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2011年天津市手足口病病原检测与基因特征分析
目的 对天津市2011年手足口病(HFMD)进行病原学检测,并对引起HFMD的肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CVA16)进行基因特征分析,为天津市HFMD的防控提供基础资料. 方法 采用Real time RT-PCR方法对HFMD疑似病例标本进行检测,用人横纹肌瘤(RD)细胞对部分阳性标本进行病毒分离;随机挑取16株EV71病毒分离株和9株CVA16病毒分离株,进行VP1区基因扩增,并进行核苷酸序列和遗传进化关系分析. 结果 共检测HFMD疑似病例1 853例,总阳性率为70.91％(1314/1853),其中EV71占49.10％,CVA16占21.61％,EV71和CVA16双阳性占0.91％,其他肠道病毒(EV)占28.46％.16株EV71分离株与C4a亚型代表株具有高的核苷酸序列同源性(97.3％～99.1％),属于C4a基因亚型;9株CVA16分离株与B1b亚型代表株具有高的核苷酸序列同源性(94.9％～95.4％),属于B1b基因亚型. 结论 2011年引起天津市HFMD的EV71型病毒流行株为C4a基因亚型,CVA16型病毒流行株为B1b亚型,并兼有一定比例的其他肠道病毒.
关键词： 手足口病 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A组16型 基因型 -
山东省EV71和CoxA16所致手足口病重症病例流行病学及临床特征分析
目的 比较EV71和CoxA16所致手足口病重症病例临床症状和体征,为手足口病的诊疗和防控提供依据.方法 采用实时荧光定量RT-PCR对重症病例进行病原学分型；收集病例基本信息和临床资料,对2010年确诊的EV71和CoxA16所致手足口病重症病例的临床特征进行比较分析. 结果 EV71与CoxA16所致手足口病重症患者主要为3岁以下儿童(占81.61％),患者平均年龄为2.30岁(0.20～16.39岁).EV71所致重症患者高体温为(38.75±0.04)C,CoxA16所致重症患者为(38.60±0.07)C,差异无统计学意义(t=-1.61,P＞0.05)；两种病毒所致重症患者口腔部位皮疹、咳嗽、流涕和心率加快发生率差异均有统计学意义(P＜0.05),其他症状和体征均一致. 结论 CoxA16与EV71所致重症手足口病患者临床特征基本一致,均引起严重并发症.应加强对CoxA16感染的监测和防控.
关键词： 手足口病 重症病例 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A组16型 临床特征 -
EV71济南分离株感染性克隆的构建及其生物学特征分析
目的 构建以济南本土分离株为模板的EV71感染性克隆,转染细胞以获得拯救病毒并观察其生物学特性,为研究EV71病毒基因结构和功能奠定基础. 方法 分段扩增EV71基因组cDNA并顺序连接至pCDNA3.1载体,同时在序列两端引入自剪切核酶序列,构建能直接转染细胞的病毒基因组全长cDNA克隆,转染RD细胞后获得拯救病毒.通过噬斑形成试验、间接免疫荧光试验和感染性滴度测定观察拯救病毒的生物学特征. 结果 成功构建了病毒基因组全长cDNA克隆,转染RD细胞后观察到典型细胞病变,收获的病毒经RT-PCR扩增出特异性目的片段,全序列测定结果表明拯救病毒与父本株相比具有3个同义突变,未导致推导氨基酸的变异;拯救的子代病毒感染RD细胞后形成典型的空斑;间接免疫荧光试验检测拯救病毒感染细胞可见特异性荧光,荧光密度较父本株病毒稍弱;拯救病毒传代稳定,其感染性滴度(103.48)较父本株(10-5.0)稍低. 结论 成功构建了真核载体的病毒全长cDNA感染性克隆,拯救病毒与野生株具有相似的生物学性状和感染性.
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河南省濮阳市7株肠道病毒71型全基因组序列分析
目的 了解濮阳地区手足口病患者标本中分离的肠道病毒71型(EV71)病毒全基因组特征. 方法 选取本市发生的7例手足口病患者肠道病毒EV71型核酸阳性标本,使用人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcomcell,RD)进行病毒培养,RT-PCR型别鉴定,对分离的7株EV71型毒株通过12对引物进行分段扩增,扩增产物进行EV71型全基因组序列测定和基因进化特性分析,利用生物信息学软件对基因组序列进行分析并构建EV71病毒分类和发育图谱.结果 共分离出7株EV71病毒,系统发育树显示7株病毒在分类上均属于C4亚型C4a分支.在发育相似度上主要分为两大类,其中PY464与宁波2010年NINGBO.CHN/065/2010 EV71分离株相似度高;其他6株呈现聚类,与山东临沂EV71 SDLY107分离株相似度高.在同一时期、同一地区,轻、重症病例分离株VP1区段无明显差别,而全基因x段存在一定差别. 结论 在濮阳市同一地区、同一时期,亦呈现出以某一种手足口病病毒为主的流行趋势.
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双歧杆菌肠道内调控表达肠道病毒71型VP1蛋白的实验研究
目的 构建重组肠道病毒71 VP1基因双歧杆菌,制成口服疫苗,用于EV71感染预防. 方法 扩增EV71病毒VP1基因并将其插入到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pBBAD/Xs中,构建VP1表达载体(pBBADs-VP1),通过Western blot检测VP1蛋白在pBBADs-VP1转化菌中的表达.选取BALB/c小鼠,分为B-VP1组、VP1组、GFP组和生理盐水组,B-VP1组口服pBBADs-VP1-转化双岐杆菌,VP1组腹腔注射大肠埃希菌表达纯化的重组VP1蛋白,GFP组口服pBBADs GFP转化双岐杆菌,生理盐水组口服生理盐水,观察pBBADs-VP1-转化双岐杆菌口服免疫对EV71感染的免疫反应:包括病毒的中和抗体滴度、抗EV71-VP1抗体以及诱导脾脏和淋巴集结中Th1免疫反应. 结果 与GFP组及生理盐水组比较,B-VP1组及VP1组中和抗体滴度及抗EV71 VP1抗体水平,均显著增加;口服表达VP1蛋白长双歧杆菌和注射VP1蛋白都会诱导Th1细胞因子免疫反应(P＜0.05),表达VP1蛋白长双歧杆菌较易诱导局部肠道的Th1模式,而注射VP1蛋白较易诱导全身性免疫.攻毒试验显示,VPI和B-VP1组新生鼠攻击后第15 d(剂量1 000 LD50)存活率分别为20.00％和16.67％,对照组无小鼠存活. 结论 利用长双歧杆菌表达VP1蛋白的口服疫苗可能成功激发针对EV71病毒感染的特异性免疫应答.用表达VP1的重组双歧杆菌免疫母鼠,可以赋予新生小鼠以保护.
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2011年湖北省襄阳市手足口病主要病原EV71型病毒VP1基因特征分析
目的 调查2011年襄阳市手足口病主要病原EV71的基因型特征,分析和探讨该型病毒的VP1基因变异和分子进化特点. 方法 对2011年襄阳市流行株EV71进行VP1区核苷酸序列测定和同源性比较及遗传进化分析.结果 2011年襄阳市手足口病EV71病毒的VPI区核苷酸序列全长均为891 bp,与对照EV71毒株核苷酸序列同源性为96.5％～99.1％,编码蛋白氨基酸序列同源性为98.1％～100％.VP l区基因遗传进化分析显示,该中EV71病毒属于C4a基因亚型. 结论 2011年襄阳市手足口病疫情主要病原EV71病毒均属于C4a基因亚型,未产生明显的抗原漂移及变异.
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不同毒力表型EV71 VP1氨基酸变异的研究
目的 研究EV71 VP1上的变异位点(P639S/G),构建突变体拯救病毒,分析病毒突变前后在细胞上的复制差异性.方法 采用反向遗传学方法,在EV71感染性全长cDNA的基础上构建突变体病毒的全长感染性cDNA,转染获得拯救病毒并传代验证;通过全基因测序,RT-PCR、Western blot、免疫荧光法检测拯救病毒,并绘制拯救病毒的生长曲线.结果 RT-PCR检测到EV71 VP1特异性核酸片段,大小为227bp,与理论值相符;Western blot、免疫荧光检测到EV71特异蛋白;突变前后拯救病毒的生长曲线无明显改变.结论 突变体病毒拯救成功且能稳定传代;EV71-P639变异不影响病毒的复制.
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山东省部分地区肠道病毒71型的RT-PCR检测及基因特征分析
目的 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测2008年山东省部分地区手足口病(HFMD)患者肠道病毒71型(EV71),对毒株进行诊断及基因特征初步分析.方法 以肠道病毒特异引物对EV71进行RT-PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性标本,纯化后与pGEM-T载体连接,转化大肠埃希菌DH5α,筛选后测序,所得序列与我国阜阳、深圳、台湾株及美国EV71标准流行株的核苷酸序列在线进行BLAST比对,分析其同源性.结果 42 份标本中检出EV71 33例(78.57%),所得序列经种系进化分析,与阜阳2008年HFMD暴发分离株同源性为98.7%～99.1%,与深圳1998年HFMD散发分离的EV71毒株同源性为93.4%～93.8%,与台湾1998年HFMD病例分离毒株同源性为91.2%～91.6%,与美国EV71毒株同源性为79.2%～79.7%.有9株EV71的563位苏氨酸(T)替代了EU703813的异亮氨酸(I).结论 EV71 C4亚型是2008年山东省部分地区HFMD暴发流行的病原,同源性分析表明山东省部分地区EV71分离株与阜阳、深圳及台湾地区分离株有较高的同源性,提示该病毒在中国大陆有较广泛的传播.
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EV71感染临床特征及发病机制研究进展
肠道病毒71型(EV71)感染引起手足口病/疱疹性咽峡炎,有时会出现严重的中枢神经系统(CNS)感染,后者导致患儿死亡或留有长期的神经后遗症.EV71感染已成为世界公共健康的新威胁,但是由于对发病机制的认识有限,阻碍了临床诊治工作的发展.本文仅对EV71感染的临床特征和发病机制研究进展进行综述.
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肠道病毒71型研究进展
肠道病毒71型是手足口病的主要病原体,在世界范围内广泛流行.本文综述了近年来肠道病毒71型感染的病原学、流行病学、致病机制、预防与治疗等方面的研究进展.
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深圳市龙岗区肠道病毒71型抗体水平调查
目的 了解深圳市龙岗区儿童肠道病毒71型(EV71)抗体水平及自然感染状况,为预防控制儿童手足口病传播与流行提供依据. 方法 2012年6月采集528名0～5岁儿童血清标本,采用酶联免疫法检测血清中的EV71 IgG.结果 2008～2011年深圳市龙岗区共报告手足口病28847例,年龄11 d～50岁,5岁以下幼儿占总病例数的89.40％(25789/例).528名儿童中EV71 IgG抗体阳性241例,阳性率为45.64％;＜1岁龄的婴儿IgG抗体阳性率低;男童IgG抗体阳性率为46.18％,女童为44.93％,差异无统计学意义(x2=0.37,P＞0.05). 结论 5岁以下幼儿特别＜1岁龄的婴儿是应手足口病防控的重点人群.
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2012年天津市手足口病病原与分子流行病学分析
目的 对天津市2012年的手足口病病例进行病原学检测,并对引起HFMD流行的肠道EV71型(EV71)和柯萨奇A组16型(CVA16)病毒进行分子生物学特征分析.方法 利用Real-time PCR检测HFMD疑似病例标本,用人横纹肌肉瘤(RD)细胞对Real-time PCR检测阳性的部分病例标本进行病毒分离.随机挑取9株EV71病毒分离株和8株CVA16病毒分离株,采用PCR扩增VP1全基因,并进行核苷酸序列和遗传进化分析.结果 共检测HFMD疑似病例1 829例,肠道病毒总阳性率为81.30％ (1487/1829),其中EV71占39.88％,CVA16占38.33％,其他EV占21.79％.9株EV71分离株与C4亚型的C4a分支代表株的核苷酸序列同源性为97.3％～98.5％,均归属于C4a分支;8株CVA16分离株与B1亚型代表株的核苷酸序列同源性为92.9％～97.1％,其中7株属于B1b分支,1株属于B1a分支.结论 导致天津市2012年HFMD流行的EV71为C4亚型中的C4a病毒株,CVA16为B1亚型的B1b病毒株.
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2013年临沂市健康人群肠道病毒流行病学调查
目的 调查临沂市健康人群肠道病毒隐性感染状况和动态变化,并分析健康人群肠道病毒隐性感染情况与地区流行情况的关系. 方法 以≤6岁儿童及其监护人425人为调查对象,分别于4、6和9月进行调查,共调查1 275人次.对被调查者粪便标本进行肠道病毒通用型(PE)、肠道病毒71型(EV71)与柯萨奇病毒A16型(CA16)的Real-time PCR检测,对检测结果进行分析. 结果 1)在兰山区与平邑县健康人群粪便标本中检出 111人次PE与12人次CA16,阳性率分别为8.71％和0.94％,未检出EV71;2)兰山区0～、1～、2～、3～、4～、5～和21～岁年龄组人群肠道病毒核酸阳性率分别为16.67％、23.33％、13.33％ 、25.83％、12.38％ 、3.81％和5.00％,平邑县分别为3.33％ 、20.00％、10.00％、17.50％、2.86％、5.83％和3.33％.除5～6岁年龄组外,在其他年龄组兰山区阳性率均高于平邑县;3)兰山区4、6和9月健康人群肠道病毒阳性率分别为9.93％、24.82％和9.29％,平邑县分别为6.21％、19.31％和6.89％;两县区肠道病毒阳性率均呈现先升高后降低的趋势;4)肠道病毒隐性感染者比例与该地区本年度流行型别呈正相关. 结论 健康人群肠道病毒隐性感染者比例随季节变化呈先升高后降低的钟形或半钟形的有规律变化;健康人群肠道病毒隐性感染与该地区流行情况密切相关.
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细胞膜胆固醇在流行性乙型脑炎病毒及肠道病毒71型感染人神经细胞中的作用
目的 探讨细胞膜胆固醇在流行性乙型脑炎病毒(JEV)和肠道病毒71型(EV71)感染人神经细胞中的作用.方法 CCK-8法检测胆固醇删除剂甲基-β-环糊精(MβCD)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的毒性.分别用JEV和EV71感染MβCD预处理的SH-SY5Y细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MβCD对2种病毒mRNA表达的影响.在病毒感染细胞的不同时间加入MβCD,观察2种病毒mRNA表达水平的变化.结果 MβCD的高工作浓度为5 mmol/L;qRT-PCR显示MβCD预处理神经细胞可分别抑制JEV和EV71 mRNA的表达(P＜0.05);MβCD在EV71感染细胞后60 min加入则无法抑制病毒mRNA表达(P＞0.05).结论 细胞膜胆固醇在JEV和EV71感染人神经细胞中均发挥作用,但作用时间不一致.
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2011-2012年深圳市手足口病疫情流行病学和病原学特征分析
目的 了解深圳市2011-2012年手足口病聚集性疫情的流行病及病原学特征,为进一步开展防控工作提供依据.方法 应用描述流行病学方法对手足口病疫情资料进行分析,同时对各起疫情采集的标本,采用荧光PCR方法进行肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CA16)和其他肠道病毒的核酸检测.结果 2011-2012年实验室共收到160起手足口病疫情的标本501份,其中EV71引起的疫情36起,占22.50％;由CA16引起的疫情52起,占32.50％;由其他肠道病毒引起的疫情40起,占25％.各区均有疫情发生,其中南山区84起,占52.50％;罗湖区36起,占22.5％.除8月份以外,其他月份均有疫情发生,3-7月份为发病高峰,9-11月份出现第2个小高峰.男性阳性率72.3％,女性阳性率73.4％.结论 2011-2012年深圳市手足口病聚集性疫情有地区和月份差异;不同性别间的阳性率没有显著性差异;病原体2011年以CA16为主,2012年则是非EV71、非CA16的其他肠道病毒占主导地位.
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新疆兵团2011-2016年肠道病毒71型分子进化特征分析
目的 分析新疆兵团2011-2016年肠道病毒71型(EV71)的基因亲缘关系,为手足口病的预防控制提供病原学资料.方法 采用RT-PCR扩增标本中EV71的VP1编码区基因,进行核苷酸序列测序及序列分析.利用MEGA6.06与GenBank代表株进行核苷酸同源性分析并构建系统进化树.结果 兵团37株EV71流行株之间VP1区核苷酸和氨基酸序列同源性分别为87.3％～100.0％和93.1％ ～100.0％,均为C4a基因亚型,分别处于7个相对独立的小的进化分支,流行株与代表株相比共有28处氨基酸位点发生了变异,有9株在第283氨基酸位点发生了由S(丝氨酸)到T(苏氨酸)的变异,在293氨基酸位点发生了由A(丙氨酸)到S(丝氨酸)的变异.结论 兵团2011-2016年EV71流行株均为C4a基因亚型,与代表株相比VP1区有28处氨基酸位点发生了变异,有9株流行株在283和293氨基酸位点发生了共同变异.
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甘肃省2013-2015年手足口病流行特征及病原学分析
目的 分析2013-2015年甘肃省手足口病流行特征及病原学特征,为制定有效的防控策略提供依据.方法 采用描述性流行病学方法分析;采集的临床标本用Real-time PCR法检测肠道病毒核酸,病毒分离采用RD和HEp-2两种细胞系,获得的毒株采用RT-PCR方法扩增全长VP1编码区,并进行核苷酸序列测定和分析.结果 2013-2015年共报告手足口病病例29 934例,其中重症病例81例, 死亡2例.全省14个市州均有发病,兰州市发病数高为7 053例,占全省病例的23.56%,发病集中在 5-7月份,占全年病例的61.69%,男女性别比为1.5∶1,5 岁以下儿童发病占83.02%.对5 251例病例标本进行肠道病毒核酸检测,阳性2 972例(阳性率56.60%);81例重症病例中肠道病毒核酸阳性55例(阳性率67.90%);2例死亡病例均为EV71感染.分离到的341株病毒中,133株EV71的VP1基因分型均为C4a;134株CVA16中6株属于B1a,128株属于B1b.结论 2013-2015年甘肃省手足口病为5岁以下儿童感染率高,病原构成中EV71和CVA16的比例较2013年前下降,非CVA16 和EV71的肠道病毒比例增加,发病率呈现波浪形变化.
关键词： 手足口病 流行病学 肠道病毒71型 柯萨奇病毒A组16型 肠道病毒 -
2011-2015年苏州市手足口病相关病原监测
目的 对苏州市2010-2015年的手足口病相关病毒进行病原学监测分析,为苏州市预防和控制手足口病提供科学依据.方法 以苏州每个区为单位,每月采集至少五个轻症病例标本,重症病例均采样,采用实时荧光PCR方法进行病毒核酸检测,并对结果信息进行描述分析.结果苏州市2011-2015年共采集手足口病标本4 552份,检测结果为阳性的手足口标本2 818份(总阳性率为61.90%),相邻年份阳性率差异有统计学意义(x2=186.09,P<0.0001).手足口病主要感染1~5岁的儿童,其中66.17%是1~3岁儿童.EV71和CVA16是苏州市2011、2012年和2014年手足口病主要的病原;重症病例主要与EV71感染有关,2013年的肠道病毒其他亚型占主导地位,重症患者显著减少.结论 EV71和CVA16仍然是苏州市手足口病的重要病原体,但其他亚型的肠道病毒也占有一定比例,建议从肠道病毒的非EV71和CVA16中选择个别优势手足口病病原纳入手足口病监测.
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菏泽市手足口病儿童病例肠道病毒71型抗体水平分析
目的 分析手足口病低龄儿童病例的肠道病毒71型(EV71)感染状况.方法 采集手足口病(HFMD)病例的血样,通过ELISA间接法检测EV71 IgG和IgM抗体并分析年龄、性别分布情况.结果 收集到159例HFMD儿童病例的血样和资料,年龄为1～5周岁,平均EV71 IgG抗体阳性率为63.5%,无性别差异,平均IgM抗体阳性率为12.0%;EV71 IgG阳性率随着年龄增长而呈降低趋势,男奄的IgM阳性率显著高于女童.结论 本次HFMD疫情的病原体是EV71,男性儿童的EV71感染发病率高于女性儿童,结果可为HFMD防治提供参考依据.
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肠道病毒71型重组VP1蛋白的表达和EV71型手足口病血清学诊断方法的建立
目的 获得纯化的具有免疫活性的肠道病毒71型VP1蛋白,建立EV71感染早期、快速和准确的ELISA血清学诊断方法.方法 通过PCR方法扩增出VP1基因,定向克隆到原核表达载体pET-21b(+),阳性质粒转化入E.coli B121(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印迹分析目的 蛋白的表达水平.纯化的VPI蛋白用作包被抗原,建立手足口病(HFMD)患者抗-EV71-IgM和IgG的血清学诊断方法.结果 成功表达和纯化了VP1重组蛋白,所表达的蛋白能被EV71型手足口病患者血清所识别.调查发现,与正常人和EV71阴性手足口病患儿比较,EV71阳性手足口病血清中抗-EV71-IgM和IgG中A值显著升高.差异具有统计学意义(P<0.05).与RT-PCR结果比较,发现该方法IgM的诊断敏感性和特异性分别为73%和77%;该IgG诊断方法的敏感性和特异性分别为82%和83%.完成该试验仪需4 h.结论 利用pET原核表达系统成功克隆、表达和纯化了肠道病毒71型重组外壳蛋白VPI,且具有良好的抗原性.该抗原可用于研制EV71血清学诊断试剂盒.
