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核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性小体在癫痫大鼠模型中的表达及褪黑素对其的影响
目的 观察核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)炎性小体在癫痫大鼠模型中的表达水平,并探讨褪黑素的脑保护作用.方法 选择144只日龄21～30 d的SD大鼠,应用氯化锂-匹罗卡品建立癫痫持续状态动物模型,按随机数字表法分为对照组、癫痫组、褪黑素组,每组各48只.每组按24 h、48 h、72 h、7 d时间点再分为4个亚组,每亚组12只,观察大鼠的行为学变化,用荧光定量PCR和免疫组织化学法检测大鼠海马组织中 NLRP3、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、白细胞介素-1β(IL-1β)的表达水平.结果 造模成功后癫痫组NLRP3阳性细胞数增多,在72 h达高峰;在24 h、48 h、72 h、7 d时间点,NLRP3阳性细胞数在癫痫组(14. 20 ± 1. 64、23. 60 ± 1. 14、31. 20 ± 1. 30、25. 40 ± 2. 07)较褪黑素组(10. 60 ± 0. 89、17. 80 ± 1. 48、24. 00 ± 0. 71、20. 20 ± 1. 92 )及对照组(2. 60 ± 0. 89、2. 40 ± 1. 14、2. 40 ± 1. 14、2. 40 ± 0. 55)均增高,差异均有统计学意义(F＝122. 977、375. 125、962. 743、262. 916,均P＜0. 05);NLRP3 mRNA相对表达量在癫痫组(2. 57 ± 0. 12、3. 34 ± 0. 10、4. 84 ± 0. 19、3. 55 ± 0. 13 )较褪黑素组(2. 03 ± 0. 08、2. 71 ± 0. 08、4. 03 ± 0. 14、2. 48 ± 0. 18)及对照组(1. 07 ± 0. 13、1. 08 ± 0. 15、1. 08 ± 0. 23、1. 07 ± 0. 18)均增高,差异均有统计学意义(F＝422. 386、1 154. 957、1 132. 112、512. 149,均 P＜0. 05);Caspase-1 mRNA相对表达量在癫痫组(2. 47 ± 0. 07、3. 05 ± 0. 15、4. 39 ± 0. 18、3. 14 ± 0. 11)较褪黑素组(1. 85 ± 0. 07、2. 49 ± 0. 08、3. 60 ± 0. 12、2. 15 ± 0. 12)及对照组(0. 98 ± 0. 25、0. 99 ± 0. 15、0. 98 ± 0. 23、0. 99 ± 0. 18)均增高,差异均有统计学意义(F＝620. 099、580. 796、1 125. 225、645. 082,均P＜0. 05);IL-1β mRNA相对表达量在癫痫组(2. 32 ± 0. 15、2. 90 ± 0. 18、4. 18 ± 0. 16、2. 74 ± 0. 07)较褪黑素组(1. 78 ± 0. 09、2. 35 ± 0. 11、3. 24 ± 0. 13、1. 78 ± 0. 16)及对照组(0. 97 ± 0. 13、0. 99 ± 0. 15、0. 97 ± 0. 23、0. 97 ± 0. 18)均增高,差异均有统计学意义(F＝267. 952、398. 767、1 140. 384、438. 962,均P＜0. 05).结论 NLRP3炎性小体在癫痫发作后被激活,在癫痫脑损伤中发挥一定作用;褪黑素可能通过抗炎作用抑制NLRP3炎性小体的表达,发挥脑保护作用.
关键词： 匹罗卡品 癫痫 核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性小体 褪黑素 -
乙型肝炎病毒X蛋白对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎性小体的激活及机制研究
目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx蛋白)对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体活性的影响及其促进HBV相关性肝细胞肝癌(HCC)的作用机制.方法 采用实验研究方法.将HepG2细胞株分为5组:空白对照组(未转染质粒),空载质粒组[转染pE绿色荧光蛋白(GFP)-N1空载质粒],全长HBx蛋白组(转染pEGFP-N1-X质粒),HBx1-127组(转染pEGFP-N1-X1-127质粒),HBx1-101组(转染pEGFP-N1-X1-101质粒).(1)采用Western blot检测HBx蛋白和NLRP3炎性小体蛋白[采用脂多糖+ ATP干预空白对照组HepG2细胞]的表达.(2)分别采用格列本脲、吡咯烷二硫代甲酸铵盐(APDC)干预全长HBx蛋白HepG2细胞,采用ELISA检测IL-1β和IL-18的表达.(3)采用流式细胞仪检测活性氧的表达.正态分布的计量资料以(x)±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验.结果 (1) Western blot检测结果显示:①空白对照组、空载质粒组、全长HBx蛋白组、HBx1-127组、HBx1-101组HepG2细胞中HBx重组质粒融合蛋白的相对表达量分别为0.07±0.03、0.92 ±0.13、0.84±0.11、0.30±0.06、0.29±0.05,其中HBx1-127组和HBx1-101组HepG2细胞中分别为HBx1-127蛋白和HB1-x101蛋白的表达.5组比较,差异有统计学意义(F =61.790,P＜0.05).其中全长HBx蛋白组分别与空白对照组、HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t=12.070,7.465,7.801,P＜0.05);全长HBx蛋白组与空载质粒组比较,差异无统计学意义(t=0.867,P ＞0.05);HBx1-127组和HBx1-101组比较,差异无统计学意义(t=0.146,P＞0.05).②空白对照组、全长HBx蛋白组、HBx1-127组、HBx1-101组、脂多糖±ATP组HepG2细胞中NLRP3炎性小体蛋白的相对表达量分别为0.29±0.06、0.83±0.14、0.27±0.06、0.27±0.05、0.90±0.16,5组比较,差异有统计学意义(F=29.550,P＜0.05).其中脂多糖+ATP组分别与空白对照组、HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(=6.310,6.565,6.741,P＜0.05);全长HBx蛋白组分别与HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t =6.381,6.584,P＜0.05);脂多糖+ATP组与全长HBx蛋白组比较,差异无统计学意义(=0.580,P ＞0.05).(2)ELISA检测结果显示:①空白对照组、全长HBx蛋白组、HBx1-127组、HBx1-101组、脂多糖+ATP组HepG2细胞中IL-1β的表达量分别为(87±9)pg/mL、(587±56) pg/mL、(125±12) pg/mL、(113±13) pg/mL、(677 ±74) pg/mL,IL-18的表达量分另别为(43±8)pg/mL、(252±38) pg/mL、(70±13) pg/mL、(63±10) pg/mL、(263±48) pg/mL.HepG2细胞中IL-1β的表达量5组比较,差异有统计学意义(F=139.010,P＜0.05);其中脂多糖+ATP组分别与空白对照组、HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t=13.691,12.752,13.001,P＜0.05);全长HBx蛋白组分别与HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t=14.051,14.283,P＜0.05);脂多糖+ATP组与全长HBx蛋白组比较,差异无统计学意义(t=1.691,P＞0.05).HepG2细胞中IL-18的表达量5组比较,差异有统计学意义(F=44.010,P＜0.05);其中脂多糖+ATP组分别与空白对照组、HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t =7.848,6.722,7.065,P＜0.05);全长HBx蛋白组分别与HBx1-127组、HBx1-101组比较,差异均有统计学意义(t=7.882,8.331,P＜0.05);脂多糖+ATP组与全长HBx蛋白组比较,差异无统计学意义(t =0.326,P＞0.05).②加格列本脲前、后全长HBx蛋白HepG2细胞中IL-1β的表达量分别为(587 ±91) pg/mL、(115±17) pg/mL,两者比较,差异有统计学意义(t=8.800,P＜0.05).加格列本脲前、后全长HBx蛋白HepG2细胞中IL-18的表达量分别为(243±22) pg/mL、(90±12) pg/mL,两者比较,差异有统计学意义(t=10.566,P＜0.05).加APDC前、后全长HBx蛋白HepG2细胞中IL-1β的表达量分别为(573±89) pg/mL、(124 ±21) pg/mL,两者比较,差异有统计学意义(t=8.516,P ＜0.05).加APDC前、后全长HBx蛋白HepG2细胞中IL-18的表达量分别为(252±24) pg/mL、(116±15) pg/mL,两者比较,差异有统计学意义(t=8.269,P＜0.05).(3)流式细胞仪检测结果显示:空白对照组、全长HBx蛋白组、脂多糖+ATP组HepG2细胞中活性氧的相对表达量分别为66±14、275±54、388±88,3组比较,差异有统计学意义(F=22.130,P＜0.05);其中全长HBx蛋白组和脂多糖+ATP组分别与空白对照组比较,差异均有统计学意义(t=6.489,6.256,P＜0.05);全长HBx蛋白组和脂多糖+ATP组比较,差异无统计学意义(t=1.887,P＞0.05).结论 HBx蛋白通过诱导HepG2细胞内活性氧的产生,进而激活NLRP3炎性小体,可能在HBV相关性HCC的发生发展过程中发挥重要作用.
