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一种适合肝细胞生长的无血清培养基
背景:寻找一种既能适合细胞生长又避免添加血清的培养基迫在眉睫,无血清培养应运而生.目的:探索一种适用于C3A 细胞生长的无血清培养基,为肝细胞用于临床治疗以及生物人工肝走入临床奠定基础.方法:分别用无血清培养基、完全培养基和基础培养基培养C3A 细胞,观察细胞的生长状态,绘制细胞生长曲线和活力曲线,全自动生化分析仪测定上清中谷丙转氨酶漏出量、尿素含量,放射免疫分析法检测白蛋白分泌量,实时荧光定量PCR检测基因水平的变化情况.结果与结论:3 种培养基培养的细胞生长良好,无血清培养基组与完全培养基组细胞密度在培养周期内,除第7 天以外差异无显著性意义(P > 0.05).培养第4~7 天,其他两组明显高于基础培养基组(P < 0.05);无血清培养基尿素合成水平>完全培养基>基础培养基(P < 0.05).Real-time qPCR 显示,无血清培养基组相对于完全培养基组仅CK18、CK19 和HNF4α基因表达量下降(P < 0.05).说明实验研制了一种适合于肝细胞(C3A)生长的无血清培养基,与传统血清培养能达到同样的效果.[
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普通PCR与巢式PCR检测生殖器疱疹病毒的对照
生殖器疱疹(GH)是由单纯疱疹病毒(HSV)引起性传播疾病(STD),GH典型表现临床上诊断并不困难,但对于不典型表现容易漏诊或误诊.HSV主要通过生殖器或肛门、呼吸道、口腔粘膜的分泌物传播.
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荧光定量PCR检测HCMC DNA的临床意义与探讨
本试验采用荧光定量聚合酶链反应(fluorescence quantitativePCR,FQ-PCR)法检测人巨细胞病毒(HCMV) DNA,并探讨其在HCMV感染诊断和治疗中的应用价值.
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应用荧光定量PCR检测急性白血病微小残留病的临床意义
对于完全缓解的白血病患者,体内存在的微小残留病(MRD)是复发的主要根源?本实验是通过双链DNA结合SYBR Green I的实时PCR方法应用免疫球蛋白重链(IgH)和T细胞受体(TCR)基因重排作为ALL微小残留病的检测靶基因,实验证明: MRD可以作为预后风险的一个独立指标.SYBR Green Ⅰ实时PCR是一种更适于临床应用的简单、快速、便宜、可行,特异性好、敏感性又高的技术方法.
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脑脊液抗体指数检测在儿童神经系统感染相关疾病中的应用
循证医学研究发现很多神经系统疾病与病毒感染之间存在一定相关性.随着临床检验技术的发展很多方法能证明这种关系,如PCR检测脑脊液中的病毒核酸、脑脊液中多种病毒AI的检测、外周血清转化与病毒在活化、PCR检测外周血病毒含量等[1,2].尽管目前研究认为脑脊液PCR检测是诊断的金标准[3,4],但是当出现病毒含量过低和(或)标本采集时机过早或过晚的情况下,PCR的方法极容易出现假阴性[5-7].而血清转化或血清阳性标记检测(如EBV感染时候出现的IgG-抗EA)是证明疾病与病毒之间存在因果关系的必要条件[8].而AI检测尽管其也存在着一些的不足(如抗体的产生要滞后于疾病)[1,9],但是由于其具备的许多优点(如对设备要求不高及费时较少等)还是得到了认可.本文针对国内对PCR检测病原报道较多而AI方法检测病原报道较少的现状,总结了2006.01-2009.12长春市儿童医院和吉林大学中日联谊医院诊断明确且进行AI检测的患儿的资料进行分析.
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多重PCR检测急性反复上呼吸道感染儿童病毒和非典型细菌
急性反复上呼吸道感染是住院儿童中常见的疾病.有报道其发病率占所有儿科住院病人的38%,5岁内儿童的63%[1].引起急性反复上呼吸道感染以细菌和病毒常见.目前诊断病毒感染的常见方法是取鼻咽抽吸物进行免疫荧光试验[2],该方法能诊断数种病原体,如A、B型流感病毒,1、2、3型副流感病毒,呼吸道合胞病毒以及腺病毒等.但此方法检出率低,仅20%左右.另一种方法是分离培养,缺点是耗时,对于难培养的病毒显得无能为力.自从流感病毒H1N1爆发以来,一种快速、高敏感性的诊断方法显得非常迫切.
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贵州省疟疾实验室诊断能力与疫情风险分析
目的 评价贵州省疟疾报告病例的实验室诊断情况、基层实验室诊断能力与疟疾疫情风险.方法 以贵州省近3年的疟疾疫情数据及省疾病预防控制中心疟疾实验室复核的血片和PCR检测结果进行实验室间比对分析.结果 贵州省疟疾疫情从2008年开始逐年下降,年报告发病率从2008年的3.43/10万降至2010年的1.04/10万.2009～2011年全省92.26％的网报病例进行了镜检,省级实验室对县级镜检的血片进行抽检,阴性片符合率达100％ (303/303),阳性片符合率达89.57％(103/115),镜检总体符合率为97.13％(406/418).县级实验室镜检阳性病例的滤纸血,采用PCR方法检测,阳性率为96.00％(24/25),镜检阴性的病例或临床诊断为疟疾、疑似疟疾和不明原因的发热病人滤纸血,经PCR检测,阴性率为98.92％(92/93),县级实验室镜检结果与PCR法检测结果的总体符合率为98.31％(116/118).结论 经省级实验室镜检复核和PCR方法比对,县级实验室镜检结果的可靠性较高,特别是阴性结果更为可靠,阳性结果有10％的误诊,因此全省各级疾病预防控制及医疗机构,应当依据实验室检测结果对网报病例进行订正.
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应用PCR方法检测SV40病毒基因
目的建立一种有效的SV40病毒基因检测方法.方法以SV40-776标准株DNA为模板,以针对SV40 3种抗原设计的3对引物进行各自的PCR扩增、克隆、测序,再以恒河猴全血DNA为模板,同样用以上3对引物进行各自PCR扩增,再以同样步骤克隆、测序.后以筛选得到的SV40PCR检测引物对147份猴血DNA进行检测.结果 3对引物中只有ST和RR引物可有效地从猴血中进行SV40基因片段扩增.用该引物对147份猴全血DNA检测结果表明,在猴群中SV40病毒的感染率较高.结论应用该方法检测SV40感染灵敏、简便、快速.
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锦州地区首例空调冷却塔水嗜肺军团菌的分离与鉴定
目的 对锦州市某大型宾馆的水质进行抽样调查,在空调冷却塔水样品中分离检测出嗜肺军团菌.方法 对采集的水样本进行分离培养嗜肺军团菌,通过菌落形态观察、血清凝集试验进行鉴定,并对水样本和分离到的菌株进行荧光PCR检测.结果 水样品培养后菌落形态符合嗜肺军团菌特征,血清凝集反应、水样本和分离的菌株荧光PCR检测结果均为阳性.结论 对锦州地区嗜肺军团菌的病原菌分离和鉴定方面积累了经验,为军团菌的应急防控提供快速检测支持.
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多房棘球蚴线粒体NADH脱氢酶1基因分析及PCR检测方法
目的 扩增多房棘球蚴线粒体NADH脱氢酶亚基1(NADH dehydrogenase subunit1,ND1)基因全序列,测序并进行同源性比较.建立检测多房棘球蚴感染的PCR方法,应用于人和动物感染多房棘球蚴的快速检测和鉴定.方法 根据多房棘球绦虫线粒体DNA全序列,设计引物扩增ND1基因并进行测序,获得多房棘球蚴ND1基因全序列.对该序列与其它常见棘球绦虫的ND1基因序列进行同源性分析.结果 多房棘球蚴线粒体ND1基因序列与国外报告的多房棘球绦虫的同源性达到98.8％,与细粒棘球绦虫的同源性为86.2％,与少节棘球绦虫的同源性为84.6％,与伏氏棘球绦虫的同源性为87.0％.结论 多房棘球蚴线粒体ND1基因与其他棘球绦虫相应基因存在显著差异.PCR方法可以用于多房棘球蚴感染的快速检测和鉴定.
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一段检测锥虫特异性核酸靶序列的筛选及评价
目的 以60S核糖体蛋白L44 (60S RPL44)基因为靶基因,筛选出一段可特异性检测锥虫属(Trypanosoma)原虫的核酸靶序列,并对其敏感度和特异性进行初步评价. 方法 将布氏锥虫指名亚种(T.brucei brucei)的60S RPL44基因序列与公共数据库中田鼠巴贝虫(Babesia microti)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(P.falciparam)和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)等24种非锥虫属常见的血源性原虫,以及8种锥虫属内其他种的同源序列进行比对.同时,利用Primer Premier 6对布氏锥虫指名亚种的60S RPLA4基因序列设计多对引物,结合序列比对结果和各引物评价情况,从中筛选出一对评价情况良好且理论上仅能扩增锥虫属靶序列的引物.利用该对引物检测布氏锥虫指名亚种、布氏锥虫罗德西亚种(T.b.rhodesiense)、刚果锥虫(T.congolense)、伊氏锥虫(T.evansi)以及上述5种其他属原虫,评价其特异性.采用梯度稀释(10 ng/μl、1ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl)的伊氏锥虫基因组DNA为模板评价其敏感度. 结果 选出一段基于60S RPLA4的特异性序列,针对该序列的扩增引物为P1:5'-CCT-GATGAAAGGTGCAATG-3',P2:5’-CGTTTTCGCCTTCTTGTGGA-3'.该引物扩增布氏锥虫指名亚种、布氏锥虫罗德西亚种、刚果锥虫、伊氏锥虫的DNA均为阳性,扩增片段长156 bp;扩增田鼠巴贝虫、杜氏利什曼原虫、间日疟原虫、恶性疟原虫、刚地弓形虫等非锥虫属原虫均为阴性;该引物检测伊氏锥虫DNA的敏感度为10 pg/μl.结论 筛选获得一段敏感度较高、特异性强的检测锥虫属原虫的核酸靶标序列.
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实时荧光定量PCR检测泌尿生殖道感染患者沙眼衣原体的临床应用
沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis,CT)是一种独立寄生于细胞内的微生物,含DNA和RNA,革兰染色阴性,只能在细胞内繁殖.CT是近年来常见的性传播疾病病原体之一,主要引起男女泌尿生殖道感染,因此也越来越受到人们的注意.随着荧光定量PCR技术的发展,该技术已广泛运用于临床.探讨PCR荧光定量技术在生殖道沙眼衣原体感染实验诊断中的实用价值.我们随机对2011年1月～3月来本院门诊治疗的600例泌尿生殖道感染沙眼衣原体状况进行了检测,现将其结果报告如下.
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肺孢子菌动物模型的建立及病原学和分子生物学检测技术研究
目的 建立肺孢子菌动物模型,并对肺孢子菌病原学和分子生物学检测技术进行研究.方法 SD和Wistar大鼠随机分为实验组和对照组,实验组大鼠皮下注射地塞米松,对照组皮下注射生理盐水.诱导8周后处死全部大鼠,收集其支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织,分别做涂片和肺印片,染色后镜检.用FTA卡采集所有大鼠的BALF进行PCR检测.对PCR产物进行测序,利用BLAST软件将测序结果与GenBank数据库中的鼠源性肺孢子菌进行比对,确定菌种.结果 共采集肺组织标本和BALF各34份,病原学检测显示实验组总感染率为29.2％ (7/24),对照组感染率为0;其中SD和Wistar大鼠实验组感染率分别为25.0％(3/12)和33.3％(4/12),差异无统计学意义(P=0.31);实验组SD大鼠肺印片和BALF肺孢子菌阳性检出率分别为25.0％(3/12)和16.7％(2/12),差异无统计学意义(P=0.34).实验组Wistar大鼠肺印片和BALF肺孢子菌阳性检出率分别33.3％(4/12)和16.7％(2/12),差异无统计学意义(P=0.24).用PCR方法共检测28份大鼠BALF样本,实验组阳性检出率为91.7％(26/28),对照组均为阴性.对PCR产物进行测序分析,发现其与GenBank已登录的大鼠源肺孢子菌(JX499145、GU133622、EF646865)的同源性均为100％.结论 通过皮下注射地塞米松可以建立肺孢子菌动物模型,SD大鼠与Wistar大鼠在作为肺孢子菌动物模型的选择上无显著差别.在早期感染阶段,适宜用PCR法进行肺孢子菌检测,病原形态学检测漏检率高.
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溶脲脲原体感染与中国男性不育关系的Meta分析
目的:探讨溶脲脲原体感染与中国男性不育的关系. 方法:根据资料一致性检验结果,采取随机效应模型,对检索到的49篇有关溶脲脲原体感染与中国男性不育的文章利用RevMan 4.2.2进行综合定量分析.比较采取不同样本量大小对研究结论的影响,同时分别分析培养检测和PCR检测的灵敏度. 结果:溶脲脲原体感染与中国男性不育有明显关系,按不同样本量纳入文献,第1次结论为OR=4.43(95%CI:3.77～5.22);培养变色检测和PCR检测的OR值分别为4.25(95%CI:3.59～5.03)和5.35(95%CI:3.37～8.47);第2次结论OR=4.28(95%CI:3.52～5.20);培养变色检测和PCR检测的OR值分别为4.24(95%CI:3.41～5.28)和4.42(95%CI:2.73～7.17). 结论:溶脲脲原体感染和中国男性不育有明显关系;样本量大小对研究结论有明显影响,应合理设计试验样本量;PCR检测比培养检测具有更高的灵敏度.
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外源嵌合基因gtfB-ctxB在T2、T3、T4代防龋用转基因生菜植株中的遗传稳定性
为了观察培育的外源嵌合基因gtfB-ctxB转基因生菜(防龃齿转基因生菜)传代生长情况,初步探索gtfB-ctxB基因在生菜中遗传的稳定性.田地种植T2、T3、T4代外源嵌合基因gtfB-ctxB生菜植株36,64,40株.在不同生长时期,随机选取植物不同组织部位为样本,用聚合酶链式反应技术检测gtfB-ctxB.T2、T3、T4代转基因生菜中均含有外源嵌合基因gtfB-ctxB,并且每代生菜中转基因生菜所占比例基本一样,都超过50％,其中T2代24株,T3代43株,T4代27株.并且3个连续世代植株阳性率间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).gtfB-ctxB外源基因在生菜下代中能高效表达,并且具有很好的遗传稳定性.
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改良碱裂解法和煮沸法提取金黄色葡萄球菌DNA效果的比较
目的:建立一种简便经济的金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法.方法:选取10株耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌,预先以终浓度2 mg/mL溶菌酶处理6 h,再以改良碱裂解法提取细菌基因组DNA.同时以常规煮沸法制备上述细菌基因组DNA.采用PCR法扩增两种模板中金黄色葡萄球菌spa基因、mecA基因和femB基因,比较两种方法提取DNA的效果.结果:以改良碱裂解法制备DNA为模板,所有10株标本均可扩增出spa基因和mecA基因,4个标本扩增出femB基因;以直接煮沸法制备DNA为模板,仅1个标本扩增出spa基因,2个标本扩增出mecA基因,所有标本未扩增出femB基因.结论:改良碱裂解法提取基因组DNA效果优于直接煮沸法,所提取基因组DNA可以满足PCR扩增的要求.
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石蜡包埋组织中结核菌抗酸染色与PCR检测意义的探讨
对61例拟诊为结核病和10例正常胎儿肺组织的石蜡包埋组织分别进行组织化学方法(抗酸染色)和PCR检测结果,结核组61例中,抗酸染色阳性28例,阳性率为45.9%;PCR检测阳性40例,阳性率为65.6%.两种方法阳性检出率差异显著(P＜0.005).对照组10例,两种方法检测均为阴性.结果表明,PCR检测石蜡组织中的结核菌,具有较高的灵敏度和特异性.
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儿童急性呼吸道感染标本b型流感嗜血杆菌PCR检测分析
b型流感嗜血杆菌(Hib)是引起儿童侵袭性感染的重要致病菌,常引起脑膜炎、肺炎、败血症,其发病率高,致死率高[1].本病遍布世界各国,在小儿中每年由Hib引起的严重病例至少300万例,死亡40～70万例,以4个月～18个月龄儿童发病率高,3个月以下的婴儿和6岁以后的儿童发病减少[2].20年来我国死亡原因分析表明,肺炎和脑膜炎是我国儿童致死和致残的主要原因[3].本文对PCR技术检测Hib与常规培养鉴定方法进行比较,现将结果报道如下.
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ATA,ADA和PCR在结核性腹膜炎的应用探讨
目的 分析腹水结核抗体(ATA), 腺苷脱氨酶(ADA)和聚合酶链反应(PCR)在结核性腹膜炎(tuberculous peritonitis TBM)的检测意义,提高结核性腹膜炎的早期诊断.方法 回顾分析52例结核性腹膜炎的诊断,通过对结核性腹膜炎和非结核性腹膜炎腹水ATA, ADA和PCR检测, 分析腹水ATA,ADA和PCR在结核性腹膜炎的检测意义.结果 在52例结核性腹膜炎中,腹水ATA阳性43例,阴性9例;腹水PCR阳性21例,阴性31例;腹水ADA(>45 U/L为阳性) 阳性39例,阴性13例.在38例非结核性腹膜炎中,腹水ATA:阳性5例,阴性33例;腹水PCR:阳性2例,阴性36例;腹水 阳性4例,阴性34例.腹水PCR,ADA,ATA的检测在结核性腹膜炎中,敏感性依次分别为40.3%,75%,82.7%,有较高的敏感性和特异性.结论 腹水PCR,ACA,ATA在结核性腹膜炎的早期诊断中有重要的意义,值得推广.
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人乳头状瘤病毒监测在宫颈疾病诊断中的意义
19世纪70年代左右,有学者提出了人乳头状瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌之间具有相关性.Bosch和Manos等[1]通过收集来自22个国家的宫颈癌活检标本作PCR检测,发现99.7%的肿瘤中都可以检测到HPV-DNA.全球女性年龄标准化感染率为10.5%[2].本研究旨在探讨宫颈癌患者血液中人乳头瘤病毒(HPV)检出率对宫颈疾病的诊断及病情进展评价的临床意义.
