用分泌型萤光素酶报告系统比较TTR启动子与CMV启动子的体内外表达特性

Gluc(Gaussia Luciferase)是一种高灵敏度分泌型萤光素酶.本研究利用Gluc的易分泌、高灵敏性和检测方法简单快速的特点,初步比较了TTR启动子(P_(TTR))与CMV启动子(P_(CMV))的体内外表达特性.首先构建了两种启动子-报告基因表达质粒pAAV2-neo-TTR-Gluc和pAAV2-neo-CMV-Gluc.用脂质体转染法将它们分别转染至两株肝细胞源的细胞株Huh7与HepG2以及两株非肝细胞源细胞株HEK293与HeLaS3.在转染后不同时间点取细胞培养上清液检测Gluc的表达.此外采用水动力注射法,将这两种质粒分别以注射剂量0.1μg、1μg和10μg/只经尾静脉注射至BALB/c小鼠体内,注射后2h开始在不同时间点上经尾静脉采集全血(2.5μl/次)并测定血液中的Gluc水平.细胞实验结果显示,P_(CMV)介导的Gluc表达都明显高于P_(TTR);然而,在HEK293和HeLaS3细胞中P_(CMV)比P_(TTR)的表达水平高50～300倍,而在Huh7和HepG2中仅高10倍以内,提示P_(TTR)具有相对的肝细胞特异性.在小鼠实验中,P_(CMV)介导的Gluc表达在各剂量组中也明显高于P_(TTR),然而它们表达水平变化特征明显不同:P_(CMV)介导的Gluc表达在质粒注射后约10h达到大值,此后迅速下降;而P_(TTR)介导的Gluc表达在质粒注射后约48h达到峰值,随后缓慢下降.上述实验结果提示,P_(TTR)虽然在表达强度方面不及P_(CMV),但其介导的表达水平维持长时间,下降较缓慢,比较适于目的基因在肝脏内的较长时间表达.

斑点叉尾鮰出血病病原呼肠孤病毒的分离与鉴定

采用细胞培养分离病毒技术从患出血病的斑点叉尾鮰体内分离到一株新病毒.经人工感染试验、电镜观察、理化特性试验以及病毒基因组分析,确认为斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(Channel Catfish Reovirus,CCRV).人工感染试验可复制出与自然发病相同的症状;病毒感染斑点叉尾鮰卵巢组织细胞系和肾脏组织细胞系可产生典型细胞病变效应.感染细胞的超薄切片电镜观察结果显示,病毒在细胞质内复制,呈晶格状排列,病毒颗粒具双层衣壳,无囊膜,直径约60～70nm;冻融、56℃1h、氯仿,乙醚等处理对病毒滴度影响不显著,65℃1h处理病毒滴度下降极显著.病毒基因组SDS-PAGE分析和核酸酶敏感试验结果表明,其基因组由11个分段的RNA核酸节段组成,节段大小范围为0.9～4.4kh,可分为三大类,即L1、L2、L3,M1、M2、M3和S1、S2、S3、S4、S5,为典型的水生呼肠孤病毒(Aquareovirus)基因组结构.病毒基因组S4节段的克隆与序列分析结果表明,其与GenBank中登录的草鱼呼肠孤病毒S4节段(AF403396)、美洲金体鳊呼肠孤病毒(GSRV)的S4节段(AF403407)长度均为909bp,其序列同源性分别为99%和90%.

感染J亚群禽白血病病毒的蛋鸡群中检测出B亚群禽白血病病毒

通过血清学、病理学以及病毒学检测,首次在国内从感染ALV-J的海蓝白商品蛋鸡群中分离到B亚群禽白血病病毒(ALV-B).ELISA检测该鸡场血清样品(92份)显示,ALV-A/B型抗体阳性率为16.3%,ALV-J抗体阳性率为13%,其中有1只鸡呈现抗体双阳性.取3只表现临床症状病鸡做病理组织学观察,在肝脏同一位置发现淋巴细胞样瘤细胞和髓细胞样瘤细胞增生灶,其它组织器官(除脑、神经和法氏囊)也有不同程度的两种瘤细胞增生.根据文献设计合成ALV-A、ALV-B、ALV-J、MDV和REV的特异性引物.取该3只病鸡肝脏病料研磨接种DF-1细胞,培养7～10天后提取培养细胞DNA,PCR扩增获得1 100bp的ALV-B特异性片段和924bp的ALV-J特异性片段,其中有1只鸡为ALV-B和ALV-J双阳性,而ALV-A、MDV、REV的PCR结果为阴性,因此获得ALV-B和ALV-J各两株分离株.对ALV-B、ALV-J扩增序列进行遗传进化树分析表明,两ALV-B分离株与其代表株的同源性分别为92.8%和94.7%;两ALV-J分离株与英国原型株同源性分别为96.9%和91.5%,与美国原型株同源性为85.9%和81.5%,与国内分离毒株同源性在87.0%～98.7%之间.本研究在国内分离到ALV-B毒株,并证实了ALV-B、J在同一只鸡体内的混合感染,应引起养禽业及相关研究部门的高度重视.

2000～2007年广西鸡传染性法氏囊病病毒的分子流行病学

应用逆转录酶-聚合酶链式反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)技术,对2000～2007年间收集于南宁、玉林、北海和梧州4个广西主要养禽地区的临床疑似传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)病鸡的法氏囊组织进行检测,检测呈阳性的病料通过9d龄鸡胚的绒毛尿囊膜(chorio-allantoic membrane,CAM)接种的方法进行鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)的分离和传代,然后设计针对病毒VP2基因高变区(vVP2)的引物对分离株进行RT-PCR扩增并对其进行核苷酸序列测定,与参考毒株的相应序列及其关键位点进行分析比较并绘制遗传进化树.结果成功分离到27株IBDV,其中BH09、BH11、TZ(3)、050222、YL051、NN0603、NN0611和QX0602等17个分离株(占62.96%)可能为超强毒(very virulent IB-DV,vvIBDV),与其它已发表的vvIBDV毒株的序列同源性较高,在遗传进化树上可分成3个分支,与常用疫苗株的亲缘关系则较远;NN040124和YL052属中等偏强毒力株.与经典毒力株52～70和STC的亲缘关系较近;YLZF2、040131等8株属于弱毒株,与经典毒力株CU1具有较高的同源性.本研究的结果表明,近7年来在广西全区的鸡中流行的主要为vvIBDV毒株,各地毒株来源复杂,部分IBDV的抗原性可能已经发生漂变.

北京市2007年新确认HIV-1感染者流行毒株gag基因序列测定和亚型分析

为了解北京市HIV-1亚型特点和流行特征,随机采集北京市2007年新确证HIV-1感染者的抗凝全血标本200份,分离血浆,提取病毒RNA,用套式聚合酶链式反应扩增病毒gag基因,并进行序列测定和亚型分析.系统进化分析确定北京市HIV-1流行毒株分别属于7个亚型和流行重组型,分别为A1亚型1份,B亚型35份,泰国B亚型19份,C亚型3份,CRF01_AE亚型49份,CRF07_BC亚型51份,CRF08_BC亚型3份.北京市己存在7种HIV-1亚型和流行重组型,应该加强北京市HIV-1亚型流行情况的监测.

中国国内首次分离出EV73肠道病毒

对云南省与缅甸接壤边境地区健康儿童粪便标本中分离到的2株病毒进行VP1基因序列测定,以了解其分子生物学特点.用肠道病毒通用引物292/222进行RT-PCR,并对扩增产物进行测序.将基因序列提交GenBank进行BLAST搜索,同时运用Mega软件进行同源性分析,并构建基因树.核苷酸和氨基酸同源性比较结果证明,2株病毒为EV73型,为国内首次报道.

共表达H5亚型禽流感病毒HA基因和鸡IL-2基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力研究

将H5亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因和鸡白介素(chiIL-2)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体p12LS的启动子Ps和P_(E/L)下游,使这两个基因反向串联,构建携带AIV HA基因和chiIL-2基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒p12LSH5AIL2.将重组鸡痘病毒转移载体质粒转染至已感染野生型鸡痘病毒282E4株的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,经蓝斑筛选获得纯化的重组鸡痘病毒rFPV-H5AIL2.间接免疫荧光试验表明重组鸡痘病毒能够表达H5亚型AIV HA;RT-PCR和间接免疫荧光试验证实重组鸡痘病毒可表达chiIL-2.SPF鸡和商品蛋鸡的免疫攻毒保护试验表明,经rFPV-H5AIL2免疫的试验鸡的抗体水平显著高于经rFPV-H5A免疫的试验鸡;在SPF鸡中rFPV-H5AIL2免疫组和rPFV-H5A免疫组的攻毒保护率和排毒率相当,但在商品鸡中rFPV-H5AIL2免疫组的攻毒保护率显著高于rFPV-H5A免疫组,而排毒率显著低于后者.本研究为研制新型禽流感重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础.

2005～2008年深圳地区肠道病毒71型基因特征研究

对2005～2008年深圳地区肠道病毒71型进行基因特征研究.用肠道病毒71型特异性引物进行RT-PCR,并扩增EV71的VP1基因,所得的核苷酸序列与肠道病毒71型A、B、C基因型代表株的核苷酸序列比较,并且用DNASTAR、.BioEdit和Mega 3.1软件进行系统进化分析.结果表明17株病毒与C4a亚群代表株接近,VP1区核苷酸同源性在95.3%～99.4%之间,1株病毒与C4b亚群代表株较接近,核苷酸同源性在93.0%～95.6%之间;18株病毒与A、B基因型代表株比较差异较大,VP1区核苷酸同源性为81.8%～86.0%,18株病毒之间的VP1核苷酸同源性为92.5%～100%.深圳地区EV71的流行株均属于C4基因型,但以C4a亚群为主,还存在CAb亚群.

犬细小病毒VP2基因的遗传变异分析

为了分析中国部分省市犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)流行毒株的分子生物学特征,了解其遗传演化规律.查明中国目前CPV流行毒株现状,本项研究通过对2006～2008年武汉、南京和北京的宠物犬疑似犬细小病毒粪便样品进行检测,并对犬细小病毒PCR阳性产物进行RFLP分析,未发现宠物犬感染猫细小病毒的现象.从PCR检测犬细小病毒阳性标本15份以及广泛使用的犬细小病毒疫苗2株中克隆犬细小病毒VP2基因并进行序列分析,结果显示:检测到的15株犬细小病毒均属于CPV-2a亚型;与GenBank中的其他CPV-2a亚型相比,其中14株犬细小病毒存在独特的Ile324变异,并且国内主要使用的两个犬细小病毒疫苗株均属于CPV-2型,但是与CPV-2型原型毒株CPV-b相比,VP2蛋白氨基酸序列已经发生改变.通过构建基于犬细小病毒VP2蛋白氨基酸序列的系统发生树,发现在我国主要城市的宠物犬中流行的犬细小病毒CPV-2a亚型毒株单独构成一簇,并且与2008年的韩国分离株K001关系紧密,而与早期其他地区的犬细小病毒CPV-2a亚型流行株距离较远.这提示犬细小病毒流行株的变异具有某种时间和空间相关性.本研究对犬细小病毒流行株的主要衣壳蛋白VP2的编码蛋白进行遗传变异分析,为更好地预防和控制犬细小病毒提供基础.

肠道病毒A组山东地方株的基因型分布

为研究肠道病毒A组山东地方株的基因型及分子进化特征,本研究采集1998～2008年急性弛缓性麻痹(AFP)患者及2008年和2009年手足口病(HFMD)患者粪便标本,进行肠道病毒分离.来自HFMD病例的阳性病毒分离物进行肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CVA16)特异性逆转录-聚合酶链反应鉴定,随即选取部分阳性分离株进行VP1完整编码区核苷酸序列测定和分析.EV71和CVA16特异性引物阴性者以及来自AFP病例的阳性病毒分离物采用A组肠道病毒特异性引物进行VP1完整编码区核苷酸序列测定.所获得序列与其他A组各基因型代表株进行比较并构建系统发生树.共获得293株肠道病毒A组山东地方株,分别属于CVA4、CVA5、CVA10、CVA14、CVA16、EV71、EV76、EV90共8个基因型.各基因型内山东地方分离株跟原型株相比基因序列同源性较低,系统发生学分析显示肠道病毒A组山东地方株各血清型中与原型株亲缘关系较远,提示山东省存在不同基因特征的A组肠道病毒传播.

MicroRNA在病毒感染调控作用中的研究进展

MicroRNA(miRNA)是一类非编码的单链小RNA分子,长度约为19～25个核苷酸,具有转录后水平干扰基因表达的效应~([1,2]).

2009新甲型H1N1流感病毒病原学概述

流感病毒(Influenza virus)属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),流感病毒属,其基因组由8个分节段的单股负链RNA构成.当一种新的血凝素(Hemaggultinin,HA)抗原在人际间出现,人群普遍对其免疫力很低或无,且病毒可以在人际间传播的情况下,即可能造成新的流感大流行.

基于RSCU方法的EV71病毒VP1核酸序列的同义密码子的偏好性分析

肠道病毒71型(EV71)是小RNA病毒科肠道属成员,其感染主要引起手足口病,还可能引起严重的神经系统疾病,如脑炎、无菌性脑膜炎和脊髓灰质炎样的麻痹等~([1,2]).

本刊来稿需注意的一些常用规范

《病毒学报》投稿须知

《病毒学报》征稿简则

关于2009年流感大流行的几点思考

自1997年中国香港暴发H5N1禽流感疫情以来,国际社会一直担心H5N1禽流感会导致一次新的流感大流行,特别是2004年以后H5N1禽流感病毒在亚洲的广泛流行,并迅速蔓延到欧洲和非洲,H5N1所导致的动物疫情和人感染病例不断发生,特别是其超过60%的病死率加剧了各国政府和国际组织对其的担忧.十二年过去了,H5N1禽流感病毒仍然还没有导致一次新的流感大流行的发生,应该说十多年的时间肯定会导致越来越多的人怀疑其可能性,甚至有很多科学家提出流感大流行不会到来.