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联合位点突变的乙型肝炎病毒x蛋白可通过上调多重耐药基因-1表达促进肝癌细胞化疗抵抗
目的 观察联合位点突变的乙型肝炎病毒x蛋白对肝癌耐药性的影响,探讨乙型肝炎病毒在肝癌耐药机制中的作用.方法 通过基因合成A1762T/G1764A/T1753A/T1768A位点联合突变后的乙型肝炎病毒x蛋白(HBx),慢病毒感染肝癌细胞株Huh7并构建稳定表达HBx蛋白的肝癌细胞,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测转染后肝癌细胞对不同浓度化疗药物顺铂(15、30、60 mg/L)的耐药性,实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)及Western blot法分别检测转染后肝癌细胞多重耐药基因-1(MDR-1) mRNA及蛋白的表达.结果 经嘌呤毒素药物筛选后,可构建出稳定表达株,转染率达90％以上;在不同浓度顺铂(15、30、60 mg/L)作用下,转染后肝癌细胞存活率为84.6％、76.7％、98.6％,明显高于对照组(57.7％、72.8％、77.3％)和空载组(55.0％、70.6％、78.9％),差异有统计学意义(P＜0.05),而对照组细胞存活率与空载组比较,差异无统计学差异(P＞0.05).转染后细胞内MDR-1 mRNA表达明显高于对照组和空载组,差异有统计学意义(P＜0.05),MDR-1蛋白表达明显增高.结论 联合位点突变的乙型肝炎病毒x蛋白可通过上调肝癌细胞内MDR-1的表达提高其化疗抵抗性.
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HBx对凋亡通路的调控机制
原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,居中国癌症死亡的第三位[1].长期感染乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)的病人发生肝癌的风险明显高于未感染者,多项研究表明,HBV感染是形成HCC常见的病因[2].HBV是噬肝DNA病毒,含有4个开放读码框架(open reading frame,ORF),即S、C、P和X区,其中X基因是所有编码中小的ORF.乙型肝炎病毒X基因编码的X蛋白——乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis Bvirus X protein,HBx)是一种17kd的蛋白,具有多种生物活性,参与转录调节、细胞周期调控、DNA修复、信号转导、细胞凋亡(cell apoptosis)及细胞粘附等[3].
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乙肝病毒X蛋白通过激活NF-κB信号通路上调肺耐药相关蛋白的表达
目的 研究核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路是否是乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)上调多药耐药基因肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein,LRP)的途径之一.方法 建立稳定转染HBx基因的L02(L02/HBx)细胞系,用NF-κB信号通路阻断剂吡咯二硫代氨基甲酸酯(pyrollidine dithiocarbamate,PDTC)阻断NF-κB信号通路.采用荧光双标激光扫描共聚焦显微镜观察转染前后及PDTC加入前后NF-κB信号通路的激活失活情况,同时用Real-time PCR和Western blot检测转染前后及PDTC加入前后LRP的表达情况.结果 转染HBx基因后NF-κB信号通路被激活,LRP的mRNA和蛋白表达水平明显上调,分别为对照组的(2.32±0.31)倍和(4.62±0.72)倍(均P＜0.05);PDTC加入后NF-κB信号通路被阻断,LRP的mRNA和蛋白表达水平下调,分别为对照组的(1.75±0.19)倍和(2.39±0.54)倍(均P＜0.05).结论 NF-κB信号通路可能是HBx介导肝癌多药耐药,上调多药耐药基因LRP的途径之一.
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乙型肝炎病毒X蛋白在促进肝细胞衰老中的作用
目的 探讨乙型肝炎病毒通过乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对肝细胞衰老的影响.方法 对HepG2.2.15细胞、HBx沉默HepG2.2.15细胞(HepG2.2.15-HBx-si)及HBx过表达HepG2细胞(HepG2-HBx)进行β-半乳糖苷酶染色,采用Western Blot对肝细胞衰老相关蛋白进行检测;对比分析HBx对肝细胞衰老的影响.结果 β-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例:HepG2.2.15组为(0.480±0.096),HepG2组为(0.016±0.005),两组比较差异有统计学意义(P＜0.001);HepG2.2.15-HBx-si组为(0.278±0.065),对照组HepG2.2.15-HBx-nc组为(0.329±0.044),两组比较差异无统计学意义(P=0.092);HepG2-HBx组为(0.319±0.033),对照组HepG2-HBx-eon组为(0.064±0.012),两组比较差异有统计学意义(P＜0.001).Western Blot检测肝细胞衰老蛋白:HepG2.2.15组和HepG2-HBx组肝细胞衰老相关蛋白p53及p21表达量均高于其对照组,HepG2.2.15-HBx-si组肝细胞衰老相关蛋白p53及p21表达量低于HepG2.2.15-HBx-nc组.结论 乙型肝炎病毒可通过HBx促进肝细胞衰老.
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乙肝病毒X蛋白激活NF-κB信号通路对AFP表达的影响
目的 研究乙肝病毒X蛋白(HBx)通过核因子-κB (NF-κB)信号通路对甲胎蛋白(AFP)的调节作用.方法 建立稳定转染HBx基因的L02细胞系(L02-HBx),用特异性的NF-κB信号通路阻断剂PDTC阻断该信号通路,荧光双标激光扫描共聚焦显微镜观察转染前后及加入PDTC前后NF-κB信号通路的激活、失活情况,同时用实时定量 PCR和Western Blot技术检测转染前后及加入PDTC前后AFP在mRNA及蛋白水平上的表达变化.结果 以L02细胞为参照,转染HBx基因后的L02-HBx细胞NF-κB信号通路被激活,AFP mRNA和蛋白水平较转染前分别增加(2.78±0.43)倍和(4.72±0.53)倍,差异有统计学意义(P<0.05);PDTC作用24 h后L02/HBx细胞NF-κB信号通路阻断,AFP mRNA和蛋白表达分别为(1.40±0.16)倍和(3.12±0.44)倍,与未加入PDTC作用的L02-HBx细胞相比,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 NF-κB信号通路是HBx上调AFP表达的途径之一.
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乙型肝炎病毒X基因克隆及其表达
目的:构建乙型肝炎病毒X基因原核表达载体,并诱导其表达.方法:从乙肝病人血清中提取HBV DNA;以带有EcoRI和Hind Ⅲ酶切位点的引物,用PCR方法扩增X基因;而后定向克隆到原核表达载体pMAL-C2X上,经酶切鉴定和序列分析;以IPTG诱导X融合蛋白的表达.结果:PCR扩增显示有类似HBV X基因片断大小的条带;构建的原核表达重组体PMAL-C2X-HBV-X经酶切有相应大小的的基因插入片断,序列分析证实为正确的有完整读码框的X基因;这一重组体在IPTG诱导下有相应大小的X融合蛋白表达.结论:成功构建了HBV X基因原核表达重组体pMAL-C2X-HBV X;在IPTG的诱导下,该重组体在大肠杆菌中可表达X融合蛋白,为进一步纯化HBV X蛋白和研究其生物学作用奠定了基础.
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hDaxx与乙型肝炎病毒X蛋白的相互作用
目的 采用酵母双杂交法研究HBV X蛋白与hDaxx蛋白的相互作用,为探讨HBV X蛋白的致癌机制奠定实验基础.方法 构建pGBKT7～hDaxx和pGADT7-HBx重组质粒,分四组转化酵母AH109,A组为pGADT7和pGBKq7,B组为pGBKT7-hDaxx和pGADT7-HBx,C组为pGADT7-T和pGBKT7-Lam,D组为pGAD,17-T和pGBKT7-p53.将转化菌落接种于SD/-Trp-Leu(二缺)固体平板,长出克隆后再接种于SD/-Trp-Leu-His(三缺)和SD/-Trp-Leu-His-Ade(四缺)平板,30℃培养36～72 h.裂解酵母茵,提取蛋白,经SDS-PAGE、Eestem blot检测hDaxx和x蛋白在酵母中的表达.结果 仅有共转化pGBKT7-hDaxx和pGADT7-HBx的AH109可以在三缺及四缺平板上生长.Western blot检测到hDaxx和X蛋白均能在酵母中表达.结论 HBV X蛋白与hDaxx能在酵母细胞内发生相互作用.
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HBV X蛋白通过激活PI3K/Akt信号通路诱导大鼠肾系膜细胞增殖
目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBV X)通过激活PI3K/Akt信号通路诱导大鼠肾小球系膜细胞(GMC)增殖的作用机制.方法 通过PCR扩增HBVX基因,将目的基因HBVX与空载体PCI-neo连接,采用脂质体转染法转染大鼠GMC,LY294002阻断PI3K/Akt信号通路,MTT法测定各组细胞不同时间点的增殖情况,Western blotting检测转染后大鼠系膜细胞中HBV X、Akt、p-Akt和β-actin的表达情况.结果 PCI-neo-X质粒转染大鼠GMC后,于36 h和48 h时间点可稳定表达HBx,MTT法测得GMC+PCI-neo-X组细胞在36 h和48 h时间点明显增殖,与GMC+pCI-neo组比较,差异有统计学意义(P ＜0.05)；GMC+PCI-neo-X组中加入抑制剂LY294002后,与未加抑制剂组相比细胞增殖受到明显抑制,Western blotting测得其Akt磷酸化程度显著减弱(P＜0.05).结论 HBVX蛋白能诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖,PI3K/Akt信号通路是HBV X蛋白调节GMC增殖的重要信号通路之一.
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乙型肝炎病毒X蛋白诱导p16INK4A基因启动子甲基化及其机制研究
目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对p16INK4A基因启动子甲基化的影响及机制.方法 以HepG2细胞和稳定表达GFP/HBx融合蛋白的HepG2/GFP-HBx为实验细胞,HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx细胞接种于裸鼠皮下建立裸鼠肝癌皮下移植瘤;设计合成靶向HBV X的siRNA(X-siRNA)和对照siRNA,用X-siRNA、5-N-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)单独或联合处理细胞及裸鼠;甲基化PCR检测细胞及移植瘤组织p16INK4A基因甲基化;RT-PCR法测定DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的mRNA表达.结果 甲基化PCR检测显示HepG2/GFP-HBx组细胞及移植瘤组织均存在p16INK4a甲基化而HepG2/GFP组均未检出p16甲基化;X-siRNA、5-Aza-CdR处理的细胞及移植瘤组织中p16INK4A基因甲基化均减低;RT-PCR检测显示GFP-HBx/HepG2组DNMT1、DNMT3A较HepG2组显著升高,差异有统计学意义(P=0.000 2、P=0.000 5),较GFP/HepG2细胞组也显著升高,差异有统计学意义(P=0.001 1、P=0.0005),而DNMT3B在HepG2、GFP/HepG2、GFP-HBx/HepG2细胞组组间检测值差异无统计学意义(P＞0.05).结论 HBX蛋白可能通过上调DNMT1、DNMT3A mRNA的转录表达而诱导p16INK4A基因启动子的甲基化.
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乙型肝炎病毒X蛋白通过活化ERK1/2上调DNA甲基转移酶1表达
目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白对DNA甲基转移酶1表达的影响及调控机制.方法 以HepG2、HepG2/EGFP及HepG2/EGFP-HBx细胞作为实验细胞,采用Real-timePCR法及Western blot法检测细胞DNMT1的mRNA及蛋白表达水平.用不同剂量的MEK1/2特异性抑制剂U0126处理HepG2/EGFP-HBx细胞,采用Westernblot法检测总ERK1/2、磷酸化ERK1/2及DNMT1蛋白表达水平.结果 HepG2/EGFP-HBx细胞的DNMT1 mRNA相对表达量平均值为9.464±0.22,明显高于HepG2细胞(1.00±0.0)(t=60.64,P=0.0002)及HepG2/EGFP细胞(0.95±0.29),差异有统计学意义(t=32.78,P=0.0011).与HepG2、HepG2/EGFP细胞相比,HepG2/EGFP-HBx细胞磷酸化ERK1/2及DNMT1蛋白表达水平有明显升高;而MEK1/2特异性抑制剂U0126处理细胞后,磷酸化ERK1/2磷酸化水平及DNMT1蛋白表达水平明显降低.结论 HBx可通过活化ERK1/2信号通路上调DNMT1的表达,这可能是HBx调控细胞基因甲基化及参与HBV相关肝细胞癌发生的机制之一.
关键词： 乙型肝炎病毒X蛋白 DNA甲基转移酶1 ERK1/2信号通路 -
GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立
目的 构建绿色荧光蛋白(GFP)与人乙型肝炎病毒(HBV)X基因的重组表达载体,建立稳定表达HBV X蛋白(HBx)与GFP融合蛋白的HepG2细胞系,以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用.方法 应用PCR法从adr亚型HBV质粒Phbv DNA中扩增HBV X基因片段,PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体Pegfp-C1的相应酶切位点,转化宿主菌DH5α,采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒Pgfp-HBx;采用脂质体转染法将Pegfp-C1质粒、Pgfp-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,G418选择抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP表达,挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代.采用RT-PCR检测转染细胞HBV X基因的表达.结果 经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBV X重组表达载体Pgfp-HBx;将Pegfp-C1、Pgfp-HBx重组质粒转染HepG2,经G418筛选15d获得抗性细胞克隆.将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次,细胞仍表达强的荧光蛋白.RT-PCR检测表明转染Pgfp-HBx重组体的HepG2/GFP-HBx细胞有HBV X转录、表达.结论 成功构建了GFP-HBV X真核重组表达载体Pgfp-HBx;获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系.这为进一步研究HBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础.
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肝细胞癌中HBx的表达及其与患者预后的关系
目的 检测乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)在肝细胞癌中的表达及其与患者预后的关系,并探讨人血清HBx抗原的检测.方法 用免疫组化法检测35例肝癌患者肿瘤组织中HBx蛋白的表达,与临床资料进行相关分析；应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测77例人血清中HBx抗原的表达情况.结果 肝癌组织中HBx的总体阳性检出率为20/35 (57.14％),其中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性者HBx的阳性率为15/24(62.50％),而HBsAg阴性者HBx的阳性率为5/11 (45.45％)；HBx阳性与HBx阴性的肿瘤组织低分化比率分别为9/20 (45.00％)及2/15(13.33％),差异有统计学意义(P＜0.01)；HBx阳性肝癌患者的无病生存期(DFS)明显短于HBx阴性患者(Kaplan-Meier法及log-rank检验,P=0.03).ELISA检测人血清中HBx抗原的总阳性率为48/77 (62.34％).结论 肝癌肿瘤组织中HBx的表达与患者无病生存期呈负相关,ELISA法能有效检测人血清中HBx抗原的表达.
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乙型肝炎病毒X蛋白抑制足细胞增殖
目的 通过构建复制缺陷型腺病毒载体将乙型肝炎病毒(HBV)X基因(即HBx基因)导入足细胞株,探讨HBx蛋白对足细胞增殖的影响及其分子机制.方法 采用pAdxsi系统构建携带HBx基因的复制缺陷型腺病毒载体.以瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态.以MTT检测和羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)荧光染料示踪细胞增殖的方法,对细胞增殖进行定量评估.采用流式细胞仪检测细胞周期分布.采用cyclin/DNA双参数流式细胞术和Western印迹检测细胞周期调控蛋白的表达.结果 PCR和基因测序鉴定证实,Ad.HBx构建成功.Western印迹显示,足细胞感染Ad.HBx(感染复数MOI=100)后第3、5天均可表达相对分子质量为17 000的HBx蛋白,表明HBx可在足细胞株稳定表达.细胞形态学观察显示腺病毒感染后第5天Ad.HBx组细胞呈现明显的有丝分裂障碍特征,双核、多核和多形核细胞比例明显增加.MTT检测结果显示空白组和Ad组足细胞的生长曲线基本吻合,而Ad.HBx组细胞的生长曲线自第4天起较前两组偏低,至第5天时该差异具有统计学意义(P＜0.01);同时,CFDA-SE细胞增殖示踪实验也证实,于腺病毒感染后第3天Ad.HBx组细胞的增殖速度已明显低于空白组和Ad组(增殖指数11.2比15.4、13.3),且随时间推移进一步减慢(增殖指数32.5比61.6、54.0),表明HBx可显著抑制足细胞增殖.细胞周期分析和细胞周期凋控蛋白检测的结果显示,HBx可诱导足细胞周期G2/M阻滞,同时伴有cyclin B1、p21的表达上调及cyclin A的下调.结论 乙肝病毒基囚编码的HBx蛋白可使cyclin B1降解受阻,同时下调cyclin A和上调细胞周期负调蛋白p21的表达,导致细胞周期阻滞于G2/M期,从而抑制足细胞增殖.这可能是乙型肝炎病毒相关性肾炎患者肾小球足细胞缺失,肾脏病变慢性进展的重要机制之一.
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乙型肝炎病毒X蛋白和p14ARF依赖性、非依赖性途径对肝癌细胞生长的影响
目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)是否通过p14ARF途径影响肝癌细胞生长及其作用机制.方法 将HBx及p14ARF单转染及共转染含野生型p53但不表达p14ARF脚的肝癌细胞株HepG2.实验分为pcDNA3、pcDNA3HBx、pcDNA3p14ARF、pcDNA3HBx+pcDNA3p14ARF4组.通过流式细胞仪比较各转染组HepG2细胞凋亡、细胞周期的变化情况.用含p53结合位点p21WAF1胴启动子荧光素酶活性检测和Western blotting观察各转染组细胞p14ARF、MDM2、p53、p21WAF1蛋白表达水平的变化.结果 HBx及p14ARF脚单转染及共转染含野生型p53但无p14\ARF表达的HepG2细胞,单转染HBx及p14ARF组其细胞凋亡率(14.11%、13.72%)、G0/G1期阻滞细胞数(63.62%、61.75%)、p21WAF1启动子荧光素酶活性(1.25±0.05、1.09±o.06)及p53、p21 WAF1蛋白的表达较对照组(10.66%、57.42%、0.77±0.03)明显升高,而共转染组与单转染p14ARF组相比其p14ARF蛋白表达及上述各项指标(18.61%、66.74%、3.53±0.43)又进一步升高.结论 HBx通过依赖及非依赖p14ARF途径诱导p53表达从而导致激活p21WAF1,进而引起细胞周期G0/G1期的阻滞及细胞凋亡的增加.
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乙型肝炎病毒X蛋白对细胞因子信号转导抑制分子-1 CpG岛基因甲基化及其表达的影响
目的 观察HBV X蛋白(HBx)对人源性非肿瘤性肝细胞株QSG7701细胞中细胞因子信号转导抑制分子-1 (SOCS-1)表达的影响,并通过研究SOCS-1基因启动子区CpG岛甲基化的情况以探讨HBx影响SOCS-1表达的可能机制. 方法 本研究室前期构建好的重组表达质粒pcDNA-X及空载体pcDNA3.0分别转染QSG7701细胞,经含G418的选择性培养基筛选获得稳定转染HBV-X基因的细胞克隆(pcDNA-X/QSG7701)及稳定转染空载体pcDNA3.0的细胞克隆(pcDNA3.0/QSG7701).实时逆转录PCR、Western blot分别检测3种细胞SOCS-1 mRNA和蛋白的相对表达情况.甲基化特异性PCR检测三种细胞SOCS-1基因启动子甲基化状态. 结果 实时逆转录PCR结果显示pcDNA-X/QSG7701中SOCS-1 mRNA相对表达水平为0.3249±0.0536,明显低于pcDNA3.0/QSG7701的1.0543±0.1937和未转染的细胞QSG7701 mRNA相对表达水平(设为1.0),三组比较,F=19.6,P＜0.05,差异有统计学意义.Western blot检测结果显示pcDNA-X/QSG7701中SOCS-1蛋白相对表达水平为0.1496±0.0106,明显低于pcDNA3.0/QSG7701的0.1984±0.0438及未转染的细胞QSG7701的0.2152±0.0816,三组比较,F=19.4,P＜0.05,差异有统计学意义.甲基化特异性PCR结果显示仅在pcDNA-X/QSG7701细胞株存在SOCS-1启动子区域的甲基化. 结论 HBx可下调SOCS-1的表达,使SOCS-1基因启动子CpG岛发生甲基化,这可能是HBx蛋白致肝细胞癌变的机制之一.
关键词： 肝炎病毒 乙型 DNA甲基化 细胞因子信号转导抑制分子-1 乙型肝炎病毒X蛋白 -
乙型肝炎病毒X蛋白抑制p16蛋白表达及其促进HepG2肝癌细胞生长
目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对肝癌细胞生长的影响及其机制.方法 以HepG2细胞和稳定表达GFP/HBx融合蛋白的HepG2/GFP-HBx为实验细胞,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞吸光度值A490,分析细胞生长增殖；流式细胞术检测细胞周期；甲基化PCR检测细胞p16INK4A基因的甲基化；Western blot检测p16蛋白表达水平. 结果 72 h时HepG2/GFP-HBx细胞组的A490为3.225±0.038,分别与HepG2和HepG2-GFP细胞组的2.012±0.022、2.038±0.029比较,增殖能力明显增强,t值分别为46.86和42.51,P值均＜0.001,差异均有统计学意义.流式细胞术检测示HepG2/GFP-HBx细胞组的G0/G1期细胞占16.45％±0.45％,明显低于HepG2和HepG2/GFP细胞组的44.81％±1.36％、42.76％±1.58％,t值分别为-34.22和-28.88,P值均＜ 0.001,差异均有统计学意义.而5-氮-2 '-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理的HepG2/GFP-HBx细胞G0/G1期细胞比例为33.25％±0.79％,较未处理HepG2/GFP-HBx细胞组的16.45％±0.45％显著增加,两组比较,t=31.85,P＜0.001,差异有统计学意义.甲基化PCR检测显示HepG2/GFP-HBx细胞组发生了p16INK4A基因甲基化,而HepG2和HepG2-GFP细胞组及5-Aza-CdR处理的HepG2/GFP-HBx细胞组未检测到p16INK4A基因启动子甲基化.Western blot检测示HepG2/GFP-HBx细胞组p16蛋白水平低于HepG2和HepG2/GFP细胞组,而5-Aza-CdR处理HepG2/GFP-HBx细胞后,p16蛋白水平高于未处理的HepG2/GFP-HBx细胞. 结论 HBx蛋白可通过缩短HepG2细胞生长的G0/G1期而加快细胞周期进程,从而促进肝癌细胞生长增殖,其机制可能与HBx蛋白诱导p16INK4A基因启动子甲基化及抑制p16蛋白表达有关.
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Wnt诱导分泌型蛋白1:研究乙型肝炎诱发肝癌的新途径
目的 观察由乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)引起的HepG2细胞内Wnt诱导分泌型蛋白1 (WISP-1)的变化,探索HBV诱发肝癌的机制. 方法 收集肝癌、癌旁及正常肝组织标本,用免疫组织化学法检测标本中HBX和WISP-1的表达差异.设立2个实验组:稳定转染HBx基因的HepG2细胞(Gx)组和稳定转染空载体pc-DNA3.1(+)HepG2细胞(G0)组.同时用PCR和Western blot检测两组细胞中WISP-1的表达.计数资料样本率比较用x2检验；计量资料均数的比较用t检验和单因素方差分析；相关分析采用Spearman秩相关系数检验. 结果 肝癌组织中WISP-1的表达阳性率为76.6％,较癌旁组织的23.4％及正常肝组织的0明显增高,x2=35.967,P＜0.01,差异有统计学意义.Gx细胞中WISP-1 mRNA和蛋白的相对表达水平分别为1170.33±41.26、240.33±11.37,与G0细胞中WISP-1的mRNA和蛋白相对表达水平265.34±27.47,40.33±7.09比较；t=31.625,F=600.565,P值均＜0.01,差异均有统计学意义.结论 WISP-1基因在肝癌中呈高表达,HBV感染肝细胞后,其HBX可通过上调WISP-1的表达水平引起肝癌的发生.
关键词： 肝炎 乙型 肝肿瘤 乙型肝炎病毒X蛋白 Wnt诱导分泌型蛋白1 -
乙型肝炎病毒X蛋白对HepG2细胞羧末端结合蛋白反应蛋白表达的影响
目的 研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对博莱霉素诱导HepG2细胞DNA双链断裂(DSB)损伤修复关键因子羧末端结合蛋白反应蛋白(CtIp)的影响.方法 建立稳定表达HBx的HepG2肝癌细胞株(HepG2-HBx)及空质粒对照细胞株(HepG2-vec).用博莱霉素诱导细胞DSB损伤后,用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况,用实时定量PCR及Western blot检测CtIP的mRNA与蛋白表达水平,并用激光共聚焦显微镜观察CtIp蛋白在细胞内的定位情况.多组数据采用单因素方差分析和SNK-q检验;两组数据间比较用t检验.结果 经检测转染HBx基因的HepG2细胞(HepG2-HBx)能稳定表达HBx.博莱霉素处理后,HepG2-HBx细胞与HepG2-vec细胞的凋亡比例分别为16.90%±0.89%和15.30%±0.86%,差异无统计学意义(q=2.074,P＞0.05),但死亡细胞比例分别为8.71%±0.74%和4.90%±0.46%,差异有统计学意义(q=7.126,P＜0.01) ;同时两种细胞株都出现了细胞周期G2/M期阻滞,差异有统计学意义(F=11.401,P＜0.05).HBx使CtIP蛋白表达水平和mRNA表达水平均下调,HepG2-HBx细胞与HepG2-vec细胞CtIp蛋白的相对表达量分别为0.66±0.04、0.73±0.05,差异有统计学意义(t=2.314,P＜0.05); CtIP mRNA相对表达量分别为1.00±0.06、1.23±0.08,差异有统计学意义(t=2.732,P＜0.05).同时观察到CtIP蛋白主要在细胞胞核内表达.结论 HBx能干扰肿瘤抑制蛋白CtIp的表达,可能影响细胞DSB损伤的修复.
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乙型肝炎病毒X蛋白上调HepG2细胞中SMYD3的表达
目的 探讨HBV是否通过调控组蛋白甲基化酶SMYD3的表达参与肝癌细胞的恶性生物学行为.方法 通过向肝癌细胞HepG2转染HBx筛选出表达HBx蛋白的细胞株HepG2-HBx.用激光共聚焦定位细胞内HBx蛋白和SMYD3蛋白的表达;实时逆转录PCR、Western blot检测转染HBx前后HepG2细胞中SMYD3 mRNA和蛋白质的表达水平;流式细胞仪检测转染HBx前后HepG2细胞增殖、凋亡的变化情况.对数据进行单因素方差分析. 结果 HBx转染后HepG2细胞中SMYD3 mRNA和蛋白质表达水平明显上调(SMYD3 mRNA:0.18±0.05与0.98±0.15,F=37.240,P<0.05;SMYD3蛋白:0.28±0.03与0.58±0.06,F=21.042,P<0.05).转染HBx后HepG2细胞凋亡率下降(7.90%±0.42%与2.23%±0.14%,P<0.01),细胞增殖能力增强(28.46%±4.33%与36.46%±0.17%,P<0.01).结论 乙型肝炎病毒X蛋白能够上调HepG2细胞中SMYD3 mRNA和蛋白质表达水平;HBx可能通过SMYD3-组蛋白甲基化途径抑制HepG2细胞凋亡、促进细胞增殖.
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乙型肝炎病毒x蛋白与缺氧诱导因子-1α在肝癌中的表达及可能的调节机制
目的 检测乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)与缺氧诱导因子-1(HIF-1)α在肝癌中的表达,探讨正常氧和缺氧状态下,HBx对HIF-1α可能的调节机制.方法 采用免疫组织化学染色方法检测78份原发性HCC组织标本中HBx和HIF-1α的表达,用SPSS10.0进行相关性分析;免疫荧光和Western blot检测常氧和缺氧条件下,HepG2及稳定转染HBx基因的HepG2细胞(HepG2-X)中HIF-1α的表达;流式细胞术检测常氧和缺氧状态下HepG2及HepG2-X细胞活性氧(ROS)的含量.结果 78份肝癌组织标本中,HBx和HIF-1α免疫组织化学染色阳性率分别为74.36%(58/78)和69.23%(54/78),两者表达呈正相关(r=0.636,P＜0.05).免疫荧光检测表明:常氧状态下,HepG2细胞中HIF-1α的表达阴性而HepG2-X中表达阳性,主要位于细胞浆,部分位于细胞核,而缺氧状态下,HepG2和HepG2-X细胞的细胞质和细胞核均有表达.Western blot检测显示:常氧状态下,HepG2细胞中HIF-α几乎无表达,而HepG2-X明显表达.两者在缺氧1 h开始均表达,8 h达到高峰,16 h后逐渐下降,测量两者缺氧8 h时的表达,发现HepG2-X中HIF-α的表达增高.流式细胞术检测细胞ROS含量显示:在常氧状态下,HepG2-X细胞中ROS含量明显高于HepG2细胞.在缺氧状态下,二者ROS含量无显著差异,但均明显高于常氧状态下HepG2细胞的ROS含量.结论 HBx及HIF-1α在人肝细胞肝癌组织中广泛表达,并显著正相关;常氧或缺氧状态下,HBx均可上调HIF-1α在HepG2细胞中表达,并且HBx对HIF-1α的这种调节作用可能通过ROS通路实现.
