学意义(F=29.550,P＜0.05).其中脂多糖+ATP组分别与空白对照组、HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(=6.310,6.565,6.741,P＜0.05);全长HBx蛋白组分别与HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t =6.381,6.584,P＜0.05);脂多糖+ATP组与全长HBx蛋白组比较,差异无统计学意义(=0.580,P ＞0.05).(2)ELISA检测结果显示:①空白对照组、全长HBx蛋白组、HBx1-127组、HBx1-101组、脂多糖+ATP组HepG2细胞中IL-1β的表达量分别为(87±9)pg/mL、(587±56) pg/mL、(125±12) pg/mL、(113±13) pg/mL、(677 ±74) pg/mL,IL-18的表达量分另别为(43±8)pg/mL、(252±38) pg/mL、(70±13) pg/mL、(63±10) pg/mL、(263±48) pg/mL.HepG2细胞中IL-1β的表达量5组比较,差异有统计学意义(F=139.010,P＜0.05);其中脂多糖+ATP组分别与空白对照组、HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t=13.691,12.752,13.001,P＜0.05);全长HBx蛋白组分别与HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t=14.051,14.283,P＜0.05);脂多糖+ATP组与全长HBx蛋白组比较,差异无统计学意义(t=1.691,P＞0.05).HepG2细胞中IL-18的表达量5组比较,差异有统计学意义(F=44.010,P＜0.05);其中脂多糖+ATP组分别与空白对照组、HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t =7.848,6.722,7.065,P＜0.05);全长HBx蛋白组分别与HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t=7.882,8.331,P＜0.05);脂多糖+ATP组与全长HBx蛋白组比较,差异无统计学意义(t =0.326,P＞0.05).②加格列本脲前、后全长HBx蛋白HepG2细胞中IL-1β的表达量分别为(587 ±91) pg/mL、(115±17) pg/mL,两者比较,差异有统计学意义(t=8.800,P＜0.05).加格列本脲前、后全长HBx蛋白HepG2细胞中IL-18的表达量分别为(243±22) pg/mL、(90±12) pg/mL,两者比较,差异有统计学意义(t=10.566,P＜0.05).加APDC前、后全长HBx蛋白HepG2细胞中IL-1β的表达量分别为(573±89) pg/mL、(124 ±21) pg/mL,两者比较,差异有统计学意义(t=8.516,P ＜0.05).加APDC前、后全长HBx蛋白HepG2细胞中IL-18的表达量分别为(252±24) pg/mL、(116±15) pg/mL,两者比较,差异有统计学意义(t=8.269,P＜0.05).(3)流式细胞仪检测结果显示:空白对照组、全长HBx蛋白组、脂多糖+ATP组HepG2细胞中活性氧的相对表达量分别为66±14、275±54、388±88,3组比较,差异有统计学意义(F=22.130,P＜0.05);其中全长HBx蛋白组和脂多糖+ATP组分别与空白对照组比较,差异均有统计学意义(t=6.489,6.256,P＜0.05);全长HBx蛋白组和脂多糖+ATP组比较,差异无统计学意义(t=1.887,P＞0.05).结论 HBx蛋白通过诱导HepG2细胞内活性氧的产生,进而激活NLRP3炎性小体,可能在HBV相关性HCC的发生发展过程中发挥重要作用.
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靶向定位的乙型肝炎病毒X蛋白真核表达载体构建及表达
目的 构建带有核定位信号(NLS)和线粒体定位信号(MLS)的乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)真核表达载体,并检测其在人胚肾293FT细胞中的表达和亚细胞定位情况.方法 采用PCR技术分别扩增出增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和HBx序列,人工合成编码NLS和MLS的核酸序列,依次将其克隆至pcDNA4.0载体中.将重组质粒转染293FT细胞,Western blot检测融合蛋白的表达情况,荧光显微镜观察带有定位标签的HBx在细胞中的定位.结果 测序鉴定结果表明带有NLS、MLS和EGFP标签的HBx真核表达载体构建成功,转染293FT细胞能够正常表达融合蛋白,在荧光显微镜下,NLS和MLS能够将EGFP-HBx融合蛋白分别定位于细胞核和线粒体.结论 本研究构建的能够特异性靶向HBx蛋白至细胞核和线粒体的真核表达载体,能够在哺乳动物细胞293FT细胞中表达,为进一步深入研究不同定位HBx的生物学功能奠定了基础.
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HBX蛋白对正常肝细胞增殖及端粒酶活性的影响
目的:观察乙型肝炎病毒X (hepatitis B virus X,HBX)蛋白对L02肝细胞的转化作用及其对端粒酶活性的影响.方法:构建PEGFP-N1-HBX质粒,脂质体介导转染L02细胞,倒置荧光显微镜观察EGFP的表达.稳定转染后Western blotting检测L02细胞中HBX蛋白的表达,电子显微镜观察L02细胞的形态,MTT法检测细胞的增殖,RT-PCR检测L02细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的表达,TRAP-PCR银染法检测L02细胞端粒酶活性的变化.结果:成功构建了PEGFP-N1-HBX质粒,稳定转染后L02细胞中有HBX蛋白的表达,且细胞形态明显幼稚化,有恶性变趋势,细胞增殖能力明显增加(P＜0.05),细胞hTERT mRNA表达明显增加,端粒酶被激活.结论:HBX蛋白可诱导正常肝细胞的恶性转化,上调hTERT mRNA的表达并能激活端粒酶.
