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分枝杆菌中原核类泛素蛋白化靶蛋白的功能分析
分枝杆菌中存在一种类似真核生物泛素的小分子蛋白,称为原核类泛素蛋白(prokaryotic ubiquitinlike protein,Pup),蛋白被Pup共价标记后,或被蛋白酶体降解或参与修饰后的调节作用,可影响细菌活动的各个环节.结核分枝杆菌中目前发现可被Pup标记的共有58种蛋白;耻垢分枝杆菌被标记了41种蛋白,其中38种都可以在结核分枝杆菌中找到同源蛋白.这些标记后的靶蛋白涉及了至少6种机制和功能,包括分枝杆菌的毒力、信号通路、脂类的合成、细胞壁和(或)膜的合成、中间代谢,等等.其中大部分蛋白被标记后经由蛋白酶体降解,也有被Pup标记的蛋白参与信号传导和调控作用;通过对这些靶蛋白的比较分析,能够对结核分枝杆菌的耐药和致病机制提供进一步的解释,同时这些Pup标记的蛋白也可以作为潜在的药物靶点,对其的分析研究可为结核病的治疗和控制提供理论基础.
关键词： 分枝杆菌属 泛素类 蛋白酶体内肽酶复合物 -
Oct4通过类泛素修饰途径维持胶质瘤干细胞增殖潜能
目的 研究类泛素蛋白(SUMO)与肿瘤干细胞“干性”诱导基因Oct4共同维持胶质瘤干细胞于持续增殖状态的分子机制.方法 采用极低密度细胞接种法培养C6胶质瘤肿瘤干细胞克隆球,血清还原+免疫荧光方法验证肿瘤干细胞分化能力.实验设对照组、无义组和SUMO1组.持续测量克隆球直径,免疫荧光方法检测Ki67、CD133、巢蛋白和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达情况,Western blot法检测Oct4和SUMO1的表达水平.结果 肿瘤细胞克隆球被血清诱导分化后高表达胶质细胞标记蛋白GFAP.与对照组和无义组比较,SUMO1组细胞克隆球直径增长速度、Ki67、CD133、巢蛋白阳性率明显降低(P＜0.05),GFAP阳性率明显升高[(57.35±7.87)％vs(1.09±0.27)％,(0.87±0.21)％,P＜0.05],SUMO1组游离及共价结合状态的SUMO1及Oct4明显降低(P＜0.05).结论 Oct4通过与SUMO1共价结合共同维持胶质瘤干细胞持续增殖潜能.
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过表达parkin基因对蛋白酶体抑制剂致SH-SY5Y细胞损伤的影响
目的 探讨过表达parkin基因能否抵抗蛋白酶体抑制剂lactacystin对SH-SY5Y细胞的特异性损伤.方法 不同浓度的lactacystin(1、5、10、15、20 μmol/L)分别作用于人多巴胺能SH-SY5Y细胞和人胶质瘤U251细胞24 h,用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法检测细胞活力.选取10μmol/L和20μmol/L lactacystin处理SH-SY5Y细胞,Western印迹法检测细胞内多泛素化蛋白的含量.瞬时转染parkin至SH-SY5Y细胞,并以MTT法检测10 μmol/L和20 μmol/Llactacystin作用下的细胞活力,Western印迹法检测细胞内多泛素化蛋白的含量,以及用免疫荧光法检测泛素阳性包涵体的形成.结果 lactacystin呈剂量依赖性地损伤多巴胺能SH-SY5Y细胞(细胞活力分别为104%、82%、72%、60%、50%),而对胶质瘤U251细胞则无毒性作用.parkin过表达不能缓解lactacystin的毒性作用,也没有增加细胞内多泛素化蛋白生成,但却促进泛素阳性包涵体的形成(增加5%).结论 蛋白酶体功能障碍有可能在多巴胺能神经元的选择性死亡中起关键作用,而Parkin蛋白在路易小体的形成过程中可能起重要作用.
关键词： 蛋白酶体内肽酶复合物 泛素类 多巴胺 基因表达 细胞死亡 -
泛素蛋白-D在术后化疗的Ⅱ期结肠癌患者中的表达及临床意义
目的 探讨人泛素蛋白-D(Ubiquitin D,UBD)在接受术后以5-氟尿嘧啶为基础的辅助化疗的Ⅱ期结肠癌患者中的表达及其临床意义.方法 随机选取106例接受术后以5-氟尿嘧啶为基础的辅助化疗的Ⅱ期结肠癌患者,根据有无复发分为:复发组(35例)和未复发组(71例).从两组患者中分别随机选取20例Ⅱ期结肠癌肿瘤组织和配对的正常组织,采用实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测UBD基因的mRNA表达量,用免疫组织化学方法检测UBD基因在化疗后35例复发和71例未复发患者癌组织及相应正常组织中蛋白表达量.用x2检验比较计数资料之间差异,通过COX比例风险模型评估风险.结果 复发组和未复发组肿瘤组织中UBD mRNA的平均表达量分别是7.64及2.87(x2=10.7,P＜0.01).免疫组织化学结果显示UBD在复发和未复发患者肿瘤组织中阳性表达率分别为86％ (30/35)及59％ (42/71) (x2 =7.59,P＜0.01).UBD阳性者化疗后5年无瘤生存率(P＜0.05)和总体生存率(P＜0.05)均显著降低.结论 UBD基因表达是影响Ⅱ期结肠癌患者化疗后无瘤生存率和总体生存率的独立预后因素.
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小泛素相关修饰物与神经系统变性疾病
近二十年来,有关泛素的研究得到了飞速的发展,泛素化是细胞体内一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式,泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome system,UPS)是指泛素通过标记靶蛋白使其被蛋白酶体识别、降解,在细胞凋亡、DNA修复及细胞分裂等生理和病理过程中发挥着重要作用[1].小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)是新发现的泛素类蛋白家族的重要成员之一,它在三级结构、生化反应途径上与泛素相似,但功能上却与泛素介导靶蛋白的降解截然不同,它主要调节蛋白的定位与稳定性以及参与许多关键的细胞功能活动[2].近还有发现表明,SUMO与一些神经系统变性疾病有关,可能会为这类疾病的病因的研究和治疗带来新的着手点,我们因此对该方面的进展作一综述.
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亚低温对脑缺血大鼠海马神经元中类泛素蛋白表达的调控
目的 研究亚低温对大鼠海马神经元中类泛素蛋白(SUMO)表达的调控作用,探索亚低温对脑缺血后神经元的保护机制.方法 原代培养孕龄18 dSD大鼠的海马神经元,培养后12 d,分为对照组、氧糖剥夺(OGD)组、OGD+亚低温组.37℃或亚低温(33℃)条件下培养OGD神经元24h.采用Western blot法检测SUMO-1和SUMO-2/3的表达水平,ELISA法检测乳酸脱氢酶(LDH)含量,原位凋亡法检测凋亡细胞数量.取SD大鼠36只,按完全随机化原则分为假手术组、大脑中动脉阻塞(MCAO)组及MCAO+亚低温组,每组12只.线栓法建立MCAO模型,比较3组模型制作后第1、7、14及21天的神经功能缺损评分;免疫荧光法检测海马区神经元中SUMO-1和SUMO-2/3的表达定位.结果 (1)对照组、OGD组及OGD+亚低温组的LDH分别为(9.85±2.47) pg/L、(586.29±51.56) μg/L、(317.54 ±42.33) pg/L,细胞凋亡率为(0.27±0.05)％、(29.25 ±6.07)％、(17.44±4.59)％,P值均＜ 0.01.3组间游离及共轭SUMO-1蛋白表达水平差异均无统计学意义;与OGD组比较,OGD+亚低温组游离SUMO-2/3的表达水平降低(P＜0.05),共轭SUMO-2/3表达水平升高(P＜0.01),且均高于对照组(P＜0.01).(2)第7、14天MCAO+亚低温组神经功能缺损评分均低于MCAO组(P＜0.05),至第21天两组差异无统计学意义.MCAO组脑梗死面积为(34.51±7.44) mm2,MCAO+亚低温组为(23.67-±5.49) mm2 (P ＜0.05);假手术组、MCAO组及MCAO+亚低温组SUMO-1的表达相近;与假手术组比较,MCAO组细胞核的SUMO-2/3表达明显增高,MCAO+亚低温组增高趋势更明显.结论 大鼠亚低温神经保护机制可能与提高脑缺血后SUMO-2/3与靶蛋白的结合能力有关.
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FAT10双甘酸突变体对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响
目的 探讨FAT10的碳末端双甘酸缺失突变体对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响.方法 收集宫颈原位癌组织标本和正常宫颈组织标本各5例,Western blotting法检测组织中FAT10蛋白的表达.采用定点突变技术构建pcDNA3.0-flag-FAT 10ΔGG质粒,分别将野生型FAT 10、FAT10ΔGG及空载体(阴性对照)瞬时转染至HeLa细胞中,以野生型Hela细胞作为空白对照组,采用Western blotting法检测转染效率,CCK-8法检测细胞增殖情况.转染24h后,各组细胞经顺铂诱导凋亡,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 FAT10蛋白在宫颈癌组织中的表达明显高于正常组织.过表达野生型FAT10对宫颈癌细胞的增殖有明显促进作用,但FAT10发生双甘酸突变之后,该作用受到明显抑制.流式细胞仪检测结果显示:与空白对照组(22.7％±4.2％)和阴性对照组(24.1％±3.8％)相比,过表达野生型FAT10组的细胞凋亡率(10.9％±2.0％)明显降低(P＜0.05),而FAT10ΔGG组的细胞凋亡率(25.7％±5.1％)无明显变化(P＞0.05).结论 FAT10可通过其碳末端双甘酸结构促进肿瘤细胞增殖,减少凋亡,从而促进肿瘤的发生发展.
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SCF泛素化途径对c-Myc蛋白降解的调节作用
泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway, UPP)是细胞内降解蛋白质的重要途径,与细胞多种生理功能调节密切相关.本文主要论述了SCF(Skp-cullin-F-box protein)泛素化途径及对原癌基因c-myc产物的降解调控作用.
关键词： 泛素类 泛素-蛋白酶体途径 原癌基因蛋白质类c-Myc 蛋白降解 SCF -
Ufd1基因沉默逆转SW1116/HCPT细胞株对羟基喜树碱耐药的研究
背景:泛素融合降解1样蛋白(Ufd1)在蛋白质逆向转运中发挥一定作用.前期研究发现羟基喜树碱(HCPT)耐药人结肠癌细胞株SW1116/HCPT Ufd1表达增高.目的:探讨Ufd1基因沉默在逆转SW1116/-HCPT细胞株对HCPT耐药性中的作用.方法:干扰组SW1116/HCPT细胞转染Ufd1特异性siRNA以沉默Ufd1基因,对照组转染非特异性siRNA.体外药物敏感性试验检测细胞对HCPT的敏感性,流式细胞术检测细胞周期,比色法测定caspase-3活性,蛋白质印迹法检测p-JNK、p53表达情况和细胞内泛素化蛋白贮留情况.结果:干扰组SW1116/HCPT细胞对HCPT的敏感性显著高于对照组(P＜0.05).经HCPT作用,干扰组和对照组细胞均出现S期阻滞、caspase-3活性增高和p-JNK、p53、泛素表达增加,干扰组更为明显.结论:以RNA干扰技术沉默Ufd1基因可逆转SW1116/HCPT细胞株对HCPT的耐药性,推测该作用可能与活化JNK信号通路、上调p53表达以及致细胞内泛素化蛋白贮留而破坏细胞内蛋白代谢的协调性有关.
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去泛素化酶在皮肤病的研究进展
去泛素化酶家族种类繁多,分布于人体多种器官及组织,是泛素-蛋白酶体途径的重要组成部分,精细调控真核细胞生物细胞内蛋白的降解.A20、CYLD、泛素特异性加工酶7等去泛素化酶通过与外异蛋白受体、Fas相关的死亡区蛋白、B细胞淋巴因子-3、核因子-κB抑制蛋白激酶等因子相互作用,可参与银屑病、皮肤基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、皮肤附属器肿瘤、Kaposi肉瘤以及恶性黑素瘤等皮肤疾病的发生发展.探讨去泛素化酶作用机制,有助于为炎症及肿瘤性皮肤病提供新的治疗靶点.
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泛素特异性肽酶22在胃癌中的表达及其临床意义
目的 探讨泛素特异性肽酶22 (USP22)在胃癌组织中的表达及意义.方法 采用免疫组织化学SABC法检测100例胃癌、46例癌旁正常组织中USP22的表达情况.结果 USP22在胃癌组织中阳性率为80.0％,明显高于正常组织(P＜0.05).胃癌病理分期越高,USP22蛋白阳性表达率越高(P＜0.05).胃癌分化程度越低,USP22蛋白阳性表达率越高(P＜0.05).结论 USP22是胃癌潜在的分子标记物.
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类泛素分子FAT10上调核因子Kappa B表达与糖尿病肾病关系的研究进展
糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是糖尿病主要的微血管并发症,也是糖尿病主要死亡原因之一.核因子Kappa B(NF-κB)是一种广泛存在于真核细胞内的转录因子,可通过调节转化生长因子β1(TGF-β1)表达、促进细胞凋亡等途径在进展期DN病程中占据重要地位.人类白细胞抗原F介导转录因子10(human leukocyte antigen F-associated transcript 10,FAT 10)是类泛素分子家族(ULMs)成员,具有与底物蛋白共价结合,并介导底物蛋白快速而不可逆地被蛋白酶体靶向降解的特性.研究表明,FAT10在受细胞因子等刺激后,可促进NF-κB通路抑制蛋白IκB-α迅速降解,上调NF-κB表达,而后者可以进一步促进DN发展.本文将就FAT10、NF-κB及DN三者之间关系的研究进展作一综述.
