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紫杉醇脂质体对宫颈癌HeLa细胞作用的实验研究
目的 探讨注射用紫杉醇脂质体对人宫颈癌细胞系的杀伤作用.方法 以0.01umol/L、0.1umol/L、1umol/L、10umol/L和100umol/L浓度梯度的含注射用紫杉醇脂质体培养基作用于人宫颈癌细胞系HeLa细胞,并设对照(普通培养基,不含药物),通过MTT、显微镜观察细胞形态、流式细胞分析技术检测该药对细胞生长的影响;以Western blot分析细胞外信号调节激酶(ERK)、磷酸化细胞外信号调节激酶(P-ERK)蛋白表达情况.结果 经上述不同浓度紫杉醇脂质体作用48 h后,细胞存活率下降;镜下观察显示部分细胞皱缩变形,崩解坏死,细胞脱壁悬浮;流式细胞结果显示细胞凋亡率逐渐增加,分别为(14.16±4.78)%、(43.68±16.21)%、(63.70±3.74)%、(63.51±2.29)%、(72.84±10.77)%和(74.69±7.52)%,细胞周期各时相中,S期比例减少;Western blot显示HeLa细胞的P-ERK蛋白表达逐渐减弱(0.764 5±0.019 8、0.759 2±0.007 2、0.265 5±0.035 6、0.323 2±0.022 9、0.146 7±0.009 1).结论 紫杉醇脂体可抑制官颈癌HeLa细胞的生长,对HeLa细胞的作用可能通过抑制MAPK信号转导通路达到抑制肿瘤的目的 .
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下调Chk1和Chk2基因促进射线照射后HeLa细胞凋亡
目的 探讨下调Chk1和Chk2基因对HeLa细胞射线照射后细胞周期和凋亡的影响及其作用机制.方法 应用流式细胞仪检测不同剂量60Co照射引起的HeLa细胞周期和凋亡的动力学变化,以激光共聚焦显微镜和Western blot法检测转染Chk1和Chk2正义寡核苷酸(sODN)和反义寡核苷酸(AsODN)对Chk1和Chk2蛋白表达的影响,以AnnexinV-PI法、凋亡细胞的周期特异性检测法及透射电镜观察单独或联合转染Chk1和Chk2反义寡核苷酸对射线照射后HeLa细胞凋亡的影响.结果 不同剂量的60Co照射可引起Hela细胞小同程度的G2/M期阻滞,15 Gy的60Co照射48 h后,G2/M期细胞可达75.53%±3.72%.当细胞周期阻滞解除后,细胞凋亡明显增加.转染Chk1 AsODN组的早期凋亡、晚期凋亡和死亡细胞共有94.42%±4.78%,明显高于转染Chk1 sODN组(44.35%±2.08%,P<0.0001);转染Chk2 AsODN组的凋亡细胞共有93.08%±5.24%,明显高于转染Chk2 sODN组(48.98%±3.35%,P<0.0001);而共转染Chk1和Chk2 AsODN组的凋亡细胞共有94.26%±4.92%,明显高于共转染Chk1和Chk2 sODN组(42.46%±2.56%,P<0.0001);共转染Chk1和Chk2AsODN组与仅转染Chk1 AsODN或Chk2 AsODN组比较,差异无统计学意义(P>0.05).凋亡细胞的周期特异性检测结果显示,转染Chk1和Chk2 sODN引起的凋亡主要来自于G1期细胞,而转染Chk1 AsODN或Chk2 AsODN后,G1期、S期、G2/M期的凋亡细胞均较对应sODN转染组明显增加,尤其共转染Chk1和Chk2 AsODN组更为显著.结论 射线照射激活细胞周期检测点信号传导通路引起细胞自我保护,是临床上产生放疗抵抗的主要原因,而阻断该信号通路的关键激酶Chk1或Chk2,可显著增强细胞的放射敏感性,其机制在于改变了凋亡细胞的周期特异性,凋亡细胞可以来自G1、S、G2/M各周期的细胞.
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利用FISH分析HPV16在Hela细胞中的整合位点
目的 探讨HPV16病毒感染导致子宫颈癌发生的染色体畸变.方法 利用荧光原位杂交(FISH)技术检测HPV16病毒感染导致的Hela细胞中染色体核型的变化.结果 Hela细胞系中存在9号染色体的三体畸变,但3号染色体表现为正常的二倍体核型;Hela细胞中没有发现HPV16的整合位点,但当外源性的HPV16感染Hela细胞后,HPV16病毒DNA整合在3号染色体上;9号和3号染色体变异在子宫颈癌的发生发展中起着重要的作用,而HPV16的感染主要引起3号染色体的变异.结论 HPV16可以引起Hela细胞的3号染色体的畸变,从而导致子宫颈癌的发生.
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β和γ射线照射肿瘤细胞的生物效应比较
目的比较低剂量率β射线和高剂量率γ射线照射诱发肿瘤细胞生物效应特点.方法采用32P β射线和60Co γ射线照射人宫颈癌HeLa细胞系,用台盼蓝排除法和X-gal衰老细胞染色法比较两种照射肿瘤细胞死亡方式的差异.结果32P β射线(0.375 cGy/min)和60Co γ射线(206 cGy/min)照射HeLa细胞后72 h的结果表明,低剂量率β射线抑制细胞增殖为渐进性,使多数的细胞在一个或几个细胞倍增周期后死亡,以增殖性死亡为主;高剂量率γ射线对细胞的抑制作用直接、迅速,细胞坏死比例高,增殖性死亡(衰老)比例低于持续低剂量照射方式.结论不同的辐射方式对细胞的杀伤方式不同,了解其放射生物学机理有助于临床治疗方案的选择.
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胆固醇衍生物阳离子脂质体复合EGFP-IL-1Ra质粒体外转染HELA细胞系的研究
目的 研究胆固醇衍生物阳离子脂质体复合EGFP-IL-1Ra质粒体外转染HELA细胞系的效率,为类风湿性关节炎治疗提供新的选择.方法制备新型胆固醇衍生物脂质体及EGFP-IL-1Ra质粒,两者结合转染HELA细胞系,通过体外凝胶阻滞试验检测阳离子脂质体与质粒DNA的佳配比关系,MTT法检测脂质体细胞毒性,荧光免疫法检测HELA细胞的转染效率.结果实验中所用脂质体的IC50 为650 μg/mL,较对照组有更低的细胞毒性.脂质体/DNA 质量比为50∶1作为适比例,荧光显微镜观测脂质体结合EGFP-IL-1Ra质粒转染 HELA荧光强度高于单纯EGFP-IL-1Ra质粒转染组.结论胆固醇衍生物阳离子脂质体复合EGFP-IL-1Ra质粒可高效的转染HELA细胞系,有望成为类风湿性关节炎治疗的新方法.
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宫颈癌 HeLa 细胞抗顺铂作用的 Notch1 机制研究
目的 利用宫颈癌HeLa细胞系探讨宫颈癌的抗化疗机制. 方法 利用球形成试验( sphere forming assay )和Western blot法检测顺铂对癌症干细胞形成的影响以及 Notch1在HeLa细胞系的表达. 基因沉默试验分析Notch1基因是否在宫颈癌HeLa癌症干细胞中发挥关键作用. 结果 顺铂能促进球结构(意味着癌症干细胞形成)的形成. 5μmol/L顺铂较1μmol/L顺铂能促进更多球结构形成(P<0.05). 10μmol/L顺铂会抑制球结构形成. 5μmol/L顺铂还能提高HeLa中Notch1的表达(P<0.05),而沉默HeLa细胞的Notch1后,HeLa细胞中形成的球数量降低1.7倍(P<0.05). 结论 宫颈癌HeLa细胞系具有抗顺铂治疗的特性,尤其是5μmol/L的顺铂,该抗化疗作用与宫颈癌HeLa细胞中的Notch1表达升高,终促进癌症干细胞自我更新有关.
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siRNA干扰对Hela细胞株VEGF表达的影响
目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)siRNA干扰对宫颈癌Hela细胞株VEGF的影响.方法:设计合成VEGF siRNA 1、2、3号链,体外脂质体介导转染宫颈癌Hela细胞株,半定量RT-PCR及Western blot分析转染效果.结果:转染VEGF siRNA1、2号链后,宫颈癌Hela细胞株VEGFmRNA表达明显下降,但是VEGF蛋白水平下降不明显.结论:VEGF siRNA转染宫颈癌Hela细胞株可下调细胞中VEGFmRNA的表达,不同的siRNA下调mRNA效率不同.作为基因沉默的一个重要工具,siRNA干扰有望成为治疗宫颈癌一种新方法.
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弯齿琵甲粗蛋白诱导Hela细胞凋亡的实验研究
目的 研究弯齿琵甲粗蛋白诱导宫颈癌Hela细胞的凋亡作用及其作用机制.方法采用硫酸铵沉淀法提取弯齿琵甲粗蛋白,分别按7.5、10和15 μg·mL-1三个浓度作用于Hela细胞48h和72h,吖啶橙-EB染色后倒置荧光显微镜下观察细胞的形态变化,DNA琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞DNA断裂情况,Annexin V-FITC/PI双染法定量检测细胞的凋亡情况.结果不同浓度的粗蛋白作用于细胞48h后均出现较明显的细胞凋亡形态,10和15 μg·mL-1两浓度粗蛋白作用于细胞后使DNA片断化,流式细胞术检测显示加入15 μg·mL-1的弯齿琵甲粗蛋白在48h以及72h的凋亡率分别达到了10.95％和28.075％,坏死率也分别达到了2.02％和18.34％.结论弯齿琵甲粗蛋白能够抑制Hela细胞增殖,诱导Hela细胞凋亡,且呈时间剂量依赖关系.
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放射抗拒的宫颈癌细胞端粒酶活性对其放射敏感性影响的研究
目的 通过检测不同剂量照射宫颈癌细胞后生长特性及端粒酶逆转录酶的表达,探讨其与放射敏感性之间的关系.方法 将同源的HeLa细胞分为四组,分别给予多次0Gy、2Gy、6Gy和10Gy的X射线照射,建立不同剂量的放射耐受模型,用TRAP-ELISA分别检测HeLa组、HeLa-2组、HeLa-6组和HeLa-10组端粒酶的活性,用RT-PCR检测其端粒酶hTERT的相对表达量,克隆形成实验检测其放射敏感参数α、β及SF2.结果 HeLa组、HeLa-2组、HeLa-6组端粒酶活性分别是1.54±0.01、1.87±0.01、2.03±0.02,各组间的差异具有统计学意义(P＜0.05);hTERT mRNA的相对表达量分别为0.44±0.03、0.53±0.04、0.74±0.07,表达量明显升高且各组间的差异具有统计学意义(P＜0.05);但HeLa-10组端粒酶的活性(1.02±0.02)及hTERT mRNA的相对表达量(0.21±0.02)都明显降低,与以上三组的端粒酶活性及hTERT mRNA的相对表达量各组的差异均具有统计学意义(P＜0.01).四组细胞克隆形成率降低,放射敏感性依次降低.并且HeLa组、HeLa-2组、HeLa-6组各组端粒酶活性与各组细胞的放射敏感性呈负相关(r=-0.927,P＜0.01),以上三组的hTERT mRNA的相对表达量与各组细胞的放射敏感性亦呈负相关(r=-0.904,P＜0.01).结论 在一定剂量限度内,经过不同剂量的射线照射的宫颈癌HeLa细胞系,其端粒酶活性、hTERT mRNA的相对表达与其放射敏感性存在一定相关性.
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细胞同步化对肿瘤坏死因子诱导Hela细胞凋亡的影响
目的研究细胞周期时相对肿瘤坏死因子(TNF)诱导Hela细胞凋亡的影响.方法应用胸腺嘧啶核苷(TdR)双阻断法将培养的Hela细胞同步化,采用MTT法、流式细胞术和荧光染色,分析同步化的Hela细胞和正常培养的Hela细胞对TNF(加放线菌酮增效)诱导凋亡的敏感性.结果同步化Hela细胞较正常培养的Hela细胞对TNF诱导凋亡的敏感性增强.结论TNF诱导Hela细胞凋亡与细胞周期有关.
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32P照射对Hela细胞杀伤效应的研究
目的研究在不同照射条件下肿瘤细胞生物学效应的特点及不同剂量与时间组合方式对肿瘤细胞的杀灭效果.方法采用人宫颈癌Hela细胞系体外培养,制作32p放射性贴片照射细胞,通过观察照射后细胞增殖能力变化,研究不同剂量、剂量率、照射时间的细胞放射反应特点.应用克隆形成率和细胞群体倍增大小评价肿瘤细胞的增殖能力.结果单次照射显示Hela细胞的剂量、时间、剂量率的阈值特点.照射时间在2h以上、剂量和剂量率分别大于148.00MBq·h、2.78 MBq·h才可以有效抑制Hela细胞增殖;总剂量一定时,一定范围内增加照射时间,细胞总体增殖数目减小.分次与单次照射的比较显示,分次照射组克隆增殖率明显低于单次照射组(P＜0.05),间隔4h的分次照射方案细胞杀伤效率高.结论32pβ射线照射Hela细胞的生物反应具有剂量、时间、剂量率的阈值特点.在一定剂量、一定剂量率范围内延长照射时间,可以更有效地杀伤肿瘤细胞.在现有的剂量范围内,一定总剂量、小剂量分次照射可以产生与单次照射相近或更大的细胞杀伤效应.
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影响血细胞计数板计数的多因素分析
肿瘤体外实验研究中常常涉及到细胞计数,尤其在做细胞定量分析时,计数的可靠性会影响试验结果的可靠性.如在多种因素(射线、化疗药物等)介入条件下的细胞杀伤实验(克隆形成率),实验组之间进行比较时,计数的准确性对实验的影响非常大.国外细胞计数一般使用专用计数器,自动化程度高,重复性好;国内由于经济条件的限制,多采用廉价简便的计数板计数,人工成份多,影响因素较多.针对计数操作中一些影响因素,我们设计了如下试验.
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弯齿琵甲含药血清对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响
目的 探讨弯齿琵甲含药血清对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响及其抗肿瘤的作用机制.方法 采用血清药理学方法制备不同浓度的弯齿琵甲含药血清,MTT法检测不同浓度含药血清对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响;显微镜下观察 Wright's-Giemsa染色和吖啶橙-EB 染色后细胞的形态学变化;DNA琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞DNA断裂情况.结果 宫颈癌HeLa细胞经不同剂量的弯齿琵甲含药血清分别作用24、48 h后,细胞增殖明显受到抑制,且呈时效、量效关系;倒置显微镜下观察可见细胞膜皱缩,细胞核固缩,核染色质边缘化,并出现凋亡小体;荧光显微镜下可见早期凋亡细胞呈黄绿色球状,晚期凋亡细胞呈红色球状;凋亡细胞经琼脂糖凝胶电泳可观察到DNA梯形条带.结论 弯齿琵甲含药血清对宫颈癌HeLa细胞增殖具有明显的抑制作用,其作用机制与诱导细胞凋亡相关.
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瓜蒌含药血清对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响
目的 研究瓜蒌水煎剂含药血清对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用,探讨其抗癌作用机制.方法 采用血清药理学方法制备瓜蒌含药血清,MTT法检测含药血清对HeLa细胞生长的抑制作用,Wright's-Giemsa染色和叮啶橙-EB染色在倒置显微镜和荧光显微镜下观察细胞的形态学变化;琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞DNA Ladder.结果 HeLa细胞经不同剂量的瓜蒌含药血清作用24,48 h后,细胞体外抑制作用明显,呈量效、时效关系;倒置显微镜观察可见HeLa细胞膜皱缩,细胞核固缩,核染色质边缘化,并出现凋亡小体;荧光显微镜下可见晚期的凋亡细胞被染成红色,细胞固缩成球状;琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞发生了DNA断裂,呈梯状条带.结论 瓜蒌含药血清对HeLa细胞具有明显的增殖抑制作用,其作用机制与诱导细胞凋亡相关.
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维生素C对Hela细胞系增殖及细胞周期的影响
目的探讨维生素C对Hela细胞系增殖及细胞周期的影响.方法采用MTT测定,观察不同浓度维生素C(1 μmol/L～3 500 μmol/L)对Hela细胞系增殖的抑制作用;运用流式细胞仪检测用药后细胞周期分布及增殖指数的变化.结果各个浓度的维生素C对Hela细胞系增殖均有抑制作用,并呈剂量依赖性,3 500 μmol/L时,抑制率为66.15%.维生素C能使Hela细胞系阻滞于G0/G1期,抑制DNA的合成,使细胞增殖指数明显下降.且此作用随用药浓度的增加而增强.结论维生素C在体外对Hela细胞系有明显的抑制作用,使细胞阻滞于G0/G1期.
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鲍曼不动杆菌外膜蛋白A真核表达载体构建及其诱导Hela细胞不完全自噬
目的 构建鲍曼不动杆菌A TC C19606(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)的真核表达载体pEGFP-OmpA,研究OmpA对Hela细胞自噬的影响.方法 采用PCR方法扩增鲍曼不动杆菌ATCC19606的OmpA基因,将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1,以构建重组质粒pEGFP-OmpA;用脂质体转染法将其转染Hela细胞;流式细胞术、细胞免疫荧光和Western blot检测OmpA表达水平;激光共聚焦显微镜检测OmpA在Hela细胞中的定位;Western blot及透射电子显微镜检测OmpA对Hela细胞自噬的影响.结果 经双酶切及测序鉴定表明pEGFP-OmpA质粒构建成功;OmpA可以大量表达于Hela细胞的细胞质和细胞核中;OmpA可导致Hela细胞中自噬相关蛋白LC3BⅡ、p62和Beclin-1表达升高,而且在Hela细胞中发现自噬小体;OmpA会干扰p62降解,引发不完全自噬.结 论本研究成功构建pEGFP-OmpA真核表达载体,它可以在Hela细胞中高效表达,并可导致Hela细胞不完全自噬,这为将来进一步研究鲍曼不动杆菌OmpA引起自噬的机制奠定基础.
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诱导表达人活性型颗粒酶B的Hela细胞系的建立
目的:构建人颗粒酶B基因的可诱导表达载体,并将其在Hela细胞中诱导表达.方法:用PCR法获取人活性型颗粒酶B基因序列,克隆入pIND诱导表达载体中.将其与辅助质粒pVgRXR通过脂质体法共转染Hela细胞后,用G418和zeocin筛选建系.通过免疫细胞化学染色法,确定蜕皮激素A佳的诱导浓度及诱导时间,并通过MTT比色法检测及细胞骨架染色等方法观察,表达的活性型颗粒酶B对Hela细胞形态和生长的影响.结果:获得可诱导表达人活性型颗粒酶B基因的Hela细胞系.免疫细胞化学染色表明,30 μmol/L蜕皮激素诱导5 d时目的蛋白表达强,同时观察到Hela细胞的形态发生变化,出现多核大细胞及固缩小细胞,并且细胞生长受到抑制.骨架分析进一步显示,多核大细胞的骨架发生异常.结论:活性型颗粒酶B的可诱导表达系统的建立,为进一步研究颗粒酶B的生物学效应功能奠定了基础.
