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甘露消毒丹及其拆方对感染肠道病毒71型细胞miR-146a和Toll样受体4 mRNA表达的影响
目的：探讨甘露消毒丹及其拆方对肠道病毒71型（EV71）感染后免疫及炎症反应的调节作用。方法运用细胞培养技术，设甘露消毒丹组（甘全方组）、清残方组、利残方组、病毒唑组、正常组、模型组，进行病毒毒力和药物细胞毒性测定后，以药物作用于EV71感染后的RD细胞，24 h后RT-PCR检测各组细胞miR-146a、Toll样受体4（TLR4）mRNA表达。结果与正常组比较，模型组miR-146a mRNA表达降低， TLR4 mRNA表达升高；与模型组比较，甘全方组、清残方组、利残方组miR-146a mRNA表达升高、TLR4 mRNA表达降低，病毒唑组与模型组比较差异不明显；与甘全方组比较，清残方组 miR-146a、TLR4 mRNA 表达降低，利残方组miR-146a mRNA表达升高、TLR4 mRNA表达降低；与清残方组比较，利残方组miR-146a mRNA表达升高，TLR4 mRNA表达无明显差异。结论甘露消毒丹可能通过调节miR-146a、TLR4 mRNA表达从而影响EV71感染所致免疫反应，其中清残方与利残方可能存在互相拮抗效应。
关键词： 甘露消毒丹 拆方 肠道病毒71型 miRNA-146a Toll样受体4 -
甘露消毒丹及其拆方体外抗肠道病毒71型作用
目的 观察甘露消毒丹及其拆方体外抗肠道病毒71型(EV71)的作用. 方法 运用细胞培养技术,病毒毒力测定采用Reed-Muench法计算半数组织培养感染量(TCID50),确定实验用为100 TCID50.将甘全方(甘露消毒丹全方)、清残方(甘露消毒丹方中清热解毒药物组成)、利残方(甘露消毒丹方中化浊利湿药物组成)、病毒唑药液用维持液1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶96、1∶128、1∶256稀释,采用MTT法测定各浓度药物吸光度OD值,根据各药不同浓度的OD值计算其细胞存活率,以药物浓度为横坐标(g/ml)、细胞存活率(％)为纵坐标绘出非线性回归曲线,选择各药的90％细胞存活率浓度为药效学实验浓度.分别将90％细胞存活率浓度的甘全方、清残方、利残方、病毒唑药液和100 TCID50病毒各50μl混合,加到单层人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD细胞)上,各设4复孔,每孔均设正常细胞对照、病毒对照,采用MTT法计算各药物对病毒生长的抑制率.结果 根据Reed-Muench法计算得出TCID50=10-2.89/ml,从回归曲线获得各药90％细胞存活率浓度分别为甘全方:10-2.43 =0.0037 g/ml;清残方:10-27=0.0020g/ml;利残方:10-2 09 =0.0081 g/ml;病毒唑:10-3.19=0.64 mg/ml.清残方EV71病毒抑制率为97.4％,甘全方为91.74％,利残方为75.64％,病毒唑为36.99％. 结论 甘露消毒丹全方及其拆方具有比病毒唑更强的抗EV71作用,清热解毒法在方中发挥了更强的抗EV71作用.
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2009年云南省2株肠道病毒71型分离株全基因组序列遗传特性分析
对2009年云南省肠道病毒71型分离株KMM09和KM186-09进行全基因组序列测序,并与我国及其它国家流行的EV71基因型进行比较和进化分析.KMM09和KM186-09基因组长为7409bp,编码2193个氨基酸,VP1系统进化分析显示2009年云南分离株属于C4基因型的C4a亚型.在结构区,与其它基因型相比较,C基因型之间的核苷酸和氨基酸的同源性高于其它基因型;而在非结构区,C4与B基因型和CA16原型株G10同源性高于其它C基因亚型.通过RDP3重组软件和blast比对分析,发现EV71C4基因型与B3基因型,与CA16原型株G10的基因组在非结构区存在重组.EV71全基因组序列的比较和分析,对了解引起我国手足口病暴发或流行C4基因亚型EV71毒株的遗传特性具有重要意义.
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人肠道病毒71型高致病性毒株及其体外适应株cDNA感染性克隆的构建
高致病性EV71毒株的感染易伴发神经系统症状,是导致手足口病死亡病例的主要原因,但目前临床上仍缺乏防治EV71感染的特效药物及安全有效的疫苗.为进一步明确EV71的致病机制,本项工作以高致病性的EV71-HP临床分离株及其经体外细胞培养适应的EV71-CCA毒株的基因组RNA为模板,应用反向遗传学方法构建了二者的感染性克隆.研究表明HP株在细胞中的增殖速度明显快于CCA株.两株基于感染性克隆的拯救病毒分别保持了与各自母本株基因组序列的一致性,同时也保留了母本株增殖表型的差异,包括病毒的增殖速度以及病毒的温度敏感性.本工作将促进对EV71的致病机制以及对EV71疫苗的研究.
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云南省2009～2010年肠道病毒71型的基因特征分析
为了解引起云南省2009～2010年手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)的肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的基因特征,对从病例中分离到的50株EV71,进行VP1编码区逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)扩增和核苷酸序列测定,构建遗传进化树进行基因型别分析.50株分离株VP1编码区全长均为891个核苷酸,编码297个氨基酸,序列比较证实为EV71.进化分析表明,云南省EV71分离株48株属于C4a亚型,2株属于A型.说明云南省2009～2010年流行的EV71和中国大陆其他地区2004年以来的EV71分离株同属C4a亚型,在不同地区、不同疾病状态下分离的EV71在VPI区全长基因序列上无明显差别,但2009年在云南省出现A基因型的传播.
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2007年内蒙古一起手足口病暴发的流行病学和病原学分析
2007年内蒙古自治区鄂尔多斯市准格尔旗暴发了一起手足口病疫情,患者大多出现发热症状,在手、足、口腔和臀部等一个或多个部位出现斑丘疹或疱疹.患者以5岁以下散居幼儿为主,暴发过程中有一个明显的发病高,峰.从28名住院儿童采集了23份粪便标本和6份咽拭子标本进行病毒分离,共分离到了15株肠道病毒,其中9株鉴定为人肠道病毒71型(HEV71,分离率为31.03%),1株鉴定为柯萨奇病毒A组16型(CVA16).结合分析这起暴发中患者的临床表现、流行病学调查结果以及实验室检测结果,表明HEV71可能是引起这起HFMD暴发的主要病原体.9株HEV71分离株在全长VP1区核苷酸水平和氨基酸水平上差异都较小,核苷酸和氨基酸同源性分别高于99.4%和99.0%,说明这起疫情是由同一个病毒传播链引起的.同源性进化分析结果表明,从这起疫情中分离到的HEV71属于C4基因亚型,而C4基因亚型自1998年首次在广东省深圳市报道以来,一直在我国持续流行,是中国大陆HEV71流行的优势基因亚型,提示C4基因亚型HEV71在中国大陆可能有较广泛的分布和传播.
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新乡地区2011年肠道病毒71型VP1基因特征分析及手足口病流行特点
为了解新乡地区2011年肠道病毒71型(EV71)VP1基因特征及手足口病流行特点,采用荧光RT-PCR对临床诊断的粪便标本进行总肠道病毒(EV)、柯萨奇病毒A16(CA16)和EV71检测;选取10例EV71阳性标本进行VPl序列扩增并测序,所得序列进行同源性分析和构建系统发生树;对2011年新乡市手足口病疫情监测数据进行分析.结果显示,重症标本的EV71阳性率(73％)显著高于CA16阳性率(19％)(P＜0.01);10株新乡EV71分离株的核苷酸及氨基酸差异分别为2.8％和0.9％,属于C4亚型的C4a簇;9株VP1区第170位氨基酸为A,1株为V;与近缘的C4a型代表株相比,新乡优势株的氨基酸变异一般发生在VP1第292位氨基酸(T→A);2011年新乡市共上报手足口临床诊断病例1118例,92％的发病年龄在3岁以下,发病高峰分别出现在4和12月份,提示一定要加强手足口病预防控制,寒冷天气尤其不能忽视.
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肠道病毒71型的热力和紫外灭活效果的研究
EV71感染引起的手足口病给婴幼儿身心健康带来巨大危害,科学有效的灭活EV71为预防和控制EV71引起的手足口病的传播流行提供保障.本文采取热力和紫外照射手段,探讨其对EV71灭活的有效性.实验结果表明50℃不能灭活EV71,60℃和70℃能够有效灭活EV71;30 cm紫外照射30 min和60 min后EV71因基因组RNA被破坏而失活;然而随着胎牛血清含量的增加,热力和紫外灭活EV71的效果减弱.本文研究结果显示热力和紫外照射均可有效灭活EV71,该结果为阻断EV71的传播提供指导.
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肠道病毒71型感染前后宿主细胞蛋白质组的二维液相色谱分离和比较
以肠道病毒71型及其宿主细胞为研究主体,建立了一种二维液相色谱分离和分析比较病毒感染前后细胞蛋白表达谱的方法.该方法以高效液相色谱(HPLC)为技术平台,对细胞裂解物先后进行一维色谱聚焦分离和二维反相色谱分离.利用ProteoVue软件将二维色谱数据转换成模拟胶图,再利用DeltaVue软件对感染前后的宿主蛋白表达谱进行比较和分析,找出差异蛋白.二维液相色谱分离法能够根据蛋白的等电点和疏水性建立精确的细胞蛋白表达图谱,每0.2个pH为一个收集区段,在pH8.5～3.9的范围内可见蛋白条带约1 200条.该方法良好的重现性、自动化以及结果分析的简易化,使之在细胞表达谱差异显示中的应用潜力巨大,并且为研究病毒与宿主相互作用提供了新的方法和思路.
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肠道病毒71型3C蛋白酶在大肠杆菌中的表达及活性研究
本研究利用大肠杆菌表达系统构建肠道病毒71型3C蛋白酶,并进行纯化,对其酶活性进行研究.首先,将3C蛋白酶基因克隆至pET28a载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,Ni-NTA柱亲和层析纯化获得3C蛋白酶,经肠激酶酶切去除N端His标签后获得无His标签的3C蛋白酶,再以荧光多肽为底物进行酶活性研究.经过双酶切鉴定和测序证实,重组表达质粒pET28a 3C构建正确,表达的重组3C蛋白酶相对分子质量约22kD；纯化后有无His标签的3C蛋白酶均能催化荧光底物3B-3C,并且两者的酶动力学数据无显著差异,含有His标签的3C蛋白酶Km、Vmax、Kcat分别为22μM、434nM.Min-1、0.0669 Min-1；其适反应pH为7.0,佳反应温度为30℃～37℃.本实验成功表达并纯化了重组3C蛋白酶,该酶具有良好的活力,为抗病毒抑制剂、结构蛋白组装、疫苗开发及3C蛋白酶检测方法的研发奠定了基础.
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2010年内蒙古自治区手足口病病原谱及人肠道病毒71型分子特征研究
研究2010年中国内蒙古自治区引起手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)的病原谱及人肠道病毒71型(Human enterovirus,HEV71)的分子特征.采集内蒙古自治区12个盟市门诊就诊的HFMD患者粪便和咽拭子标本共921份,进行病毒分离,然后利用三通道实时荧光定量PCR法[同时检测HEV71,柯萨奇病毒A16型(CVA16)和人肠道病毒(HEV)]对阳性分离物进行鉴定,对鉴定为其它HEV的阳性分离物进行VP4和VP1编码区扩增及核苷酸序列测定和分析.921份标本共分离出153株病毒,阳性率为16.61％,其中61株为HEV71,占39.87％,82株为CVA16,占53.59％,7株为其它HEV(分别为6株CVB4和1株Ⅱ型脊髓灰质炎疫苗病毒株),占6.53％,3株为腺病毒.重症病例中分离到9株病毒,其中6株为HEV71,3株为CVA16.选取从临床诊断分别为普通型病例、重型病例的HFMD患者临床标本中分离到的32株HEV71代表株进行VP1编码区基因扩增及核苷酸序列测定和分析,与HEV71其它各基因型和基因亚型的代表株构建亲缘性进化树.32株内蒙古HEV71代表株与1998年以来中国大陆HEV71分离株的VP1区核苷酸和氨基酸水平上的同源性都较高,尤其与2008年的北京代表株同源性高,与C4基因亚型代表株聚为一支,属于C4基因亚型C4a进化分支,但它们之间的核苷酸和氨基酸的同源性略有差异,分别为96.4％～100％和98.14％～100％,与2007年的内蒙古代表株存在一定的差异,核苷酸同源性为96.95％～97.87％.亲缘进化关系树显示,这些HEV71处于不同的簇中,属于多个病毒传播链.2010年内蒙古HFMD的病原谱以CVA16和HEV71为主,重症病例中以HEV71居多.内蒙古流行的HEV71属于C4基因亚型C4a进化分支,并且存在多个传播链,与2008年北京代表株亲缘关系比2007年内蒙古代表株亲缘关系近,说明内蒙古流行的HEV71不是独立进化的,而是与中国流行的HEV71在共同进化.
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人类肠道病毒71型亚单位疫苗壳聚糖佐剂作用的研究
为了解人类肠道病毒71型(EV71)重组保护性衣壳蛋白(rVP1)亚单位疫苗壳聚糖佐剂的作用,本研究利用rVP1蛋白与壳聚糖佐剂制备的疫苗口服免疫新西兰白兔,通过ELISA方法检测兔血清、粘膜洗液(小肠、鼻腔和肺)及粪便中特异性IgG、IgA抗体水平,中和试验检测血清中和抗体滴度,并通过抗原刺激体外培养的兔脾淋巴细胞分泌细胞因子(IFN-γ、IL-4)的水平评价rVP1口服免疫效果.结果显示,单纯口服rVP1蛋白仅可诱导产生较低水平的血清IgG和粘膜IgA抗体,而含佐剂疫苗组与单纯抗原免疫组差异显著,并可诱导产生中和抗体.细胞免疫检测结果显示rVP1含佐剂组兔脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4水平明显高于未加佐剂组.本研究为研制EV71VP1口服疫苗奠定了基础.
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EV71通过2A蛋白酶切割Nup62而抑制核转运
为了解EV71病毒对细胞核转运机制的影响,本研究构建了具有核定位信号的绿色荧光蛋白表达载体(pG-FP-NLS).将此表达载体转染细胞后,使用EV71病毒感染转染细胞,结果发现EV71病毒可以有效阻止绿色荧光蛋白的核转移.将EV71病毒的2A蛋白酶真核表达载体与pGFP-NLS共转染RD细胞,可以发现2A蛋白酶可阻止具有核定位信号的绿色荧光蛋白的核转移而使绿色荧光蛋白表达于细胞浆.为了进一步研究病毒阻止核转移的机制,病毒感染细胞或通过转染2A蛋白酶真核表达载体进行Nup62的Western blotting检测,结果显示病毒以及2A蛋白酶均可引起Nup62表达下降.证明EV71可通过2A蛋白酶切割Nup62从而抑制核转运.
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2005～2008年深圳地区肠道病毒71型基因特征研究
对2005～2008年深圳地区肠道病毒71型进行基因特征研究.用肠道病毒71型特异性引物进行RT-PCR,并扩增EV71的VP1基因,所得的核苷酸序列与肠道病毒71型A、B、C基因型代表株的核苷酸序列比较,并且用DNASTAR、.BioEdit和Mega 3.1软件进行系统进化分析.结果表明17株病毒与C4a亚群代表株接近,VP1区核苷酸同源性在95.3%～99.4%之间,1株病毒与C4b亚群代表株较接近,核苷酸同源性在93.0%～95.6%之间;18株病毒与A、B基因型代表株比较差异较大,VP1区核苷酸同源性为81.8%～86.0%,18株病毒之间的VP1核苷酸同源性为92.5%～100%.深圳地区EV71的流行株均属于C4基因型,但以C4a亚群为主,还存在CAb亚群.
关键词： 肠道病毒71型 C4a/C4 b亚群 系统进化分析 -
甘肃省2008～2012年手足口病流行特征及病原学研究
分析甘肃省手足口病流行特征及病原学特征,为制定有效的防控策略提供依据.采用描述性流行病学分析方法对甘肃省手足口病发病资料进行分析,采集的病例临床标本用RT-PCR或Real-time PCR法检测肠道病毒(Human enterovirus,HEV)核酸,用RD和HEp-2细胞分离病毒,阳性病毒株采用RT-PCR方法扩增全长VP1编码区后,进行核苷酸序列测定和分析.结果表明2008～2012年共报告手足口病病例52 550例,包括重症病例205例,死亡病例27例.5年全省发病率依次为22.42/10万、49.29/10万、47.20/10万、27.27/10万和55.84/10万,全省14个市州均有发病,兰州市发病数高为16 001例,占全省病例的30.45％,发病集中在5～7月,占全年病例的51.69％,男女性别比为1.69∶1,其中5岁以下儿童发病占87.59％.对5 416例病例标本进行了实验室检测,HEV核酸阳性3 322例(阳性率61.34％),其中肠道病毒A组71型(Enterovirus A71,EV 71)占46.96％,柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)占41.57％,其他HEV占11.47％.对186例重症病例进行实验室检测,HEV核酸阳性114例(阳性率61.29％),其中EV 71占82.46％;对25例死亡病例进行实验室检测,均为EV71感染.从3 111份临床标本(咽拭子2123份,粪便705份,疱疹液705份)分离到病毒402株,其中EV71占70.15％,CVA16占27.11％,其它柯萨奇A组病毒占3.98％,柯萨奇B组病毒占2.49％,埃可病毒占1.74％,腺病毒占1.99％.流行HEV的基因型分析结果显示,2008～2012年分离到的194株EV71均为C4基因亚型的C4a进化分支;45株CVA16均为B1基因亚型,其中12株属于B1a进化分支,33株属于B1b进化分支,2012年B1b已成优势亚型.结论是甘肃省手足口病在5岁以下儿童感染率高,主要病原为EV 71和CVA16,发病率随感染病原型别的不同呈现波浪形变化,不同病原呈现交替流行的现象,重症和病死病例与EV71感染密切相关,同一年度不同地区的病原型别存在差异.
关键词： 手足口病 甘肃省 流行病学 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A组16型 -
2007年北京地区儿童手足口病病原的初步筛查
2007年4～6月儿童手足口病流行期间,对北京地区51例皮损症状典型、伴/不伴发热、无重症合并症的手足口病患儿采样,建立RT-PCR方法,以5'非编码区(5'UTR)肠道病毒通用引物、CA16和EV71 VP1区特异性引物直接对82份临床标本进行了初步筛查,肠道病毒阳性率达70.6%.检测病例中CA16阳性25例(25/51)、EV71阳性4例(4/51)、非CA16和EV71的肠道病毒阳性病例7例(7/51),三者比例约为6:1:2.2007年北京地区儿童轻症手足口病主要病原包括CA16和EV71,同时还存在一定比例其它肠道病毒.部分EV71毒株经测序验证及系统进化分析显示为C4基因亚型.
关键词： 手足口病 柯萨奇病毒A组16型 肠道病毒71型 北京 -
2010年海南省手足口病流行病学和病原学特征分析
为了探究2010年海南省手足口病(Hand-foot-and-mouth disease,HFMD)的流行病学及病原学特征,本研究对2010年海南省HFMD病例报告信息进行整理分析,并对2010年海南省18县市1346份HFMD病例临床标本进行肠道病毒(enterovirus,EV)实验室检测.核酸检测阳性标本进行EV分离和鉴定,对分离到的肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的VP1编码区全长基因进行扩增及序列测定,用Sequencher 5.0和MEGA 5.0等生物信息学软件基于VP1编码区进行EV71的分子流行病学分析.流行病学分析表明:全省18个县市均有病例报告,尤其以东北部县市高发,同时以4岁以下的婴儿为高发人群；而与全国大多省份流行规律不同的是其发病高峰期为9和10月份.实验室结果显示:EV71和CA16是引起2010年海南省HFMD流行的主要病原,但EV71感染在重症病例和死亡病例中占绝对优势.除此之外,还存在部分由其它EV感染引起的HFMD病例.分子流行病学分析提示:2010年海南省流行的EV71均属于C4a亚型,该亚型为我国近年来流行的优势基因型,同时进化分析提示至少存在3条传播链.本研究数据对阐明海南HFMD的流行传播规律,以进一步指导HFMD防控具有重要理论价值.
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我国分离的肠道病毒71型(SHZH03病毒株)全基因组核苷酸序列分析
对肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)中国(深圳)分离株SHZH03进行了全基因组(未包括多聚腺苷尾)7406个碱基的核苷酸序列测定.结果表明,SHZH03株与其它肠道病毒71型毒株相比,在编码区没有核苷酸的缺失和插入,其5′UTR和3′UTR区的长度和序列有一定的差异.核苷酸同源性比较结果表明,在P1区SHZH03株与SHZH98株、中国台湾流行株(TW2086、TW2272)的同源性较高(分别为92.5%,90.1%和87.9%),与新加坡流行株SIN5666、SIN5865及标准株MS、BrCr的同源性则在81%左右,而与Coxsackievirus A16(Cox.A16)的同源性低(63.6%).氨基酸同源性比较结果表明,在P1区SHZH03株与Cox. A16的同源性低,但在P2和P3区SHZH03株与Cox.A16的同源性高.P1区的遗传进化分析表明,SHZH03株和中国台湾1998年流行的EV71毒株的亲缘关系较近,属于同一型(genogroup),而与标准株BrCr和MS的亲缘关系较远.上述结果有助于肠道病毒71型的基础研究和中国对于EV71所致疾病的预防.
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肠道病毒71型外壳蛋白VP1在Pichia pastoris酵母中的表达
利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒pPIC9K/VP1,转化Pichia pastoris酵母宿主菌GS115,甲醇诱导表达.SDS-PAGE分析显示:表达产物的分子量约为34kD,与天然VP1大小一致.凝胶薄层扫描分析显示:目的蛋白表达量占培养上清总蛋白的60%以上.ELISA实验表明,重组蛋白VP1具有较好的抗原性.使用饱和硫酸铵分级沉淀法初步纯化的表达产物,能够较特异性地与EV71感染者血清中的抗体产生反应,而且与抗柯萨奇病毒A16特异性抗体不产生反应.通过利用表达产物作为抗原,对156份血清的检测初步证实,重组蛋白VP1可以作为检测EV71感染的的检测用抗原.
关键词： 肠道病毒71型 VP1 Pichia pastoris酵母 基因表达 -
深圳地区2001～2004年肠道病毒71型部分VP1区基因分析
肠道病毒71型(Enterovirus type 71,EV71)自1974年Schmidt第[1]人首次报道从美国加利福尼亚暴发的表现为中枢神经系统症状的患者标本中分离到后,世界上许多国家相继报道了EV71在不同地区的流行.
