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双苯氟嗪的体内外致突变性评价
双苯氟嗪(Dipfluzine,Dip)系由河北医科大学药学院研制并合成的桂利嗪类钙拮抗剂.先期的实验表明,Dip可以选择性地扩张椎动脉、基底动脉及冠状动脉,且作用强于桂利嗪;也有增加脑血流量,改善脑缺血、缺氧,及抗血小板凝集和血栓形成的作用,因此,Dip很可能是治疗心脑血管疾病且极具临床开发价值的新型钙拮抗剂.目前,关于Dip的特殊毒性尚未见报道.本实验对Dip的体内体外致突变毒性进行了研究,以便为进一步研究此药提供遗传学资料.
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双苯氟嗪在大鼠体内的代谢途径
目的研究双苯氟嗪在大鼠体内的代谢途径.方法大鼠ig双苯氟嗪,LC/DAD/MS法分离、鉴定尿中代谢产物.结果在大鼠尿中有1-(4-氟苯基)-4-哌嗪基丁酮及其葡糖醛酸结合物、4-羟基二苯甲酮及其葡糖醛酸结合物、4-氟-γ-羟基苯丁酸及其葡糖醛酸和硫酸结合物、二苯甲醇及其葡糖醛酸结合物和双苯氟嗪,二苯甲酮.结论双苯氟嗪在大鼠体内主要经哌嗪环1-和4-氮脱烷基代谢,部分代谢物再与葡糖醛酸和/或硫酸结合.
关键词： 双苯氟嗪 代谢 液相/二级管阵列/质谱联用仪 -
双苯氟嗪抗大鼠全脑缺血再灌注所致海马CA1区神经元损伤的作用机制
目的研究双苯氟嗪抗大鼠全脑缺血再灌注损伤的作用机制.方法大鼠全脑缺血15 min再灌注3 d,再灌注开始后给予双苯氟嗪(20,40和80 mg·kg-1,ig).免疫组织化学方法观察Fas及Fas配体的分子定位,Western blotting和RT-PCR方法检测Fas,Fas配体,caspase 10 p20,caspase 8,I-κB-α和p-I-κB-α蛋白及mRNA表达.结果双苯氟嗪明显降低海马CA1区免疫阳性细胞数量及Fas,Fas配体,caspase 10 p20蛋白表达(P<0.01),且呈剂量依赖性(20和40 mg·kg-1组,r=0.92,P<0.01);显著降低Fas及Fas配体mRNA表达(P<0.01);caspase 8和I-κB-α蛋白表达在给药前后无显著变化(P>0.05);未能检测出p-I-κB-α蛋白表达.结论双苯氟嗪通过抑制CD95分子启动的死亡信号转导通路发挥其抗脑缺血再灌注损伤作用;这一作用与转录因子NF-κB无关.
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双苯氟嗪对大鼠局灶性脑缺血再灌注后E-选择素、P-选择素和细胞间黏附分子-1表达的影响
目的研究双苯氟嗪对大鼠脑缺血再灌注后E-选择素(E-selectin)、P-选择素(P-selectin)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达及中性粒细胞浸润的影响.方法采用Zea-Longa线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型.采用HE染色、免疫组化、流式细胞术以及生化的方法,观察双苯氟嗪对大鼠缺血再灌注后脑组织形态学、P-选择素、E-选择素和ICAM-1表达以及髓过氧化酶(MPO)活性的影响.结果双苯氟嗪可改善缺血再灌注后脑损伤的形态学表现;降低P-选择素、E-选择素和ICAM-1的表达以及MPO的活性.结论双苯氟嗪减轻缺血再灌注后炎症反应,对缺血再灌注性脑损伤具有保护作用.
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双苯氟嗪对异丙肾上腺素诱发人心房肌纤维迟后除极和触发活动的影响
目的研究双苯氟嗪(Dip)对异丙肾上腺素诱发人心房肌纤维迟后除极(DADs)和触发活动(TA)的影响.方法应用异丙肾上腺素诱发稳定且可重复的迟后除极和触发活动.用细胞内玻璃微电极技术记录DADs和TA诸参数.结果预先应用Dip(3μmol·L-1)或乙醇溶剂(3 mL·L-1)对异丙肾上腺素引起的DADs和TA无明显影响;Dip(10μmol·L-1)使DADs的幅度从(13.3±2.3)mV降低到(4.0±1.0)mV,但对DADs和TA的发生率无显著影响;Dip(30 μmol·L-1)则能抑制DADs和TA的发生.结论Dip对异丙肾上腺素诱发的人心房肌纤维DADs和TA有抑制作用,这可能与其抑制L-型钙通道和/或肌浆网钙释放从而减轻细胞内钙超载有关,并可能由此产生抗心律失常作用.
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双苯氟嗪抑制FasL分子表达的基因转录机制
研究双苯氟嗪对Fas配体分子表达抑制的基因转录机制的影响.通过四血管阻断法建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型, 所有实验动物缺血15 min, 再灌注72 h.实验大鼠随机分为4组: 假手术组、缺血再灌注组、双苯氟嗪组及环孢素A组.药物干预于再灌注后2 h内给药, 每日1次, 连续3 d.双苯氟嗪按20 mg·kg-1灌胃给药, 环孢素A 10 mg·kg-1腹腔注射.应用蛋白质印迹和电泳迁移率改变分析技术检测海马CA I区Fas配体(FasL)、转录因子NFATc、 I-κB-α、 phospho-I-κB-α蛋白表达以及测定FasL分子启动子远端及FasL分子启动子近端NFAT FasL-DNA结合活性.结果表明, 双苯氟嗪明显降低FasL、 NFATc的蛋白表达并显著减少FasL分子启动子远端及FasL分子启动子近端NFAT结合位点的NFAT-DNA结合活性.各组之间I-κB-α蛋白表达无显著区别.未观察到各组phospho-I-κB-α蛋白表达.由此可见, 双苯氟嗪通过降低转录因子NFATc的FasL分子的基因转录功能, 从而抑制FasL分子的基因表达.
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双苯氟嗪对实验性心律失常及心室肌细胞内钙浓度的影响
目的 观察双苯氟嗪对实验性心律失常的作用及其可能机制.方法 采用静脉灌流毒毛花苷G诱发豚鼠心律失常,心肌缺血再灌注诱发大鼠心律失常,观察双苯氟嗪的抗心律失常作用;利用激光共聚焦扫描显微镜观察双苯氟嗪对心室肌细胞内游离钙子浓度([Ca2+]I)的影响.结果 双苯氟嗪20 mg·kg-1能提高毒毛花苷G诱发豚鼠室性早搏、室速、室颤和死亡的剂量;10 mg·kg-1提高诱发室性早搏的剂量.双苯氟嗪20 mg·kg-1减少心肌缺血再灌注诱发的大鼠室速、室颤发生率及动物死亡率;10 mg·kg-1减少室颤发生率及动物死亡率.双苯氟嗪预先给药可降低豚鼠正常心室肌细胞[Ca2+]I,并抑制细胞外高钙诱发的细胞[Ca2+]I升高;在细胞外高钙已诱发细胞[Ca2+]I升高的条件下,仍可降低[Ca2+]I升高的程度.结论 双苯氟嗪具有抗实验性心律失常作用,这种作用可能与其保持细胞内钙稳态有关.
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双苯氟嗪对豚鼠心室肌细胞膜钠电流的影响
目的 观察双苯氟嗪对豚鼠心室肌细胞膜钠电流的影响.方法 用酶解方法分离豚鼠心室肌细胞,全细胞膜片钳技术记录钠电流.结果 将细胞钳制在-80 mV,给(-80～+50) mV,50 ms和步阶10 mV的去极化脉冲,记录到的电流被河豚毒素10 μmol·L-1完全抑制.在该刺激条件下,该电流大激活电压在-20 mV左右,翻转电压在+30 mV左右,提示该电流为钠电流.双苯氟嗪可以浓度依赖性地抑制钠电流.双苯氟嗪对钠电流的抑制作用在冲洗后可部分恢复,表明其对钠通道的抑制作用具有可逆性. 双苯氟嗪可使钠电流I-V曲线上移,但对钠电流的电压依赖性特征、大激活电压和翻转电压无明显影响.在双苯氟嗪40 μmol·L-1存在下,大激活电压下的峰值电流下降约46%;双苯氟嗪可明显使钠电流稳态失活曲线左移,但不影响曲线的斜率因子.双苯氟嗪40 μmol·L-1可使钠电流半数失活电压从(-73.0±4.6) mV减少到(-82.8±7.2) mV.但双苯氟嗪对钠电流稳态激活无明显影响,在双苯氟嗪40 μmol·L-1存在下,半数激活电压(-33.7±3.6 )mV和斜率因子(5.6±2.4) mV与对照组激活电压(-34.9±5.1) mV和斜率因子(6.0±4.8)mV相比无显著性差异.双苯氟嗪可以使钠电流从失活状态下恢复明显减慢,双苯氟嗪40 μmol·L-1可使恢复时间常数延长[(79±28) vs (36±11) ms].结论 双苯氟嗪可以浓度依赖性、使用依赖性和频率依赖性地抑制心肌钠电流,并且主要作用于钠电流的失活状态.
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双苯氟嗪对表达于爪蟾卵母细胞上的KCNQ1/KCNE1钾通道电流的影响
目的 研究双苯氟嗪对KCNQ1/KCNE1钾通道电流的影响,以探讨其抗心律失常作用的可能机制.方法 采用双电极电压钳技术,观察双苯氟嗪对表达于非洲爪蟾卵母细胞上的KCNQ1/KCNE1钾通道电流的影响.结果 双苯氟嗪(0.3～30 μmol·L-1)浓度依赖性地抑制KCNQ1/KCNE1电流,IC50为(8.9±1.8)μmol·L-1.在-10～90 mV范围内双苯氟嗪对KCNQ1/KCNE1电流的抑制作用具有电压依赖性.双苯氟嗪10 μmol·L-1使KCNQ1/KCNE1电流的半数激活电压右移3 mV,增大激活时间常数,减慢KCNQ1/KCNE1电流的激活;降低慢去活时间常数和快去活时间常数,加速KCNQ1/KCNE1电流的去活.结论 双苯氟嗪降低KCNQ1/KCNE1钾通道电流并改变其动力学特征, 提示双苯氟嗪抗心律失常的作用可能与其有关.
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双苯氟嗪对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用
目的评价双苯氟嗪(Dip)和氟桂利嗪(Flu)在大鼠局灶性脑缺血再灌注模型中的神经保护作用.方法 将内皮素-1(ET-1)灌注到大脑中动脉附近制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,并于灌注ET-1后30min和4.5h腹腔注射溶剂、Dip 10,20和40mg·kg-1和Flu 20mg·kg-1,采用氢清除法监测灌注ET-1前后、纹状体血流变化,并对缺血后24h脑梗塞面积、血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的变化进行了测定.结果Dip20和40mg·kg-1于灌注ET-1后70和100min明显改善缺血侧纹状体血流量下降;Flu20mg·kg-1的作用较弱,仅于灌注ET-1后100min明显改善缺血侧纹状体血流量;Dip可以剂量依赖性的降低脑梗塞面积(r=0.9797,P＜0.01),同剂量Flu可产生相似的作用;各剂量组Dip和Flu均可增加血清中SOD活性、降低MDA含量.结论Dip和Flu对脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用,Dip改善脑血流的作用略强于Flu其保护作用的机制与改善脑血流的搞氧化作用有关.
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双苯氟嗪对大鼠脑缺血再灌注诱导的海马神经元凋亡的影响
目的观察双苯氟嗪(dipfluzine,Dip)对大鼠脑缺血再灌注损伤的抗凋亡作用.方法采用改良的Pulsinelli四动脉结扎法制备大鼠全脑缺血15 min再灌注模型.将大鼠分为两大组,第一大组分为假手术组,缺血15 min再灌注4,8,24及72 h组.第二大组将大鼠分为假手术组、缺血再灌24 h组、溶剂对照组、Dip(0.5,1和2 mg·kg-1)治疗组及氟桂利嗪(flunarizine,Flu)1mg·kg-1阳性对照组.于缺血15 min再灌注开始时尾静脉注射给药.各组均以流式细胞仪测定海马区神经元凋亡率、caspase-3表达量,以及HE染色计数海马CA1区正常神经元密度.结果缺血后,随着再灌时间的延长,海马神经元凋亡率和caspase-3表达量均显著增高,海马CA1区正常神经元密度明显下降,并均于再灌后24h达显著性改变.给予3个剂量的Dip和Flu均可明显降低海马神经元凋亡率和caspase-3表达量,而Dip 1,2 mg·kg-1和Flu可抑制正常神经元的丢失.结论 Dip可明显减轻缺血再灌注损伤,并有明显的抗凋亡作用,其作用机制可能与其抑制钙超载,从而抑制caspase-3的激活有关.
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双苯氟嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤后胞浆[Ca2+]i的影响
目的研究双苯氟嗪(Dip)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑神经细胞胞浆Ca2+浓度([Ca2+]i)变化的影响.方法 将400 pmol的内皮素-1(ET-1)灌注到大鼠大脑中动脉附近制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,以Fura-2/AM作为钙荧光指示剂,双波长荧光分光光度法检测灌注ET-1后不同时间大鼠大脑皮层和纹状体神经细胞胞浆[Ca2+]i的变化及Dip对灌注ET-1后4 h胞浆[Ca2+]i变化的影响,并采用TFC染色法观察了Dip对灌注ET-1后24h脑梗死范围的影响.结果灌注400 pmolET-1诱发大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后,大鼠大脑皮层和纹状体神经细胞胞浆[Ca2+]i明显升高,并于灌注ET-1后4 h达峰值,随着再灌注时间的延长,胞浆[Ca2+]i逐渐降低;Dip 20,40 mg·kg-1可以明显降低灌注ET-1后4 h大脑皮层和纹状体神经细胞胞浆[Ca2+]i的升高(P＜0.01),Dip 10 mg·kg-1组虽表现出一定的降低胞浆[Ca2+]i的作用,但与溶剂组比较,差异无显著性(P＞0.05);对脑梗死范围的测定结果显示,Dip可以缩小脑梗死范围,其作用呈现明显的剂量依赖关系(r=0.979 7,P＜0.01).结论 Dip对抗脑缺血再灌注损伤后胞浆[Ca2+]i升高可能是其产生神经保护作用的重要机制.
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双苯氟嗪对大鼠永久性局灶性脑缺血损伤的保护作用
目的观察双苯氟嗪(dipfluzine,Dip)对大鼠永久性局灶性脑缺血损伤的保护作用.方法采用线栓法建立雌性大鼠永久性局灶性脑缺血损伤模型.将雌性SD大鼠随机分为假手术组、缺血对照组、Dip(20,40和80 mg·kg-1)治疗组、氟桂利嗪40 mg·kg-1治疗组.术后1.5 h ig给药.术后6 h,采用盲法进行神经功能评分;测定脑梗死体积(Ⅳ%)及观察脑细胞病理组织学改变.结果缺血对照组神经功能评分为(7.7±0.8),Dip 20、40及80 mg·kg-1治疗组分别为(6.8±0.8)(P<0.05);(6.0±0.6)(P<0.01)和(5.5±0.8)(P<0.01);Dip 40和80 mg·kg-1组Ⅳ%与缺血对照组相比分别低39%和62%.且Dip上述作用均呈剂量依赖性.病理组织学观察结果表明,Dip 40和80 mg·kg-1可以减轻脑损伤.结论 Dip对大鼠永久性局灶性脑缺血损伤具有保护作用.
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双苯氟嗪抗大鼠全脑缺血再灌注所致海马 CA1区神经元凋亡
目的研究L-型钙通道拮抗剂双苯氟嗪在大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区神经元中的抗凋亡作用及与CD95(Fas)分子启动的死亡信号转导通路之间的关系.方法四血管阻断法制备全脑缺血再灌注损伤模型(缺血15 min,再灌注3 d),双苯氟嗪(20,40和80 mg·kg-1)每日灌胃给药1次.激光扫描共聚焦显微镜(Confocal)和HE染色观察海马CA1区神经元细胞形态学改变,流式细胞仪(FCM)分析海马DNA含量变化;Western-blotting和RT-PCR方法检测CD95(Fas)分子启动的死亡信号转导通路相关蛋白Fas,FasL和Caspase3蛋白及mRNA表达变化.结果全脑缺血再灌注后海马CA1区神经元呈现典型凋亡细胞形态学改变,凋亡细胞百分率明显上升(P＜0.01).双苯氟嗪明显改善海马CA1区神经元形态,显著降低凋亡细胞百分率(P＜0.01).Western hlotting及RT-PCR结果显示,双苯氟嗪显著降低CD95(Fas)分子相关蛋白Fas、FasL和Caspase3在蛋白及核酸水平的表达.结论双苯氟嗪对缺血性脑损伤的保护作用可能通过抑制C1D95(Fas)分子启动的死亡信号转导通路,从而发挥其抗脑缺血再灌注损伤作用.
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双苯氟嗪稳定性的影响因素研究
目的:探讨双苯氟嗪的固有稳定性,了解影响其稳定性的环境因素.方法:双苯氟嗪在高温、高湿、强光条件下放置0、5、10 d,采用HPLC、滴定等方法考察性状、熔点、含量、有关物质、风化性或吸湿性随时间的变化情况.结果:双苯氟嗪各项质量考察指标变化不大.结论:试验结果表明双苯氟嗪性质比较稳定,但对光、热稍显敏感,包装、贮藏应注意遮光、密闭.
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双苯氟嗪小鼠急性毒性及体内致突变毒性评价
目的考察双苯氟嗪(dipfluzine)对小鼠的急性毒性及体内致突变毒性.方法小鼠灌胃给予双苯氟嗪,计算LD50;微核实验设6组:空白对照组(水)、溶剂对照组(5 g/L羧甲基纤维素钠)、阳性对照组(环磷酰胺)、和双苯氟嗪3个剂量组(2.8、1.4和0.7 g/kg),于给药24 h后取骨髓,计数各组骨髓细胞微核率;骨髓细胞染色体畸变实验:小鼠给药与分组同微核试验,分别于给药12、24、48 h后取骨髓进行染色体畸变分析.结果小鼠灌胃给予双苯氟嗪LD50为(5 681士650)mg/kg;剂量分别为2.8、1.4和0.7 g/kg时,微核实验和骨髓细胞染色体畸变实验中,各给药组骨髓细胞微核率和染色体畸变率与空白对照组比较均无显著性差异(P均＞0.05),也无剂量反应关系,实验结果均为阴性.结论双苯氟嗪在小鼠体内无致突变作用.
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双苯氟嗪对铅致海马神经元损伤的保护作用
目的 观察双苯氟嗪(Dipfluzine,Dip)对铅致原代培养海马神经元损伤的保护作用,并探讨其作用机制.方法 以原代培养的海马神经元作为研究对象,用醋酸铅造海马神经元损伤模型,通过测定细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)泄漏率和胞内游离钙浓度([Ca2+]i),观察Dip对铅致原代培养海马神经元损伤的保护作用.结果 Dip 1.0和10μmol/L可显著提高铅损伤海马神经元存活率,降低LDH泄漏率,对铅诱导的海马神经元[Ca2+]i升高有明显的抑制作用(P＜0.01);Dip 0.1μmol/L亦可抑制铅诱导的海马神经元[Ca2+]i升高(P＜0.05).结论 Dip对铅致原代培养海马神经元损伤具有保护作用,其机制可能与其抑制铅诱导的胞内钙超载有关.
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双苯氟嗪对老龄大鼠学习记忆的改善作用及其机制
目的 观察双苯氟嗪对老龄大鼠学习记忆能力的影响并分析其机制.方法 选用雄性21月龄大鼠,灌胃给予双苯氟嗪5.0 mg/kg 90 d后,跳台仪测定大鼠学习记忆能力,HE染色观察脑组织形态学变化,免疫组化法测定脑组织胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)表达,生化分析法测定大鼠血清中SOD和MDA.结果 双苯氟嗪可缩短老龄大鼠的反应时间及受电击时间,减少错误次数,延长潜伏期,可显著增强老龄大鼠血清中SOD活力,降低MDA的含量,可以保护老龄大鼠脑损伤性改变,维持海马锥体细胞完整,并可提高老龄大鼠脑组织中ChAT表达.结论 双苯氟嗪可改善老龄大鼠的学习记忆能力,这种作用可能与其提高机体抗氧化能力及脑内胆碱能神经功能有关.
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双苯氟嗪对β淀粉样肽25～35致海马神经元损伤的保护作用
目的 应用原代培养胎鼠海马神经元,观察双苯氟嗪对β-淀粉样肽25～35(Aβ25～35)诱导神经元损伤的保护作用.方法 原代培养的海马神经元分别与1.0 μmol/L β25～35、双苯氟嗪(0.1、1、10 μmol/L)孵育24 h后,检测细胞内漏出液的谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量、超氧化酶歧化酶(SOD)活性及细胞存活率的变化.结果 海马神经元与β25～35共同孵育24 h后,细胞存活率显著下降、GSH-Px及SOD活性降低、MDA含量升高;海马神经元与不同浓度双苯氟嗪共同孵育24 h后,细胞存活率显著升高、GSH-Px及SOD活性升高、MDA含量降低.结论 双苯氟嗪可对抗β25～35所造成的神经元损伤,该作用可能与通过清除氧自由基、提高神经元的抗氧化能力有关.
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Aβ25～35对海马神经元的损伤及双苯氟嗪的保护作用
目的 观察Aβ25～35对原代培养的胎鼠海马神经元的损伤作用以及双苯氟嗪的保护作用.方法 将老化的Aβ25～35加入到培养7 d的海马神经细胞中,采用乳酸脱氢酶试剂盒测定海马神经元乳酸脱氢酶释放度(LDH%),观察神经元的损伤情况.选择1.0 μmol/L Aβ25～35制备海马神经元损伤模型,乳酸脱氢酶试剂盒测定海马神经元LDH%,激光扫描共聚焦显微镜测定钙荧光强度,观察双苯氟嗪对神经元损伤的保护作用.结果 Aβ25～35 0.1、1.0及10.0 μmol/L 均能明显升高海马神经元LDH%,造成神经元损伤.给予1.0和10.0 μmol/L双苯氟嗪均显著降低1.0 μmol/L Aβ25～35升高的LDH%,与空白对照组相比,模型组细胞内钙荧光强度显著升高,而双苯氟嗪(1.0和10.0 μmol/L)处理后明显降低.结论 双苯氟嗪对Aβ25～35造成的海马神经元损伤有保护作用,其机制可能与抑制钙超载有关.
