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乙型和丙型肝炎病毒蛋白对于细胞周期素A的调节研究
0引言细胞周期(cell cycle)是细胞分裂增生的经典概念,过去的研究主要集中在细胞周期的形态学描述上.随着细胞周期素(cyclin)和细胞周期素依赖性激酶(cyclin dependentkinase,CDK)的发现及其作用机制的研究进展,使得我们对于细胞周期调节有了分子生物学水平上的深入认识.细胞周期的分子生物学调节机制的研究,也促进了肿瘤形成的分子生物学机制的研究,同时对于肿瘤病毒(oncogenic virus)引起正常细胞的恶性转化机制的研究具有十分重要的促进作用.
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丙型肝炎病毒蛋白结合蛋白
0 引言丙型肝炎病毒(HCV)是1989年Choo et al应用分子生物学技术克隆成功的一个RNA病毒,属黄病毒科.可以引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌,目前全世界有1.7亿人感染,干扰素联合利巴韦林是其治疗药物,但是疗效不佳[1-9].目前正在积极研究其发病机制,探索新的治疗方案.HCV的宿主范围较窄,只能在人及黑猩猩中繁殖,为研究带来困难.目前机制的研究限于体外的细胞模型或转基因动物.HCV是怎样与宿主细胞相互作用的,世界上进行了广泛的研究,特别是HCV各蛋白组分(C、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b)[10 ]与人体蛋白之间的相互作用,为HCV所致疾病的发病机制提供了线索.
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乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒蛋白对亮氨酸拉链蛋白LZIP的调节
乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌(HCC)的发生密切相关.虽然HBV、HCV感染与肝细胞癌之间的关系已经得到确定,但是具体的分子生物学机制还有许多工作要做.其中肝炎病毒编码蛋白对于肝细胞基因组表达的反式调节作用,即肝炎病毒蛋白与肝细胞基因组启动子DNA结合,对于肝细胞基因表达谱产生影响,从而调节肝细胞的生长、代谢、凋亡及恶性转化,在病毒感染致病机制中起着重要作用[1-5].人碱性亮氨酸拉链蛋白LZIP是碱性亮氨酸拉链蛋白家族重要成员之一,在肝炎病毒致肝细胞癌发生过程中发挥重要作用.
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乙型和丙型肝炎病毒对转录因子Nur77的调节
O引言nur77又称为神经生长因子诱导的基因B(nerve growth factor-induced gene B,NGFI-B),是一种细胞核孤生受体(orphan nuclear receptor)转录因7蛋白,在多种细胞的信号转导、细胞周期、细胞凋亡的调节中具有十分重要的作用.乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的各种类型的慢性肝脏疾病,其发病机制主要是通过肝炎病毒蛋白对于细胞内正常的信号转导通路进行干扰,Nur77是肝炎病毒蛋白作用的靶分子之一.
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乙型和丙型肝炎病毒蛋白对14-3-3蛋自信号转导的影响
0引言乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染靶细胞之后,在完成自身复制和表达的生活周期的同时,所产生的病毒大分子,如肝炎病毒的DNA/RNA和蛋白分子等这些外源性大分子,对于肝炎病毒感染的靶细胞产生一系列不同的影响[1-7].肝炎病毒大分子对于感染靶细胞的这些影响是肝炎病毒感染后致病机制的主要组成部分.因此,研究乙型和丙型肝炎病毒的核酸成分和蛋白质成分对肝细胞的影响具有十分重要的意义.由于肝炎病毒蛋白的产生,改变了肝炎病毒靶细胞的正常的信号转导途径,引起细胞的病变,甚至是恶性转化,以至于发生肿瘤[8-13].14-3-3蛋白家族是细胞主要的信号转导相关蛋白因子,研究表明,肝炎病毒对于14-3-3蛋白家族所介导的信号转导也具有显著的影响.
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乙型肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究
0 引言随着基因组测序工作的完成,后面就是研究基因的功能,其中基因表达蛋白质的功能的研究尤为重要,因为基因是通过蛋白质起作用的.蛋白质与蛋白质之间的相互作用揭示了蛋白质功能的物理基础之一,即蛋白质起作用是通过与另一蛋白质进行物理接触而完成.大家知道乙型肝炎病毒(HBV),对人体有着广泛的作用,如引起人免疫紊乱、慢性肝炎、肝硬化、肝肿瘤发生,治疗效果不佳[1-9 ],但是他们是如何作用的目前不是太清楚,但是可以肯定其中具有蛋白质-蛋白质之间的相互作用.1990年代以来一系列遗传、生化方法特别是酵母双杂交技术等进展,为研究HBV与人体蛋白质之间的相互作用打下了基础.HBV有四个结构蛋白开放读码框架,S、C、P、X编码前-S1、前-S2、HBsAg、HBcAg、HBeAg、病毒多聚酶、和HBxAg,其中HBxAg作用复杂有反式激活作用[10].但是其结构中没有DNA结合域,推测可能和蛋白质之间的相互作用有关,研究比较多.其次是前-S1等.目前鉴定的与HBV相互作用的蛋白质有十几种
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乙型肝炎病毒蛋白反式激活基因的研究
0引言乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生、发展过程密切相关[1-5 ].病毒进入到肝细胞之后,肝炎病毒蛋白在肝细胞内不是孤立存在的,病毒基因组在肝细胞内具有两种调控方式:其一是顺式调节,如启动子及增强子序列,以直接方式影响另外一些基因组的功能,是基因组内部调节方式;其二是反式调节,即基因组中一部分基因片段通过其转录或翻译产物产生对另一部分基因片段表达的调节方式,如病毒基因组表达的反式激活蛋白,以其表达产物的间接方式参与另外一些基因的功能调节,可以对基因组内部的基因片段,甚至可以对另外细胞或病毒的基因组有调控作用.这种病毒蛋白对肝细胞基因组的反式调节作用,影响了肝细胞的基因表达谱,是病毒感染慢性化以及引起感染的肝细胞发生恶性转化的重要的分子生物学机制之一[6-8].
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乙型和丙型肝炎病毒蛋白对蛋白酪氨酸激酶信号转导的影响
0引言生物细胞每时每刻都在接触着来自细胞内或者细胞外的各种各样信号.信号只是个诱因,生理反应是信号作用于细胞的终结果.相同的信号作用于不同的细胞可以引发完全不同的生理反应;不同的信号作用于同一种细胞却可以引发出相同的生理反应.
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乙型和丙型肝炎病毒蛋白反式激活作用机制及其意义的研究进展
编者按乙型肝炎病毒(HBV)和丙肝炎病毒(HCV)感染不仅引起急性、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化(LF)、肝细胞癌(HCC)的发生、发展密切相关.
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乙型和丙型肝炎病毒与转录因子AP-1
0引言在慢性病毒性肝炎的发病机制中,病毒蛋白对肝细胞信号转导通路的影响是病毒感染以后形成慢性感染、肝纤维化、肝细胞癌的重要的分子生物学机制,对于慢性肝炎的预后也有重要意义.激活蛋白1(AP-1)对于病毒性肝炎的发病机制有重要意义,他先被发现作为一种转录因子通过佛波酯肿瘤启动子乙酸盐(TPA)介导金属硫蛋白Ⅱ基因的产生,因此他的识别位点被称为TPA响应元件(TRE)[1].之后发现AP-1活性可被许多其他的刺激剂包括生长因子、细胞因子、T细胞活化剂、神经递质和紫外线诱导产生[2].病毒性肝炎的病毒蛋白通过与AP-1的相互作用可以部分解释病毒感染发病的分子生物学机制.
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乙型和丙型肝炎病毒对JNK/SAPK转导途径的影响
0引言乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)的感染是世界范围内导致肝细胞癌(HCC)发生的主要危险因子,HCC在慢性病毒携带者中的危险性增加了100倍.像所有肿瘤的发生一样,病毒诱导HCC的发生是多步骤过程,宿主因素作为始动因素增加肝细胞的增生,随后恶性化.信号分子在信号转导过程中起到不可缺少的作用,常成为外源性蛋白的靶作用目标引起细胞正常生理活动的改变,如有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)系统的干扰往往引起细胞分化、增生、死亡的紊乱.目前所知MAPK超家族包含三条平行的MAPK级联反应:ERK、JNK/SAPK、P38MAPK途径,以高度保守的三级激酶级联的形式(MAPKKK-MAPKK-MAPK)转导信号,他们拥有各自的底物和调节蛋白激酶,接受不同的信号刺激引起特异的细胞效应,这些信息流之间的‘交谈'构成信号转导的网络,使细胞察觉到细胞外环境的变化做出适当的应答.JNK/SAPK信号转导途径主要对毒素、炎性细胞因子、紫外线照射、渗透压等应激信号进行转导,肝炎病毒蛋白作用于JNK/SAPK可对细胞的分化、增生等产生影响.
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乙型和丙型肝炎病毒蛋白对蛋白酪氨酸激酶信号转导的影响
0引言生物的细胞每时每刻都在接触着来自细胞内或者细胞外的各种各样信号.信号只是个诱因,生理反应是信号作用于细胞的终结果.相同的信号作用于不同的细胞可以引发完全不同的生理反应;不同的信号作用于同一种细胞却可以引发出相同的生理反应.细胞的一切生命活动都与信号有关,信号是细胞一切活动的始作俑者.因此,对信号转导的研究非常重要,非常有用.由于肝炎病毒可以影响细胞信号转导,引起细胞的病变及恶性转化[1],而蛋白酪氨酸激酶是重要的细胞信号转导激酶,因此深入研究二者的相互关系对肝炎病毒的发病机制会有进一步的了解.
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丙型肝炎病毒蛋白与脂蛋白之间的相互作用
0引言肝脏是脂蛋白代谢的中枢,当嗜肝病毒引起肝细胞炎症和坏死,势必会引起肝内生化代谢紊乱,包括脂质代谢障碍和载脂蛋白合成异常.丙型肝炎病毒(Hcv)与脂类代谢表现出更为密切的关系.
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乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒反式调节靶基因的抑制性消减杂交和基因芯片分析结果的比较
目的:筛选与克隆HBV和HCV蛋白反式调节靶基因,阐明HBV和HCV感染后慢性肝脏疾病的发病机制.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及表达谱基因芯片(cDNA microarray)技术筛选并克隆HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因.以HBV和HCV蛋白的表达质粒转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.同时进行表达谱基因芯片技术分析.结果:成功构建人HBV和HCV蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,对HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因同时进行基因表达谱芯片的分析.在SSH分析中,文库扩增后均得到200-800 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列.对于不同的肝炎病毒蛋白反式调节的靶基因类型,以及不同的分析技术研究的结果进行比较分析,发现了一系列的共同调节的靶基因,说明不同的肝炎病毒蛋白反式调节具有共同的作用途径.结论:筛选到的反式调节靶基因,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBv和HCV蛋白可能存在的调控机制,有助于阐明HBV和HCV蛋白的反式调节在慢性肝脏疾病的发生发展中的作用.
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应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因
目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因.方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:文库扩增后得到70个白色克隆,经菌落PCR分析,得到56个200-1 000 b插入片段.对所得片段测序,并进行同源性分析,获得6个差异表达的未知序列,可能是NS3反式激活的新的靶基因.结论:成功构建HCV NS3反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础.
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乙型肝炎病毒蛋白表型定义初探
目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分型方式,并根据病毒蛋白结构提出新的病毒蛋白分型方式.方法:自GenBank中按基因型搜索符合要求的HBV基因组序列,并应用Vector NTI suite 8.0版软件进行基因组核苷酸及各基因编码蛋白质序列比较,并利用软件分析前前-S基因、前-X基因和前-C基因的存在状态.结果:在GenBank中根据HBV基因型分型搜索出119个病毒株全基因组,比较后发现选择病毒株基因组核苷酸序列总阳性率和总一致率分别为95.7%和147.7%;选择病毒株编码的全C蛋白、全S蛋白、全X蛋白和多聚酶的总阳性率分别为98.6%、87.3%、57.2%和95.2%,总一致率分别为37.4%、24.1%、27.7%和43.5%.在病毒群中,33.61%的病毒株编码前前-S多肽,14.3%的病毒株编码前-X多肽,26.1%的病毒株不编码前-C多肽,94.1%编码前-X多肽的病毒株同时编码前前-S多肽.基因组1-700 nt一致率30.6%,1 103-1 653 nt一致率20.8%,为高变区;基因组1 654-1 950 nt的一致率为74.2%,为高保守区.4种病毒蛋白各有其相应的高变区和高保守区根据病毒蛋白前导性序列的变异情况提出新的分型方法,命名为蛋白表型.蛋白表型分7型,Ⅳ型为主要流行表型,占39.5%,V型和VⅦ型各占19.3%.亚洲HBV蛋白分型分布分散,Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅶ型所占比例均大于20%;欧洲Ⅳ型占58.3%,Ⅶ型占25.0%,Ⅴ型占13.9%.结论:在综合分析HBV基因组的基础上,初步划分出HBV基因组和病毒蛋白内部存在的高变区和高保守区提出蛋白表型的新概念,并综合展示基因核苷酸突变所导致的病毒蛋白的结构差异.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因10的克隆化研究
目的:丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白5A(NS5A)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质.为了探索HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因,我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析.研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物.以含有全长HCV-H株cDNA的pBRTM-3011质粒DNA作为模板,进行多聚酶链反应(PCR)扩增,将获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A.以pcDNA3.1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术(bioinformatics),克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因.结果:构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.以pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析.应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因,命名为NS5ATP10,新基因的编码基因序列全长为717个核苷酸(nt),编码产物由238个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV NS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白.微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术.发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为阐明HCV NS5A蛋白的反式激活作用及其机制,开辟了新的研究方向.
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丙型肝炎病毒NS2基因酵母双杂交"饵"载体构建及表达
目的:丙型肝炎病毒NS2蛋白在病毒蛋白加工中起到自裂蛋白酶的作用,但是对人体的作用还不清楚.为探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS2的功能,在真核生物酵母细胞中表达HCVNS2基因.方法:用聚合酶链反应(PCR)的方法以HCV全长质粒pBRTM/HCV-1为模板扩增HCV NS2基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Westem免疫印迹分析.结果:成功构建HCV NS2基因酵母表达载体称为pGBKT7-NS2,Western免疫印迹显示了HCV NS2在酵母细胞中表达.表达产物在胞内存在,相对分子质量23kD左右,表达量占细胞总蛋白的4%左右.结论:我们成功在酵母细胞中表达了HCV NS2蛋白.为以后研究NS2蛋白对人体的作用打下了基础.
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鼠肝炎病毒3型N蛋白Ⅰ区激活mfg12凝血酶原酶基因
目的:研究鉴定激活mfgl2凝血酶原酶基因之冠状病毒3型或A59型鼠肝炎病毒(MHV-3,MHV-A59)核心(N)蛋白的功能区域.方法:应用定点突变技术、与mfgl2启动子共转染实验明确mfgl2凝血酶原酶基因之MHV-3或MHV-A59 N蛋白的功能区域.N蛋白内含Ⅰ基因突变病毒株Alb 110和其野生株Alb 111体外感染Balb/cJ小鼠巨噬细胞、Ⅰ基因表达载体与mfgl2启动子共转染实验阐明Ⅰ蛋白在mfgl2基因激活中的作用.结果:N蛋白包含由两个可变间隔区(A,B)隔开的三个结构区(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ),MHV-A59N蛋白Ⅰ区可增强mfgl2转录活性,当其基因序列突变为非嗜肝性MHV-JHM或MHV-21区序列时,则丧失激活mfgl2启动子转录活性的功能.Ⅰ基因突变病毒株Alb 110和其野生株Alb 111体外感染Balb/cJ小鼠巨噬细胞后对mfgl2的激活无显著差异,共转染实验阐明Ⅰ蛋白并非mfgl2基因激活中的必备因素,该组mfgl2启动子转录活性与对照组无显著差异,而N蛋白可激活mfgl2启动子,使其转录活性提高62倍.结论:鼠肝炎病毒N蛋白Ⅰ区为激活mfgl2凝血酶原酶基因的病毒蛋白功能区域.
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HCV相关性神经系统病变
HCV感染常见且研究透彻的肝外表现(extrahepatic manifestations,EHMs)是冷球蛋白(cryoglobulin,CG)血症,约17%~60%病例通常在疾病起始阶段会出现外周神经病,约6%病例存在中枢神经系统(central nervous system, CNS)受累。除导致血管损伤以外,CG也是颈动脉斑块形成的独立危险因素。其他EHMs如非霍奇金氏淋巴瘤、糖尿病、甲状腺疾患、风湿病等,也可累及神经系统。HCV具有嗜神经性,CNS内可检测出HCV RNA的复制模板及病毒蛋白,HCV可致脑部免疫应答激活及代谢改变[1]。亦如大多数EHMs,HCV相关性神经系统病变也具有免疫学或风湿病学特性。已报道的HCV相关性CNS及神经肌肉病变见表1。