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皮肤苏尔加分枝杆菌感染一例
患儿女，7岁，因左侧面部斑块4年就诊。皮肤科检查：左侧面部见6cm×5cm境界清楚环状斑块，质韧，无明显触痛，皮损表面可见脓痂。组织病理：表皮部分破溃、坏死，真皮内弥漫性淋巴、组织细胞及上皮样细胞浸润，局灶伴较多嗜中性粒细胞。过碘酸雪夫染色（PAS）阴性、抗酸染色阴性。组织培养25 d后见暗产色分枝杆菌菌落。菌落涂片抗酸染色阳性。PCR扩增16S rRNA、hsp65基因产物发现与苏尔加分枝杆菌同源性接近，分别为100%、99%。给予利福平、异烟肼、乙胺丁醇治疗后好转。
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慢性根尖周炎根管中8种厌氧菌检出分析
目的 应用16S rRNA-PCR技术检测慢性根尖周炎患牙根管内8种厌氧菌的定植情况,分析根管细菌与患牙临床症状的关系.方法 采集23例慢性根尖周炎患牙根管样本,提取样本细菌DNA,用细菌16S rRNA引物通过PCR扩增细菌基因片段检测细菌种类.结果 23例样本均检出有细菌存在,待检细菌检出率达73.91%(17/23).其中检出率高的是中间普氏菌(39.13%),其次是牙龈卟啉菌(30.43%)和福赛斯类杆菌(21.74%),变黑普氏菌、齿垢密螺旋体和啮蚀艾肯氏菌均为13.04%,伴放线放线杆菌有1例检出,直肠弯曲杆菌未检出.中间普氏菌在有自发痛症状组检出率高于无自发痛症状组(P＜0.05),其他细菌检出率组间比较差异无显著性.结论 慢性根尖周炎患牙根管内以厌氧菌感染为主;根管内中间普氏菌感染与患牙自发痛症状相关.
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中华鳖致病性嗜水气单胞菌的分离鉴定及毒力因子检测
从患病的中华鳖肝脏分离到一株优势生长菌.对分离菌进行了形态特征、理化特征等表型生物学特征检验、毒力因子检测,同时应用分子生物学方法测定了分离菌株的16S rRNA基因序列,判定该菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ahydrophila).对分离菌采用PCR方法进行溶血素hly和气溶素aer基因的检测,结果显示分离菌携带hly和aer基因.
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PCR快速检测细菌16S rRNA基因的初步研究
目的:建立检测细菌16S rRNA基因的PCR方法.方法:以细菌16S rRNA基因为靶序列,利用计算机软件primer5.0 , Bioedit设计2条引物-pm1,pm2并建立相应的PCR方法.采用该PCR方法扩增实验室保留菌株的16S rRNA基因;以人类外周血白细胞基因组DNA、HBV-DNA阳性血清以及白色念珠菌为对照,检测该实验方法的特异性;采用倍比稀释的方法进行该实验方法的敏感性实验.结果:用引物pm1,pm2对17个不同菌株进行PCR扩增,均得到371bp左右长度的DNA片段,特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应.敏感性实验表明,用pm1,pm2引物进行的PCR扩增可检测出20CFU/ml.结论:16S rRNA基因PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点.
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VVC 与 RVVC 患者治疗前后阴道菌群的对比研究
目的：从菌群总体角度分析和比较单纯性外阴阴道假丝酵母菌病（ vulvovaginal candidiasis ，VVC）患者与复发性外阴阴道假丝酵母菌病（ recurrent vulvovaginal candidiasis ，RVVC）患者临床治疗前后阴道菌群的差异，了解临床治疗与阴道微生态多样性的相关性。方法采集VVC患者（ VVC组，3例）及RVVC患者（ RVVC组，3例）女性阴道后穹窿分泌物，提取细菌总基因组DNA，扩增16s rRNA V4区基因，以得到样品的物种信息用于对比研究。结果 VVC组和RVVC组两组阴道菌群未见显著差异，而以个体为特点区分聚类。用药后，VVC组菌群的α-多样性未见明显改变，但菌群结构改变显著，体现在乳酸菌比例增加，加德纳菌和变异菌属比例降低。用药后RVVC组菌群的α-多样性和菌群构成均未见显著改变（ P＞0.05）。结论VVC组和RVVC组阴道菌群无显著差异。用药后，VVC组菌群结构改变较RVVC组显著。
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产褥期阴道微生态研究
目的 应用细菌基因测序技术了解阴道内微生物种群的分布情况.方法 采集10例产褥期妇女阴道分泌物(pH值、清洁度、脓球、滴虫、霉菌等)测定雌激素,提取微生物总基因组,扩增16S rRNA测序.另选择正常育龄妇女为对照,比较两组结果了解产褥期阴道微生态情况,菌种组成情况和生理情况.结果 正常妇女阴道中的乳杆菌属(Lactobacillus)的含量是产褥期妇女的＞100倍,早期产妇,乳酸杆菌显著下降,这导致其抵抗力下降.不动杆菌属在产妇早期的的阴道中含量上升,表明其抵抗力下降.结论 产褥期孕妇的微生态呈现一个动态的过程,早期产褥妇女与正常妇女有显著差异,而在产褥后期的微生态基本与正常妇女一致.16S rRNA测序可以较好的揭示阴道微生态的变化,其有希望成为一个新的、系统的评估手段.不仅可以分析产妇阴道微生态的恢复情况,还能用于检测和评估其综合情况.
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16S rRNA/ITS基因序列分析与微生物分类鉴定及其在药品微生物质量控制中的应用
经典的微生物鉴定有赖于微生物的纯培养,其在一些难培养、生长缓慢或需要特殊营养的微生物鉴定方面有明显的局限性.全自动细菌鉴定及药敏分析系统和基质辅助激光解离飞行时间质谱对微生物鉴定属表型鉴定.严重依赖仪器生产厂商提供的数据库,对类型多样的环境微生物的鉴定分型有明显缺陷.基于遗传物质的分子生物学签定技术为微生物的准确鉴定及分型提供了新的思路.16S rRNA/ITS遗传信息具有相对稳定性和易变异的双重特点,不依赖于微生物的营养及生长状态,在微生物的鉴定、分型中得到广泛应用.微生物是影响药品质量的重要因素,而药品微生物控制是药品质量控制的重要方面.本文对16S rRNA/ITS序列与微生物鉴定、分型及其在药品微生物质量控制领域中的应用进行综述,为相关工作提供参考.
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黄连解毒汤对健康大鼠肠道菌群结构影响的研究
[目的]研究黄连解毒汤对健康大鼠肠道菌群结构的影响.[方法]雄性Wistar大鼠20只依据体重分为空白对照组和黄连解毒汤组,每组各10只.黄连解毒汤组按照700mg/kg的剂量给予黄连解毒汤提取物溶液灌胃,空白对照组大鼠给予相同体积的0.9％氯化钠溶液灌胃,两组均连续给药7d.7d后采用Illumina高通量测序技术检测两组大鼠的肠道菌群,寻找其中的差异菌群并对其进行生物学分析.[结果]在门水平菌群变化中,与空白对照组比较,服用黄连解毒汤临床剂量7d可以显著降低健康大鼠肠道中放线菌门和厚壁菌门细菌所占总菌的比例,两组差异具有统计学意义(P<0.05).在属水平上,可以显著性降低健康大鼠肠道中Adlercreutzia菌、消化链球菌和克里斯滕森菌所占的比例,两组差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01).[结论]通过肠道菌群实验发现,黄连解毒汤临床剂量服用7d后可对健康大鼠的肠道菌群产生一定的调节作用.
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福建部分地区人和动物嗜吞噬细胞无形体基因检测和序列分析
目的 了解福建省人和动物嗜吞噬细胞无形体的感染状况以及基因特征.方法 收集永春县和上杭县高危人群、家畜的全血,采用巢式PCR扩增无形体16S rRNA片段,PCR产物纯化测序并与序列比对分析.结果 永春县牛的无形体感染率高为53.85％,羊、狗无形体感染率分别为24.71％和12.50％.上杭县羊的无形体感染率为53.06％,高危人群的无形体感染率为8.33％.无形体基因序列与相应的参考序列同源性均达97％～100％.结论 福建省人和动物存在嗜吞噬细胞无形体感染.
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胃黏膜组织中恶臭假单胞菌临床意义的探讨
目的 探索恶臭假单胞菌在幽门螺杆菌感染相关胃肠疾病中的意义.方法 采集14C尿素呼气试验阳性患者病变胃黏膜354例,进行细菌的分离培养.根据菌落形态、革兰染色、尿素酶试验及幽门螺杆菌特异性16S rRNA基因片段的PCR进行幽门螺杆菌的鉴定,同时提取胃黏膜组织DNA,通过幽门螺杆菌特异性PCR进行快速诊断.将非幽门螺杆菌转种于营养琼脂培养基,进行快速尿素酶试验.尿素酶阳性的非幽门螺杆菌染色体DNA利用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增、测序及序列比对.使用全自动细菌鉴定仪对经测序比对为恶臭假单胞菌的菌株进行鉴定.采用K-B纸片扩散法进行药物敏感性试验.结果 从354例样本中分离出革兰阴性、尿素酶阳性的恶臭假单胞菌10株,经16S rRNA基因测序和序列比对,与GenBank中恶臭假单胞菌的相似性≥98％.10株恶臭假单胞菌的胃黏膜标本中,6例标本幽门螺杆菌特异性PCR为阳性,4例为阴性.传代存活的7株恶臭假单胞菌的K-B法药物敏感试验显示对左氧氟沙星均敏感,1株对四环素敏感,5株对阿莫西林耐药,6株对克拉霉素耐药,7株对甲硝唑、氨苄青霉素均耐药.7株菌经全自动细菌生化鉴定仪鉴定结果均为恶臭假单胞菌.结论 病变胃黏膜中分离出尿素酶阳性且对治疗幽门螺杆菌感染的多种抗生素耐药;可能造成临床上14 C-尿素呼气试验假阳性,并继发感染影响胃肠疾病的进展.
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一种检测胆螺杆菌套式 PCR 方法的建立
目的：建立一种敏感性高、特异性强的检测胆螺杆菌的套式PCR方法。方法基于17种胆螺杆菌亚种的16S rRNA 基因设计筛选出1套套式引物（2条内引物、2条外引物），优化反应条件后，通过模拟粪便标本、动物模型标本和临床标本的检测对方法的敏感性和特异性进行评估。结果模拟粪便标本中，该方法检测胆螺杆菌的敏感性达到10 CFU／100μL。3例感染胆螺杆菌的SPF级BALB／c小鼠模型中，3例小鼠粪便和盲肠中均可检测到胆螺杆菌，1例肝脏标本中检测到了胆螺杆菌。10例胆石病患者中，有2例患者的胆汁、胆囊粘膜和粪便标本中检测到了胆螺杆菌。结论本研究建立的套式 PCR方法，敏感性高、特异性强，可用于检测胆螺杆菌的感染。
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云南省曲靖市啮齿动物的立克次体血清学和分子流行病学调查
目的 调查云南省曲靖市啮齿动物感染立克次体状况.方法 用鼠笼法捕鼠,采集鼠血清和脾脏.用间接免疫荧光试验(IFA)检测鼠血清中7种常见立克次体的IgG抗体;用巢氏PCR方法检测鼠脾中嗜单核细胞埃立克体和嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因片段部份序列.结果 2012年7-9月在曲靖市捕获啮齿动物3种592只,褐家鼠(Rattus norvegicus)和黄胸鼠(Rattus flavipectus)构成比分别为61.49％和35.47％.鼠血清中贝氏柯克斯体(Coxiella burentii)、莫氏立克次体(Rickettsia typhi)、恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)、西伯利亚立克次体(Rickettsia sibirica)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)和嗜单核细胞埃立克体(Ehrlichia chafeensis)的抗体阳性率依次为21.45％、7.60％、7.09％、3.38％、1.18％和0.51％;未检测到猫立克次体(Rickettsia felis)抗体.从5份褐家鼠脾脏标本中检测到16S rRNA基因序列,同源性和进化分析表明,1株为嗜吞噬细胞无形体,4株为莫氏立克次体.结论曲靖市啮齿动物中存在莫氏立克次体和人粒细胞无形体流行,褐家鼠可能是主要宿主;同时还存在恙虫病东方体、贝氏柯克斯体、斑点热立克次体和埃立克体的感染.当地疾控和医疗机构应加强立克次体病的监测.
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我国首株牛源贾第虫的分子鉴定
目的 通过16S及内转录间区(ITS)rDNA基因序列的扩增、克隆以及序列分析,从分子水平对首次在我国分离腚的一株牛源贾第虫进行种类及基因型鉴定.方法 根据GenBank中登录的贾第虫rRNA基因序列,设计引物,采用热启动-降落PCR方法从牛源贾第虫基因组DNA中扩增出目的片段,经TA克隆至pMD18-T载体后测定其核苷酸序列,然后进行序列分析.结果 成功地扩增出该株牛源贾第虫的16S rRNA全基因及rDNA ITS序列,大小为1 715 bp,包括1 447 bp的16S rDNA全长序列和243 bp的ITS间区序列,以及25 bp的26S rDNA基因5末端.序列分析表明此牛源贾第虫为E型蓝氏贾第虫.结论 本研究从分子水平鉴定我国首株牛源贾第虫为蓝氏贾第虫(E型),并首次报道了该虫株的rDNA 16S及ITS序列,为牛源贾第虫的进一步研究奠定了基础.
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鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定
目的对分离自发病欧洲鳗鲡的创伤弧菌疑似菌株进行准确的鉴定.方法首先尝试利用一对16S rRNA基因特异性通用引物PCR扩增一株鳗源创伤弧菌疑似株的基因组DNA,得到一个约500bp的DNA片段, 将该DNA片段亚克隆至pMD18-T载体,鉴定克隆化成功之后,送专业公司进行测序,得到一个502bp 的DNA产物,NCBI上同源性比较表明,该片段与GeneBank上注册的创伤弧菌的16S rDNA序列同源性高(100%),同时排除了哈维氏弧菌的可能.设计一对创伤弧菌溶血素特异性引物,实现了对鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定.结果建立一种简洁的鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定方法.结论国内首次自发病欧鳗分离到创伤弧菌,并给出分子鉴定证据.
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一种引起鳗鲡和人肠炎样疾病的新致病菌--海安气单胞菌
从江苏海安境内的病鳗和病人腹泻便中分离出9株细菌.这些细菌均为G杆菌,有动力,在37℃无盐胨水中生长,氧化酶阳性,发酵莆萄糖,能迅速产生褐色色素 ,对O/129抗性,主要生化特征符合气单胞菌,但有几项不同于已报道的其他种.G+C mol% 测定,DNA杂交,16S rRNA测序比较结果显示这些菌是气单胞菌中的一个新种.脂肪酸甲脂分析进一步确认这一结论.菌株对氟哌酸、痢特灵及中草药五倍子、大黄比较敏感,对青霉素、复方新诺明有抵抗力.小鼠的半数致死量为3.9×106,鳗鲡的半数致死量为1.2×1 05.具有菌毛,胞外蛋白酶等毒力因子,结合流行病的调查,临床症状观察,认为这些菌是引起鳗鲡和人肠炎样疾病的新的致病菌.模式菌株为95-173(CCTCC AB97026=IFO16641) T,特以发现地命名为海安气单胞菌(Aeromonas haianesis).
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RT-LAMP与LAMP法检测结核分枝杆菌的效果比较
目的 比较 RT-LAMP、LAMP、L-J 法检测 MTB的效果,为结核病的快速诊断提供依据.方法 用常见的非结核分枝杆菌与其他常见的呼吸道感染病菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌)检测特异性,并用酶切实验对结核分枝杆菌特异性产物进行酶切鉴定;用 RT-LAMP、LAMP、L-J 法检测100名结核病患者和22名来自无结核病患者痰标本中的结核分枝杆菌测试灵敏性;对浓度为1 ng/μL H37Rv标准株进行对倍比稀释用于 RT-LAMP 极限检测实验.结果 RT-LAMP、LAMP、L-J 方法的阳性率分别为100%,92%和88%;RT-LAMP和L-J,RT-LAMP和LAMP差异均有统计学意义;RT-LAMP的灵敏度比LAMP高10倍;RT-LAMP不仅可以识别活菌,并且能够重复检测MTB的单一拷贝.结论 RT-LAMP检测效果优于 LAMP及 L-J,适于基层医院结核病诊断的推广和应用.
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猪源奇异变形杆菌的分离鉴定与生物学分析
目的 从四川省某规模化养猪场病死猪肝脏分离到一株奇异变形杆菌,分析其生物学特性,为临床鉴别诊断和治疗提供参考.方法 对分离株进行革兰氏染色、培养特性观察、毒力试验、生化试验、药敏试验以及16SrRNA基因序列分析,并且构建系统进化树.结果 分离株16S rRNA测序结果经BLAST对比分析,其与各株奇异变形杆菌同源性均为98％以上,将分离株与GenBank中其他6株不同来源的变形杆菌与3株不同来源的肠杆菌科细菌进行序列对比分析并且构建系统进化树,证明分离株与猪源奇异变形杆菌(HQ259935.1)的同源性高,为99.8％;与大肠杆菌,沙门氏菌,克雷伯氏菌的同源性仅为92.1％～93.2％.致病性试验表明分离株对小鼠LDs0为1.86×106 CFU/只.分离株对氨基糖苷类和β-内酰胺类药物中度敏感,对其他种类药物敏感性较低.结论 分离株经鉴定为猪源奇异变形杆菌,具有较高的耐药性和致病性.
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贵州省3株钩端螺旋体分离株PFGE分型与基因种鉴定
目的 应用脉冲场电泳(PFGE)分型技术和16S rRNA基因测序分析技术分别对贵州省3株动物宿主钩端螺旋体分离菌株进行分子分型和基因种鉴定,了解贵州省钩端螺旋体的分子流行病学特征.方法 应用DNA限制性内切酶Not I对钩端螺旋体染色体DNA酶切后,用PFGE将DNA片段分离,采用BionumericsV4.0将3株钩体菌株PFGE图谱与中国15群15型参考菌株进行聚类分析;同时,应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,并与GenBank数据库已注册的核酸序列进行同源性比对、确定基因种、分析亲缘进化关系.结果 来自贵州省的3株动物宿主分离钩体菌株PFGE带型命名为LepNot I 002和LepNot I 003,经聚类分析,3株菌株与黄疸出血群黄疸出血型赖株的相似性大于95%.16S rRNA基因测序和分析表明,3株贵州分离钩体菌株之间的同源性为100%,与致病性钩体问号钩端螺旋体种(L.interrogans)不同血清型参考菌株的同源性达100%.结论 3株贵州动物分离钩体菌株经PFGE分型鉴定与黄疸出血群赖型赖株的相似性大于95%,经16S rRNA基因测序分析鉴定为L.interrogans种,上述两种方法对贵州省钩体分离菌株的鉴定结果一致,有助于贵州省钩端螺旋体病的主动监测、暴发调查和传染源追踪.
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肠球菌为主要菌群的腹泻标本的16S rRNA与PFGE分析
目的 了解肠球菌为主要菌群的腹泻标本的微生态及分离肠球菌菌株的克隆特征.方法 根据细菌16S rRNA保守区序列设计通用引物,以腹泻病人粪便标本中的总DNA为模板,PCR扩增16S rRNA片段.将获得的片段克隆入T载体进行测序,与数据库中发表的序列进行比对,判断标本中细菌的种类和比例,并对每份标本分离的各50株肠球菌选择20株进行PFGE分析.结果 对4份标本的多次16S rRNA序列分析表明,该4份标本均以Enterococcus faecium为主(所占比例>68%),PFGE结果显示每个病人分离屎肠球菌菌株是克隆性的(一份标本除外).结论 从16S rRNA和PFGE的角度对腹泻粪便标本进行了分析,得到腹泻儿童肠球菌分布的基本特征,其致病性和相关机理还待今后实验范围的进一步扩大和研究的深入.
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分支杆菌临床分离株的16S rRNA基因序列分析
目的建立分支杆菌的16SrDNA序列分析的方法,采用该方法鉴定临床结核分支杆菌分离株.方法用PCR从重庆某医院的肺部感染病人的痰标本中分得的29株分支杆菌菌株中扩增16S rRNA 基因(16S rDNA)的5′端片段(～500bp),并测定所得到片段的DNA序列.用DNA分析软件将所获得的序列与GenBank的分支杆菌序列相比较,计算种间相似性,并用序列构建分支杆菌菌株的系统发育树,对分离株进行分类与鉴定.结果有14株的16S rDNA序列分别与已知结核分支杆菌复合群(Mycobacteria tuberculosis complex, MTC)、戈登分支杆菌、新金色分支杆菌、氯酚红分支杆菌、龟分支杆菌或脓肿分支杆菌的序列完全相同.依据完全一致的序列可以准确鉴定这些临床分离株为相应的种;部分分离株的16S rDNA在GenBank序列检索中无完全一致的匹配序列.用临床分离株的16S rDNA序列与已知的分支杆菌16S rDNA序列构建的系统发育树,结果提示某些菌株可能是与已知分支杆菌密切相关的新种或是它们的亚种.结论 16S rDNA序列分析鉴定分支杆菌是一种快速、可靠、成本较低的方法;重庆地区非结核分支杆菌感染的种类与其它地区的报告有明显不同.
