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白癜风相关黑素细胞膜抗原VIT150、VIT90、VIT75纯化及分析
目的:纯化和分析白癜风相关的黑素细胞膜抗原,为蛋白质微量测序及筛选、克隆黑素细胞膜抗原打下基础.方法:培养高纯度的正常人黑素细胞,活细胞ELISA法和蛋白免疫印迹法(Western b1ot)检测并筛选抗黑素细胞的高滴度IgG抗体血清,生物素标记可溶性黑素细胞膜抗原,加入筛选血清与蛋白A-琼脂糖凝胶(protein A-sepharose)进行免疫共沉淀,沉淀后的抗原抗体复合物行平极电泳及电转印,碱性磷酸酶标记的亲合素进行化学发光法检测及鉴定.结果:活细胞ELISA法和Western blot检测结果中共筛选了10例白癜风患者高滴度IgG血清,免疫沉淀、免疫印迹、化学发光法检测后发现10例患者均有阳性条带,其抗原相对分子质量为150 000、90 000、75 000、60 000.结论:白癜风患者血清中存在抗黑素细胞膜抗原的自身抗体,抗原相对分子质量主要为150 000、90 000、75000,通过免疫共沉淀初步纯化了150 000、90 000和75 000抗原.
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白癜风皮损黑素细胞HMB-45、酪氨酸酶及其相关蛋白1的免疫组化研究
目的:研究白癜风白斑处黑素细胞分布及酪氨酸酶(TYR)等标记分子的表达情况.方法:对吸疱法所取白斑皮肤以免疫组化染色识别TYR、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)和HMB-45,以Mias 99彩色图像分析软件定量图像分析阳性表达的强弱.结果:白斑处黑素细胞数目明显低于正常对照(P＜0.01),患者非皮损处与正常人皮肤比较差异无显著性(P＞0.05).皮损处黑素细胞树突减少,平均为3.4个,低于对照组(P＜0.05).残留黑素细胞各抗体呈强阳性染色.白斑毛囊之间可见黑素细胞散在、呈围管样分布.白斑处阳性细胞HMB-45图像灰度值低于正常着色皮肤(P＜0.05),而TRP1高于正常皮肤(P＜0.01),TYR与正常皮肤无差异(P＞0.05).结论:白斑处仍然有黑素细胞.残存黑素细胞树突回缩、数目变少,而且黑素细胞中黑素细胞标记分子表达异常.
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毛囊黑素细胞酪氨酸酶及相关蛋白1和2等分化标记分子的研究
目的:研究毛囊黑素细胞生物学特性,特别是与黑素合成相关酶蛋白和黑素小体结构蛋白在毛囊中的表达及分布情况.方法:取正常人头皮,采用HMB-45和识别酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)等抗体免疫组化染色黑素细胞,研究毛囊中黑素细胞的分布、形态及TYR、TRP1和TRP2等黑素细胞分化标记分子的表达情况.结果:有功能的黑素细胞位于毛漏斗部基底层和生长期毛母质内接近毛乳头处,毛母质黑素细胞树突计数均值为5.1,高于表皮黑素细胞(P＜0.01).毛髓质中黑素细胞与皮质细胞比值约为1:4.2,而在基底层基底细胞与黑素细胞之比约为1:9.7.毛球HMB-45,TYR,TRP1和TRP2阳性,阳性颗粒仅局限于毛皮质和毛髓质内.图像分析结果表明:毛球部黑素细胞HMB-45、TYR、TRP1灰度值低于表皮黑素细胞(P＜0.05)、毛球部、毛漏斗部及表皮的黑素细胞TRP2灰度比较差异无显著性(P＞0.05).结论:毛囊中有活性的黑素细胞主要位于毛球和毛漏斗部,它们均表达黑素细胞分化标记抗原gp100、TYR、TRP1和TRP2.而且毛母质黑素细胞前3种分子表达量高于表皮黑素细胞.
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中药芪白颗粒治疗进展期白癜风的双盲随机对照研究
目的:评价华山医院自制制剂芪白颗粒治疗进展期白癜风的安全性和有效性.方法:采用随机、双盲、赋形剂平行对照的研究方法,将受试者按照1∶1的比例分配至芪白颗粒组(试验组)和安慰剂组(对照组).共入组272例进展期白癜风患者,每组患者136例.试验组患者口服芪白颗粒,联合外用0.1％他克莫司软膏.对照组患者口服模拟冲剂,联合外用0.1％他克莫司软膏.受试者在接受治疗后的第4周、第8周、第12周各随访1次,记录活动性评分、中医症候评分、复色评分以及生活质量评分,治疗后第12周评价临床疗效及安全性.结果:芪白颗粒组能控制白癜风的发展,有效率84.56％,安慰剂组活动性评分有效率为44.85％,两者差异有统计学意义(P＜0.05).芪白颗粒组服药12周后中医症候改善的有效率为80.88％,明显高于安慰剂组的39.7％ (P＜0.05).治疗12周后两组患者靶皮损均有不同程度的复色,芪白颗粒组复色率77.21％,安慰剂组复色率53.67％.结论:芪白颗粒对进展期白癜风有较好的控制作用,不良反应小,但中药起效相对较慢,治疗周期比较长.
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自体表皮与黑素细胞移植治疗白癜风疗效对比
目的:研究和比较自体表皮移植与黑素细胞移植治疗白癜风的临床效果.方法:自体表皮移植采用局部皮肤发疱后直接进行移植;黑素细胞移植是从疱壁七获取黑素细胞、纯黑素细胞培养与增殖、移植区刮除种植法进行自体黑素细胞移植治疗.结果:自体表皮移植与黑素细胞移植治疗白癜风对其皮损的评分分别为(7.97±2.36)分和(11.46±2.57)分,经统计学分析差异有统计学意义(P＜0.01).结论:自体表皮移植操作方法较简单,黑素细胞移植可治疗面积大的皮损,而且色素分布均匀,临床效果更好.
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自体黑素细胞培养移植治疗白癜风疗效观察
2004年3月-2005年6月,笔者采用自体吸疱法获取黑素细胞,经过纯黑素细胞培养、增殖,在皮损处刮除、种植进行自体黑素细胞培养移植治疗白癜风,取得了满意的临床效果,现报告如下.
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儿童无色素性痣106例临床分析
为了解无色素性痣的临床特征,分析总结了106例儿童无色素性痣的临床特点,对其中10例做了组织学检查.结果显示本病发病年龄早,79.2%白斑于1岁内发现;躯干部常见,占43.4%;局限型占60.4%,节段型占39.6%;66.0%白斑边缘很不规则,部分呈锯齿状或泼溅状.组织病理学显示基底层黑素细胞数目无明显减少.其临床特征及组织学改变与其它局限性白斑不同.
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黄芩甙对紫外线诱导人正常黑素细胞黑素合成的抑制作用研究
体外培养黑素细胞(MC)分别经隔日长波紫外线(UVA)或中波紫外线(UVB)照射和(或)黄芩甙处理后,观察细胞增殖情况,测定酪氨酸酶活性和黑素含量.结果:(1)UVA使细胞增殖增快,但剂量较大时增殖减慢;UVB使细胞增殖减慢.二者均可使细胞酪氨酸酶活性和黑素含量高于对照组.(2)黄芩甙具有抑制UVA和UVB诱导的MC增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成改变的作用.提示黄芩甙能抑制UVA和UVB诱导的细胞反应,还可通过抑制酪氨酸酶减少MC黑素合成.
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白癜风患者血清中抗黑素细胞IgG,IgM抗体的检测及补体介导的血清细胞毒反应
为探讨白癜风血清中的抗黑素细胞抗体类型和反应模式以及对黑素细胞的损伤作用,以免疫组化法检测了白癜风患者血清中抗黑素细胞IgG、IgM抗体,并以吖啶橙/溴化乙锭细胞染色法观察补体介导的白癜风血清对黑素细胞损伤作用.结果发现25例活动性寻常型白癜风患者血清中有19例检出IgG型抗体,21例检出IgM型抗体,明显高于稳定期和正常对照组血清;25例活动期血清9例出现对黑素细胞的明显细胞毒作用,高于正常人血清,对照的成纤维细胞未出现明显的细胞毒作用.结果提示白癜风患者血清内有抗黑素细胞IgG、IgM抗体,这些抗体可以通过补体选择性的损伤体外培养的黑素细胞,支持白癜风是一种自身免疫性疾病的假设.
关键词： 白癜风 黑素细胞 抗体免疫组织细胞化学 细胞毒 -
黑素细胞在银屑病发病机制中的作用
T细胞生成的白细胞介素(IL)-17、肿瘤坏死因子(TNF)-α在银屑病发病中起着至关重要的作用,而银屑病皮损、皮损消退后白斑或色素沉着的形成是银屑病的常见表现,这与黑素细胞有着不可分割的联系.黑素细胞衍生的自身抗原——抗原片段样蛋白-5(ADAMTSL-5)可激活T细胞产生IL-17,IL-17又可诱导其他炎症因子的产生,终T细胞、细胞因子、黑素细胞、角质形成细胞之间通过细胞因子相互作用引起炎症反应;另外,IL-17协同TNF-o直接或者通过其他细胞因子增加黑素细胞的数量,下调黑色颗粒生成和色素沉着信号转导通路基因,促进β-防御素3的表达而引起银屑病的炎症.因此,黑素细胞参与了银屑病的发病.
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自体培养黑素细胞移植治疗白癜风疗效的相关因素分析
白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤病,外科疗法常常能够获得比较满意的疗效.自1 987年Lemer等首次用体外培养的自体黑素细胞(MC)移植治疗白癜风获得成功后,相继有很多文献报道.MC经体外培养扩增后,很小面积的供皮区皮肤即可治疗大面积白癜风,故该方法具有较大的临床应用价值.有研究显示自体培养MC移植治疗白癜风的临床疗效存在一定的差异,与患者病情、手术方法、个体化培养及联合治疗等多种因素相关,该文就其主要影响因素作一综述.
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乳头瘤样黑素细胞痣
患者女,16岁.主诉:因腹部皮肤出现肿物16年.现病史:患者出生时上腹中部即有一黑色斑点,逐渐增大,至1岁左右增至米粒大.16年来皮损缓慢增长至直径约2 cm的圆形凸出皮面的肿物,于2007年12月就诊.平素无自觉症状,也未曾诊治过.既往史:患者既往身体健康.家族史:其父背部以及面部有20余个色素痣,无黑素瘤病史.皮肤科检查:上腹中部皮肤一2.0 cm×1.8 cm黑褐色椭圆形肿物,形似乳头状,基底略窄,表面有脑回状沟纹.
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窄谱中波紫外线对体外培养人黑素细胞自噬水平的影响
目的 观察窄谱中波紫外线(NB-UVB)照射对黑素细胞自噬水平的影响,探讨NB-UVB治疗白癜风的可能机制.方法 体外培养正常人黑素细胞给予单次0(对照组)、50、100和200 mJ/cm2NB-UVB照射,照射后24 h收集细胞,单丹酰戊二胺染色法(MDC)检测细胞自噬体变化,免疫印迹法检测自噬信号磷酸化磷酸腺苷蛋白激酶(p-AMPK)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、微管相关蛋白轻链3Ⅱ/Ⅰ (LC3Ⅱ/Ⅰ)及P62表达变化,透射电镜观察自噬体与黑素小体超微结构变化.免疫印迹结果采用单因素方差分析进行比较,黑素小体、自噬体与自噬溶酶体数量采用Kruskal-Wallis H检验进行统计分析.结果 MDC染色显示,对照组、50、100和200 mJ/cm2 NB-UVB组自噬体染色阳性率分别为(21.83±3.50)、(23.66±4.12)、(38.08±4.10)、(40.23±1.45)％,100、200 mJ/cm2组显著高于对照组和50 mJ/cm2 NB-UVB组(均P＜0.05).免疫印迹法显示,与对照组相比,100、200 mJ/cm2组p-AMPK、LC3Ⅱ/Ⅰ表达均显著上调(均P＜0.05),而p-mTOR及P62表达均显著下降(均P＜0.05).透射电镜结果显示,与对照组自噬体与自噬溶酶体数量(1.88±1.18)相比,100、200 mJ/cm2组(5.12±1.13、5.25±1.04)均显著增多(P＜0.05).50、100、200 mJ/cm2组黑素小体数量(39.12±9.42、57.38±7.11、59.75±15.15)均较对照组(18.50±4.18)显著增多(均P＜0.05).结论 NB-UVB照射不仅可以促进黑素小体生成,还可以激活黑素细胞的自噬信号通路,促进自噬体及自噬溶酶体的形成,推测其为白癜风的治疗机制之一.
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咖啡酸衍生物WSY6对黑素细胞氧化应激损伤的保护用及机制研究
目的 探讨咖啡酸衍生物WSY6对过氧化氢(H2O2)诱导的黑素细胞氧化损伤的保护作用和潜在分子机制.方法 体外培养原代人表皮黑素细胞,分为对照组(不做任何处理)、H2O2组(1 mmol/LH2O2处理)和6.25、12.5、25 μmol/LWSY6组(分别用6.25、12.5、25 μmol/L WSY6预处理1h后再用1 mmol/L H2O2处理1h).继续培养24 h后,用MTS法测定黑素细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH释放量.部分黑素细胞分为抑制剂组(用p38抑制剂预处理1h,再用1 mmol/LH2O2处理1h)和H2O2组(直接用1 mmol/LH2O2处理1h),处理完成后继续培养24 h,用试剂盒检测LDH的释放量.部分黑素细胞用25 μmol/L WSY6预处理1、2、4h后,再用H2O2处理1h,流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平;部分黑素细胞用6.25、12.5、25 μmol/L WSY6处理1h后,再用H2O2处理1h,Western印迹法检测细胞色素C(cyto-c)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、caspase-9和磷酸化丝裂原活化的蛋白激酶(p-p38 MAPK)、细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)及c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)的表达.结果 与对照组相比,H2O2组黑素细胞存活率明显降低(29.22％±1.31％,P＜0.05),细胞内LDH释放量增加(47.19％±4.85％,P＜0.05),ROS水平明显升高(18.37±1.59,P＜0.05),caspase-3和caspase-9的表达亦均升高.与H2O2组相比,6.25、12.5、25μmol/L WSY6组细胞存活率明显增加(52.48％±1.17％、60.21％±0.25％、78.32％±1.73％,P＜0.05),LDH释放量明显下降(21.99％±0.22％、15.38％±0.45％、13.18％±0.38％,均P＜0.05),25 μmol/L WSY6处理1、2、4h组细胞内ROS显著下降(7.59±1.00、6.22±0.52、5.15±0.48,均P＜0.05).同时p38抑制剂组黑素细胞LDH释放量较H2O2组显著下降(P＜0.05).Western印迹法显示,WSY6预处理后,与H2O2组相比,caspase-3和caspase-9表达明显降低,p-p38表达下降,但p-ERK和p-JNK表达无明显变化;同时WSY6组p38 MAPK下游产物p-p53表达也下降,且WSY6浓度越高,下降越明显.结论 WSY6对H2O2诱导的黑素细胞氧化应激损伤有显著的保护作用,可能通过p38 MAPK途径发挥作用.
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京尼平苷通过PI3K-Akt途径拮抗黑素细胞氧化损伤
目的 探讨京尼平苷对体外培养的人黑素细胞氧化损伤的拮抗作用,以及PI3K-Akt途径在其中的作用.方法 取健康青少年环切术后包皮,分离并培养表皮黑素细胞.取第2～3代黑素细胞,分为对照组(不做任何处理)、京尼平苷组(125 μmol/L京尼平苷处理)、LY294002组(5μmol/LLY294002处理)、H2O2组(250 μmol/LH2O2处理)、京尼平苷+H2O2组(125 μmol/L京尼平苷处理24 h后,加入250 μmol/L H2O2作用4h)、京尼平苷+LY294002+H2O2组(125 μmol/L京尼平苷处理24 h后,加入5 μmol/L LY294002作用1h,然后用250 μmol/LH2O2作用4h).作用完成后,用噻唑蓝(MTT)法检测黑素细胞增殖活性,Western印迹检测Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、血红素加氧酶1(HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx-1)蛋白的表达,生物化学方法检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性,流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)含量.通过单因素方差分析(ANOVA)对各组间数据进行比较,采用SNK-q检验进行组间两两比较.结果 H2O2组细胞增殖率较对照组明显降低(P＜0.01),p-Akt(P＜ 0.01)、HO-1 (P＜ 0.01)、GPx-1(P＜ 0.05)蛋白表达水平下降,SOD活性、CAT活性降低(均P＜ 0.01),ROS含量显著升高(P＜0.01).与H2O2组相比,京尼平苷+H2O2组黑素细胞增殖率上升(72.98％±8.92％比50.53％±10.85％,P＜ 0.05),p-Akt(P＜ 0.05)、HO-1 (P＜ 0.01)、GPx-1 (P＜ 0.01)蛋白表达上调,SOD[(6.82±1.03) U/mg比(1.29±0.43) U/mg,P＜0.05]和CAT[(46.08±4.16) U/mg比(18.71±3.09) U/mg,P＜0.05]酶活性增高,ROS含量(1 284.33±110.64比2 158±222.75,P＜0.01)减少;京尼平苷+ LY294002+H2O2组黑素细胞增殖率(44.35％±14.85％)较京尼平苷+H2O2组降低(P＜0.05),p-Akt(P＜ 0.01)、HO-1(P＜ 0.05)、GPx-1(P＜ 0.01)蛋白表达下调,SOD活性[(1.31±0.65) U/mg,P＜0.05]和CAT活性[(23.25±5.56) U/mg,P＜0.05]减弱,ROS含量增加(1 668±62.03,P＜ 0.05).结论 京尼平苷可通过PI3K-Akt途径促进黑素细胞HO-1和GPx-1表达,增强SOD和CAT活性,拮抗黑素细胞氧化应激损伤.
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Wnt5A基因过表达对黑素细胞骨架蛋白的影响
目的 探讨携带Wnt5A全基因序列的质粒转染原代黑素细胞后,Wnt5A表达升高对黑素细胞骨架蛋白的影响.方法 培养原代人表皮黑素细胞,并分为3组:①空白对照组:除细胞外不加任何试剂;②阴性对照组:加入空白的去内毒素pcDNA3.1(+)质粒、Opti-MEM培养基及Lipo3000;③Wnt5A质粒组:加入Wnt5A去内毒素pcDNA3.1(+)质粒、Opti-MEM培养基及Lipo3000.Wnt5A质粒转染黑素细胞,采用qPCR法检测各组Wnt5A、Ras相关C3肉毒素底物1(Rac1)、丝状肌动蛋白(F肌动蛋白)和β微管蛋白基因表达,Western印迹法测定Wnt5A、酪氨酸激酶受体2(ROR2)、Rac1、F肌动蛋白和β微管蛋白表达,并通过细胞免疫荧光试验观察细胞骨架蛋白表达情况.结果 qPCR法显示,Wnt5A质粒组、阴性对照组和空白对照组Wnt5A mRNA及其下游基因Rac1和F肌动蛋白rnRNA表达量3组间差异均有统计学意义(F=1374.179、112.576、66.458,均P＜0.01),但β微管蛋白mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05).Wnt5A质粒组Wnt5A、Rac1和F肌动蛋白mRNA表达量均显著高于空白对照组及阴性对照组(P＜0.05).Western印迹法显示,Wnt5A质粒组Wnt5A蛋白表达较空白对照及阴性对照明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).Wnt5A质粒组Rac1、ROR2、F肌动蛋白表达均明显低于空白对照组和阴性对照组(P＜0.05),但β微管蛋白表达在3组间差异无统计学意义(P＞0.05).细胞免疫荧光实验显示,Wnt5A质粒组绿色(β微管蛋白)、红色(F肌动蛋白)荧光强度与两个对照组相比均无明显差别,但黑素细胞体积明显增大,树突数目明显增多,细胞骨架显著改变,表现为F肌动蛋白强弱不一,纹理模糊,张力丝断裂,局部呈团块状.结论 黑素细胞Wnt5A基因表达升高可调控细胞骨架相关基因及蛋白表达,使黑素细胞体积增大、树突增多、骨架改变,可能有利于黑素小体的输送传递,参与色素沉着性疾病的发病.
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氧化应激下黑素细胞自噬相关基因差异表达分析
目的 探讨过氧化氢(H2O2)对黑素细胞自噬的影响及可能的调节机制.方法 取对数生长期健康人黑素细胞,分为空白对照组(不予任何处理)、阳性对照组(100 nmol/L西罗莫司处理)和实验组(体积分数为10-7～10-3的H2O2处理),处理4h后,使用CCK8法、流式细胞仪分别检测各组黑素细胞活性及凋亡率.吖啶橙染色检测自噬小泡,透射电镜下观察自噬小体,Western印迹检测自噬特异性蛋白Beclin 1、微管相关蛋白轻链3B(LC3B).后采用包含84个自噬相关基因的RT2 Profiler PCR Array筛选自噬相关的差异表达基因.结果 黑素细胞分别经10-3、5×104、10-4、5×10-5、10-5、5×10-6、10-6H2O2处理后,细胞增殖活性及凋亡率与空白对照组相比差异均有统计学意义(F值分别为286.95、301.23,均P＜0.05),且随H2O2体积分数升高,增殖活性降低,凋亡率升高.除5×l0-6 H2O2组分别与10 5、10-6 H2O2组间相比细胞凋亡率差异无统计学意义外,上述各H2O2组间两两比较,黑素细胞增殖活性及凋亡率差异均有统计学意义(P＜0.05).吖啶橙染色及电镜观察发现,10-5 H2O2、10-6 H2O2和西罗莫司处理的黑素细胞中有自噬小体形成.Western印迹显示,10-5H2O2、10-6H2O2和西罗莫司组黑素细胞Beclin 1表达量和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比率均较空白对照组显著升高(P＜0.05).RT2 Profiler PCR Array结果显示,与空白对照组相比,10-5 H2O2组、10-6H2O2组和西罗莫司组中ATG12、ATG3、ULK1、PIK3CG、PTEN、PIK3C3表达均显著上调,EIF2AK3表达显著下调;10-5 H2O2组和西罗莫司组mTOR表达显著下调,ULK2表达显著上调;10-6H2O2组mTOR表达未发生明显改变,AMPK、JNK1表达显著上调.结论 体积分数为10-5和10-6的H2O2均能有效诱导黑素细胞自噬,可能与影响相关信号分子表达相关.
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原代人黑素细胞Wnt5A基因沉默的研究
目的 优化Wnt5A特异性siRNA转染原代人黑素细胞的实验条件,建立沉默Wnt5A基因的模型.方法 培养原代人黑素细胞,将不同浓度(0、20.0、33.3、40.0、60.0 nmol/L)的阳性参照基因GAPDH特异性siRNA通过脂质体法介导转染原代人黑素细胞,实时荧光定量PCR(qPCR)筛选转染效率高的siRNA浓度;合成3条Wnt5A-siRNA(Wnt5A-siRNA-793、Wnt5A-siRNA-943、Wnt5A-siRNA-1743),分别转染原代人表皮黑素细胞,qPCR法选择干扰特异性佳的Wnt5A-siRNA;用佳Wnt5A-siRNA转染原代人黑素细胞,分别于培养24、48、72 h提取总mRNA及总蛋白,通过qPCR及Western印迹法确定转染效率高的时间点.结果 0、20.0、33.3、40.0、60.0 nmol/L GAPDH-siRNA转染原代人黑素细胞后,GAPDH mRNA相对表达量分别为1.009±0.161、0.086±0.010、0.140±0.016、0.285±0.095、0.012±0.007,组间比较,差异有统计学意义(F=69.469,P＜0.05).60 nmol/L siRNA组GAPDH表达低于其他各组(均P＜0.05),干扰效率佳;各Wnt5A-siRNA组及空白组Wnt5AmRNA相对表达量分别为0.331±0.010、2.229±0.029、0.078±0.006、1.000±0.024,差异有统计学意义(F=7 006.094,P＜0.05).Wnt5A-siRNA-1743组目标分子表达量低于其他3组(均P＜0.05),干扰效率佳.Wnt5A-siRNA-1743转染原代人表皮黑素细胞后24、48、72 h及空白组Wnt5A mRNA相对表达量分别为0.396±0.002、0.026±0.008、0.131±0.079、1.025±0.276,组间比较,差异有统计学意义(F=29.215,P＜0.05),干扰后48 h低于干扰后24、72 h及空白组(均P＜0.05);Wnt5A蛋白相对表达量分别为112.798±0.218、77.765±0.415、30.540±0.219、130.025±0.158,组间比较,差异有统计学意义(F=79 122.889,P＜0.05),干扰后72 h低于干扰后24、48 h及空白组(均P＜0.05).结论 成功建立siRNA沉默人黑素细胞Wnt5A基因的模型.
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维生素C溶液在H2O2诱导体外培养黑素细胞氧化损伤中的影响
目的：探讨维生素C对体外培养的人黑素细胞增殖活性的影响并评估维生素C对H2O2诱导的人黑素细胞氧化损伤的影响。方法通过CCK8法取佳浓度的维生素C溶液和半数致死浓度的H2O2溶液应用于实验。将黑素细胞分为对照组、维生素C组、H2O2组、联合处理组4组，经过48 h处理后，分别用CCK8法和流式细胞仪检测4组细胞活率及凋亡率；将除维生素C组以外其他3组细胞，分别用生物化学法检测超氧化物歧化酶活力和丙二醛浓度，荧光染色法检测细胞内的活性氧。结果佳浓度的维生素C溶液为1000μmol/L，半数致死浓度的H2O2溶液300μmol/L。对照组细胞活率、细胞凋亡率、超氧化物歧化酶活力、丙二醛浓度、活性氧荧光强度分别为（100±4.99）％、（6.90±0.87）％、（54.71±4.75）U/mgprot、（263.39±20.17）nmol/mgprot、342.16±27.36。H2O2溶液可以明显提高黑素细胞凋亡率[（16.47±1.07）％]、超氧化物歧化酶活性[（103.62±10.44）U/mgprot]、丙二醛[（493.70±31.36）nmol/mgprot]和细胞内活性氧（782.48±36.25）水平，降低细胞活率[（39.07±2.94）％]，而维生素C溶液可以显著降低H2O2溶液诱导的凋亡[（11.83±0.95）％]，降低超氧化物歧化酶活性[（76.73±5.20）U/mgprot]、丙二醛[（371.82±23.05）nmol/mgprot]、活性氧（475.64±52.18）的含量，同时恢复细胞的活率[（74.31±5.53）％）]。结论1000μmol/L维生素C溶液不仅能促进人黑素细胞的增殖，对H2O2诱导的黑素细胞氧化应激损伤具有保护作用。
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葛根素促进黑素细胞黑素合成及其机制的初步探讨
目的 探讨葛根素对正常人黑素细胞黑素合成的影响和可能机制.方法 用噻唑蓝(MTT)法、NaOH裂解法观察葛根素对黑素细胞增殖及黑素合成作用,RT-PCR及Western印迹法检测葛根素对黑素细胞小眼畸形相关转录因子(MITF)、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1)基因转录和蛋白表达水平的影响.结果 1～ 40 μmol/L浓度范围内葛根素对体外培养的黑素细胞增殖影响与正常对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05).与正常对照组相比,40 μmol/L葛根素可显著促进黑素细胞的黑素合成(P＜0.05),并可显著增加MITF、TYR、TRP-1 mRNA及蛋白的表达(P＜0.05).40 μmol/L葛根素使MITF、TYR、TRP-1的蛋白表达量分别比正常对照组增加8.69％,10.28％和10.58％(P＜ 0.05);并使MITF、TYR、TRP-1的mRNA表达量分别比正常对照组增加2.48倍,1.91倍和1.63倍(P＜0.05).结论 葛根素能增加MITF、TYR、TRP-1 mRNA及蛋白的表达水平,促进黑素合成.
