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大鼠β-防御素rBD-2的分子克隆及其在皮肤组织的诱导表达
从大鼠皮肤提取总RNA, 以P1 5′→3′TTCAGTCATGAGGATCCATTAC和P2 5′→3′ GGTTCTTGGTCTTTTTATCTAC引物,采用RT-PCR技术扩增得到一cDNA片段,经核苷酸序列测定,并根据其推导的氨基酸序列与人β-防御素-2和大鼠β-防御素-1进行同源性比较,结果显示,该cDNA片段编码的氨基酸序列具高度同源性(其成熟肽与hBD-2的同一性为50%,相似性为32%),均含6个典型的半胱氨酸,这表明所克隆的cDNA为大鼠β-防御素-2亚类,因此命名为rBD-2.大鼠β-防御素-2基因在大肠杆菌感染性损伤皮肤组织中的表达明显增强,与人hBD-2的表达相似,能够被诱导表达.以上结果提示,β-防御素-2可能是皮肤组织对感染性损伤的防御反应所产生的重要免疫介质.
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鸡IL-18在毕赤酵母中的表达与活性分析
目的:在毕赤酵母中表达鸡白介素18,并鉴定其活性.方法:应用PCR技术从重组质粒pMD18-T-ChIL-18中扩增出鸡IL-18成熟肽基因,亚克隆于毕赤酵母表达载体pPICZαA上,构建重组质粒pPICZαA-ChIL-18.经酶切、PCR和测序鉴定正确后,电转化入毕赤酵母菌X-33,筛选多拷贝单克隆进行诱导表达.表达产物纯化后用Western blot、ELISA和淋巴细胞转化试验分析其生物学活性.结果:重组菌正确表达了具有免疫原性的鸡IL-18,经分析该rchIL-18具有诱导淋巴细胞分泌γ干扰素和刺激淋巴细胞增殖的活性.结论:成功的在毕赤酵母中表达了具有生物活性的鸡IL-18.
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人前蛋白转化酶枯草溶菌素9的cDNA克隆和表达及多克隆抗体的制备
目的 构建人前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)的原核表达载体并诱导其表达,制备其蛋白的多克隆抗体.方法 聚合酶链式反应扩增人工合成的pcsk9 cDNA序列；扩增产物经TA克隆、双酶切、连接,构建pET-28b-pcsk9表达载体；将重组质粒转化人大肠杆菌表达菌BL21(DE3)的感受态细胞中,诱导表达；用纯化检测过的目的蛋白免疫新西兰兔,后采集全血收集血清,获得多克隆抗体,并对该抗体进行免疫印迹及效价测定.结果 PET-28b-pcsk9原核表达载体构建成功,用诱导表达的目的蛋白免疫动物,收集血清获得多克隆抗体.对多克隆抗体进行纯化,免疫印迹检测结果证明自制多克隆抗体特异性良好,效价测定为1∶13 200.结论 成功构建了pcsk9原核表达载体pET-28b-pcsk9,且获得了其蛋白的多克隆抗体.
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HCC特异性结合的scFv-AP融合蛋白的构建与表达
目的: 构建与肝癌细胞特异性结合的单链抗体-AP融合蛋白,并诱导表达.方法: 提取从大型人源噬菌体抗体库中筛选的含有与HCC特异性结合的scFv-10基因的质粒,用Sfi I、 Not I分别酶切, 连接至经同样双酶切后的原核分泌型表达载体pDAP2上, 转化和筛选后, 阳性细菌经IPTG诱导表达, 细胞ELISA鉴定融合蛋白活性.结果: 重组质粒经PCR扩增, Eco 91Ⅰ单酶切及Eco 91Ⅰ/Not I双酶切鉴定, 证明scFv-10基因已插入到原核分泌型表达载体pDAP2上.表达产物的定位分析表明融合蛋白主要分泌性表达到周质腔,细胞ELISA证明表达产物有与HCC结合的活性.结论: 成功地构建并表达了与HCC特异性结合的单链抗体-AP融合蛋白,为其应用奠定了基础.
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诱导表达人活性型颗粒酶B的Hela细胞系的建立
目的:构建人颗粒酶B基因的可诱导表达载体,并将其在Hela细胞中诱导表达.方法:用PCR法获取人活性型颗粒酶B基因序列,克隆入pIND诱导表达载体中.将其与辅助质粒pVgRXR通过脂质体法共转染Hela细胞后,用G418和zeocin筛选建系.通过免疫细胞化学染色法,确定蜕皮激素A佳的诱导浓度及诱导时间,并通过MTT比色法检测及细胞骨架染色等方法观察,表达的活性型颗粒酶B对Hela细胞形态和生长的影响.结果:获得可诱导表达人活性型颗粒酶B基因的Hela细胞系.免疫细胞化学染色表明,30 μmol/L蜕皮激素诱导5 d时目的蛋白表达强,同时观察到Hela细胞的形态发生变化,出现多核大细胞及固缩小细胞,并且细胞生长受到抑制.骨架分析进一步显示,多核大细胞的骨架发生异常.结论:活性型颗粒酶B的可诱导表达系统的建立,为进一步研究颗粒酶B的生物学效应功能奠定了基础.
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变形链球菌SBR基因表达载体的构建和表达
目的:构建可用于大肠杆菌表达系统的含变形链球菌唾液结合区段(SBR)基因的表达载体.方法:采用定向克隆方法将变形链球菌唾液结合区段(SBR)基因插入表达载体pcMVT7,构建重组原核表达质粒pcMVT7-SBR,转化大肠杆菌JM109(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化目的蛋白.结果:经酶切鉴定及DNA序列测定,重组质粒pcMVT7-SBR序列及阅读框架正确,亲和层析纯化得到SBR融合蛋白.结论:SBR表达载体构建成功,为防龋疫苗的动物实验研究奠定基础.
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强力霉素调控的真核表达体系ALC-pTet-on Advanced成釉细胞株的建立
目的:建立可受强力霉素调控的高表达外源基因的真核表达体系ALC-pTet-on Advanced细胞株,用于基因功能的研究.方法:将质粒pTet-on Advanced转染至成釉细胞系(ALC),用1 000μg/mL的G418筛选抗性克隆.用RT-PCR进行DNA的整合鉴定,并瞬时转染荧光素报告基因(pTRE-Tight-Luc)对pTet-on Advanced阳性克隆株的功能进行鉴定.结果:G418压力筛选后,获得了13个细胞克隆株,RT-PCR检测均表达反义四环素转录激活子(rtTA Advanced),PCR产物测序结果与pTet-on Advanced基因序列一致,表明pTet-on Advanced基因片段已整合进小鼠成釉细胞基因组DNA,荧光素报告基因功能鉴定获得1株诱导表达倍率为22.1的克隆株,且pTet-on Advanced基因阳性的成釉细胞株的形态和生长度与正常成釉细胞没有明显差异.结论:通过脂质体转染的方法成功地获得1株诱导表达倍率为22.1的高表达成釉细胞株,为进一步研究EMPs在成釉细胞中功能打下了基础.
关键词： 转染 诱导表达 tet-on Advanced系统 成釉细胞系 -
pGEX-e23 (scFv) PE40融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达
目的 在大肠杆菌中表达抗原癌基因c-erbB-2表达产物p185的单 链抗体e23(scFv)/假单孢菌属外毒素活性片 段PE40免疫毒素的融合蛋白，为乳腺癌、胃癌等多种c-erbB-2呈过量表达的恶性肿瘤的免疫治疗奠定基础. 方法 去除克隆在真核表达载体pLNCX中的e23 (scFv) PE40基因5′端编码信号肽的核苷酸序列，并将改建后的融合基因克隆到原核融合表达载体pGEX-4T中表达. 结果 序列测 定 表明. 改建后的抗p185 e23(scFv)/PE40序列正确. 融合基因经IPTG诱导表达4 h后，经SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，在Mr 90 000处出现一条新生蛋白带，表达量约占菌体总蛋白的15%. 结论 成功改建并在原核中表达了抗p185 e23 (scFv)/ PE40融合蛋白.
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人源性羧肽酶A突变体基因的构建及表达
［董轲，郝晓柯，刘新平，张盈华，季少平. 细胞与分子免疫学杂志,2001;17(2):106-04］ 目的从人正常肺组织中提取羧肽酶A基因并进行定点突变. 方法从人正常肺组织中提取RNA，并进行逆转录得到人羧肽酶A(hCPA). 以计算机模拟hCPA的结构，寻找合适的突变位点. 用PCR重叠延伸法，对羧肽酶A进行定点突变,并在大肠杆菌中表达. 结果序列分析表明，所获hCPA的核苷酸序列为1251 bp，编码417个氨基酸. hCPA突变体(mhCPA)基因的1126位核苷酸由G变为A，其余核苷酸序列均未发生变化，相应的此突变体蛋白质的376位核苷酸残基由丙氨酸突变为苏氨酸. 将mhCPA基因在E.coli中诱导表达3 h后,表达量高达30％左右. 结论成功地构建并表达了mhCPA基因，为hCPA在肿瘤的“抗体导向酶-前药疗法”(ADEPT)中的应用奠定了基础.
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人源性羧肽酶A突变体基因的构建及表达
目的 从人正常肺组织中提取羧肽酶A基因并进行定点突变. 方法 从人正常肺组织中提取RNA，并进行逆转录得到人羧肽酶A (hCPA). 以计算机模拟hCPA的结构，寻找合适的突变位点. 用PCR重叠延伸法，对羧肽酶A进行定点突变,并在大肠杆菌中表达. 结果 序列分析表明，所获hCPA的核苷酸序列为1251 bp，编码417个氨基酸. hCPA突变体(mhCPA)基因的1126位核苷酸由G变为A，其余核苷酸序列均未发生变化，相应的此突变体蛋白质的376位核苷酸残基由丙氨酸突变为苏氨酸. 将mhCPA基因在E.coli中诱导表达3 h后,表达量高达30%左右. 结论 成功地构建并表达了mhCPA基因，为hCPA在肿瘤的“ 抗体导向酶-前药疗法 ” (ADEPT)中的应用奠定了基础 .(潘伯荣)
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人颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达导致HeLa细胞凋亡
目的观察诱导表达的颗粒酶B融合蛋白对HeLa细胞形态和生长的作用. 方法用重组PCR法将活性型颗粒酶B基因序列的5'端连接绿脓杆菌外毒素(PE)的部分转位肽编码序列.所获融合蛋白基因克隆入pIND诱导表达载体后,与辅助质粒pVgRXR共转染HeLa细胞,经G418和zeocin筛选建系.间接免疫荧光检测蜕皮激素诱导后目的蛋白的表达,并通过电镜、TUNEL染色、细胞计数等方法观察细胞的形态和生长速度的变化.结果建立了可诱导表达人颗粒酶B融合蛋白基因的HeLa细胞系.蜕皮激素诱导后检测到目的蛋白的表达,同时观察到细胞出现多核巨细胞的异常形态,细胞生长受到抑制.电镜和TUNEL分析表明,颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达使部分细胞呈现凋亡的典型特征.结论颗粒酶B融合蛋白基因的诱导表达导致HeLa细胞凋亡.
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SIK2 cDNA及其截短体原核表达重组体的构建及表达
目的：构建 SIK2 cDNA及其截短体的原核表达重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达。方法分别设计 SIK2及其截短体引物,采用PCR方法分别扩增 SIK2、SIK2-Δ1(280~926)、SIK2-Δ2(400~926)、SIK2-Δ3(1~400)、SIK2-Δ4(700~926)五个 cDNA片段,并将扩增的 cDNA片段插入原核表达载体 pGEX-4T-2,构建 GST标签的重组质粒。将构建好的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导SIK2、SIK2-Δ1、SIK2-Δ2、SIK2-Δ3和SIK2-Δ4五个截短体的原核表达,用考马斯亮蓝染色和Western blot进行鉴定。结果成功构建了SIK2全长及其截短体cDNA的重组质粒,用考马斯亮蓝染色及 Western blot鉴定显示,SIK2全长及其截短体重组质粒均在大肠杆菌中诱导表达。结论在大肠杆菌中成功地诱导表达了 SIK2重组蛋白及其截短体,为进一步研究 SIK2各结构域的功能提供了实验基础。
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内毒素诱导小鼠β-防御素-3(mBD3)基因急性时相表达与肝脏损伤的关系
目的:探讨急性时相反应时β-防御素基因表达与内毒素性肝损伤的关系.方法:小鼠腹腔注射内毒素建立急性时相反应,经Northern-blot检测各组织中mBD3mRNA及表达的剂-效、时-效关系.结果:仅在肝脏组织中检测到mBD3mRNA.内毒素诱导mBD3mRNA在肝脏中的表达存在小诱导剂量.以小诱导剂量(1.5 μg/g)注射后6 h才出现mBD3mRNA的表达,8～10 h达峰值,12 h后表达水平下降.不同剂量内毒素注射后不同时间引起肝脏组织出现不同程度的炎性反应.结论:mBD3基因在肝脏中的急性时相表达与内毒素引起的肝脏组织炎性反应有关.
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慢性扁桃体炎中人β-防御素-3的表达及意义
目的 探讨慢性扁桃体炎中人β-防御素-3 (hBD-3)的表达及意义.方法 应用HE染色,逆转录聚合酶链式反应、SP法、蛋白印迹法观察和检测15例扁桃体炎组和10例对照组组织的病理变化及组织中hBD-3的表达.结果 HE光镜下显示对照组病理特点固有层纤维结缔组织反应性增生为主,非角化复层扁平层内未见炎性细胞浸润;扁桃体炎组淋巴滤泡增生,生发中心扩大,非角化复层扁平层内炎性细胞浸润,蛋白渗出明显.逆转录聚合酶链式反应结果显示扁桃体炎组观察到目的片段;对照组未见hBD-3的特异片段.免疫组织化学光镜下显示扁桃体炎组非角化复层扁平上皮细胞胞浆中hBD-3阳性表达;对照组非角化复层扁平上皮细胞胞浆中呈阴性表达.蛋白印迹法检测结果显示扁桃体炎组可见阳性条带;对照组未见阳性条带.结论 hBD-3在慢性扁桃炎中的表达,表明hBD-3可能在扁桃体和上呼吸道抗感染中发挥重要作用.
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一种转导人原代肝细胞的LV-HBx诱导调控表达系统
目的:建立一种在人原代肝细胞中可诱导调控表达HBx的慢病毒表达系统,以便研究HBx生物学特性及其对人肝细胞功能的影响.方法:采用Tet-on系统构建四环素诱导调控的慢病毒-HBx表达系统,并用流式细胞术对其进行优化以达到较高的表达效率.应用该系统制备LV-HBx和LV-rtTA重组慢病毒共同转导肝癌细胞系HepG2和人原代肝细胞后,再加入强力霉素(Dox)诱导调控HBx表达,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测人原代肝细胞中肿瘤转移相关基因1(MTA1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、转化生长因子β1(TGFB1)、上皮型钙黏附素1(CDH1)、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)mRNA的表达水平.结果:重组慢病毒-HBx表达系统构建成功,LV-HBx和LV-rtTA重组慢病毒用量配比经过优化,采用1:1或2:1转导后可达到较高的表达效率,Dox诱导产生的表达HBx的阳性细胞率分别为67.3%和66.7%.应用该系统将HBx基因转导入肝癌细胞系HepG2和人原代肝细胞后,可用Dox进行诱导调控HBx的高效表达.其中人原代肝细胞中Dox诱导组的HBx表达水平约为对照组(不加Dox诱导)的45倍,经qPCR检测高表达HBx的人原代肝细胞中MTA1、VEGFA、TGFB1 mRNA的表达水平较对照组均显著升高(P均<0.05),而CDH1、IGFBP3 mRNA表达水平显著降低(P均<0.05).结论:成功建立了转导人原代肝细胞的LV-HBx四环素诱导调控表达系统,该系统的建立为研究HBx等乙肝病毒基因对人原代肝细胞的影响打下了基础.
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可条件性诱导PLK1稳定敲降的食管癌细胞株的建立
目的：建立可条件性诱导PLK1-shRNA稳定表达的食管癌细胞株，为深入研究PLK1在食管癌发生发展中的作用及分子机制提供细胞模型。方法：合成PLK1-shRNA寡核苷酸，退火后连接到慢病毒表达载体pLKO-Tet-On并转化至感受态细胞Stbl3，利用菌落PCR和测序分析鉴定阳性重组子。用pLKO-shPLK1-Tet-On重组质粒和包装质粒共转染293T细胞，收集病毒上清，感染食管癌细胞KYSE510，利用嘌呤霉素筛选可诱导PLK1-shRNA稳定表达的细胞株。采用qRT-PCR和Western blot检测强力霉素(Dox)诱导PLK1-shRNA表达的效率。结果：菌落PCR和测序分析结果显示，pLKO-shPLK1-Tet-On重组质粒中PLK1-shRNA的序列及插入位点正确。包装、收获病毒并感染KYSE510细胞后，筛选获得了具有嘌呤霉素抗性的稳定细胞株KYSE510-shPLK1-Tet-On。qRT-PCR和Western blot的检测结果显示，0.1μg/mL Dox即可显著下调KYSE510-shPLK1-Tet-On细胞中PLK1的表达。结论：成功构建了诱导型PLK1-shRNA慢病毒表达载体，并筛选获得了可条件性诱导PLK1稳定敲降的食管癌细胞株，为进一步探讨PLK1异常表达与食管癌发生发展的关系提供了理想的细胞模型。
