施万细胞对丙烯酰胺致背根神经节感觉神经细胞损伤的保护作用

目的 研究施万细胞(Schwann cells,Scs)在丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)致感觉神经细胞损伤过程中的保护作用.方法 体外原代培养并纯化大鼠Scs和背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)感觉神经细胞,并使用插入式培养皿进行两种细胞的混合培养,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度的ACR对神经细胞的损伤作用并验证Scs的整体保护作用,检测在单独和混合培养条件下神经细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率的变化,并应用钙离子荧光指示剂Fura-2/AM测定ACR作用后两种培养条件下神经细胞内钙离子浓度.结果 MTT试验检测到ACR对DRG感觉神经细胞的半数抑制浓度(IC50)约为85μg/ml.在此浓度下,混合培养的神经细胞的相对存活率高于单独培养组,LDH释放率低于单独培养组,且均有统计学意义(P<0.05).ACR染毒浓度为20μg/ml时,混合培养的神经细胞内钙离子浓度显著低于单独培养组.结论 ACR对DRG感觉神经细胞具有明显的毒性作用,而Scs在ACR致感觉神经细胞损伤过程中具有一定保护作用.

1-09 间接致癌物对肝细胞DNA的损伤

目的二甲基亚硝胺(NDMA)和氯乙烯(VC)这两种间接致癌物需经肝实质性细胞(PC)活化后才具有致DNA损伤作用.为验证经肝PC活化代谢的NDMA物中间活性产物能否"传递”给肝非实质性细胞(NPC),引起后者DNA损伤.方法应用单细胞微量凝胶电泳技术对NDMA和VC的DNA损伤作用进行了研究.实验程序:(1)程序1:NPC和PC分别暴露不同浓度的NDMA或VC中,然后作DNA测试;(2)程序2:先将NPC装入透析袋中,浸没于含不同浓度NDMA或VC的PC悬液中,混合培养后,作DNA测试.结果 NDMA和VC对肝PC的DNA损伤作用具有明显的剂量-效应关系.NPC单独暴露NDMA或VC中无明显的DNA损伤作用,但NPC与PC混合培养并暴露NDMA或VC中时,均出现DNA损伤作用.结论经过PC活化代谢后的NDMA或VC的中间活性产物可进入透析袋内作用于NPC,引起后者DNA损伤.本实验结果有助于解释起源于肝内皮细胞的肝血管肉瘤的产物机制.

混合培养对骨髓基质细胞转分化为神经元的影响

目的研究神经干细胞(NSCs)与骨髓基质细胞(BMSCs)混合培养对骨髓基质细胞转分化为神经元的影响.方法将BMSCs传代培养2 d,10μg/L bFGF预诱导过夜,DAPI标记后加入到已贴壁分化2 d的NSCs中,神经元培养基混合培养7 d后进行神经元特异性烯醇化酶(Nse)染色.对照组于BMSCs传代2 d后,一组加bFGF处理过夜,另一组不加,神经元培养基培养7 d后NSE染色.结果实验组中部分BMSCs呈NSE染色强阳性,比例为(13.38±5.79)%,对照组呈NSE阴性结论NSCs与BMSCs混合培养可诱导BMSCs转分化为神经元.

内毒素致肝损害中库普弗细胞的作用及大承气汤的调节

目的:探讨库普弗细胞(KC)在内毒素脂多糖(LPS)所致肝细胞(HC)损伤中的作用并观察中药大承气汤的调节作用.方法:以胶原酶体内循环灌注结合体外胰蛋白酶加皿内消化方法分离高纯度的HC和KC,以3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TDR)掺入法测定HC的DNA合成及KC和LPS对HC的影响并观察中药大承气汤的调节作用.结果:低剂量的LPS能使HC的DNA合成轻度增加,到1mg/L时出现明显增加,但LPS剂量再加大,则出现DNA合成的抑制.LPS刺激不能使HC产生TNF;但能刺激KC分泌TNF,且随着刺激浓度增加,KC分泌TNF增加.在没有LPS存在下,KC对HC无明显影响;LPS对与KC混合培养的HC的DNA合成呈现明显的抑制性作用,而且随着LPS浓度加大,这种抑制作用愈加明显.当HC培养液中LPS量逐渐升高时,上清液中谷丙转氨酶(ALT)和乳酸脱氢酶(LDH)含量亦随之升高,细胞内酶逸出增多;当LPS浓度达到1000μg/mL的高浓度时,可见ALT和LDH不仅不见增高,反而明显减少.精制中药大承气汤能明显逆转HC DNA合成的受抑状态.LPS能激活肝KC释放TNFa,大承气汤对KC释放TNF有明显抑制作用,减低HC培养上清液中ALT和LDH含量,减少酶的逸出.结论:内毒素LPS对单独培养HC的DNA的合成呈双相影响;LPS对HC功能具有直接损伤作用.LPS可刺激肝脏的KC释放TNF,加剧LPS所致HC功能损伤.中药大承气汤能对KC功能进行正确调控,对HC功能具有双重保护作用.

同化培养液双界面法培养纯化的视网膜神经节细胞

视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)具有高度分化性,生后一般不再进行有丝分裂,RGCs体外培养属于原代培养;RGCs体外混合培养多能存活4周,而纯化培养大多只能存活48 h.我们采用星形胶质细胞同化培养液双界面法培养纯化的RGCs存活时间≥2周,为纯化RGCs提供较好的实验模型.

人眼睫状突无色素上皮细胞的分离和培养

房水是维持眼内压的基础,房水的产生由睫状突上皮完成.睫状突上皮包括色素上皮、无色素上皮细胞两层结构,其均为单层且其间联接紧密,因此难以分离纯净的两种细胞,并进行体外培养.以往多为混合培养,近年来随着组织分离及细胞培养技术的成熟和发展,国外学者开始对其进行研究[1-3].

蜂胶涂膜抗乳牙人工龋的体外研究

采用混合培养变形链球菌和远缘链球菌形成体外致龋环境的方法,造成乳牙人工龋,选用蜂胶涂膜观察其对乳牙人工龋的预防效果,并与氟保护漆进行对比,为临床应用天然蜂胶制剂作为防龋药物提供理论依据.

新生SD大鼠大脑皮层神经元与星形胶质细胞的混合培养

酪酸梭菌的抑菌作用研究

目的:研究酪酸梭菌对肠出血性大肠杆菌、痢疾志贺菌、霍乱沙门菌、霍乱弧菌等肠道致病菌以及婴儿双歧杆菌的抑制作用.方法:先将酪酸梭菌、痢疾杆菌等分别进行单独培养,测定不同培养时间内的pH值和活菌数,然后将酪酸梭菌分别和致病菌进行混合培养,再测量pH值和活菌数,并与单独培养时的测定情况进行比较.结果:酪酸梭菌对婴儿双歧杆菌无抑制作用,对肠出血性大肠杆菌、痢疾志贺菌、霍乱沙门菌、霍乱弧菌均有显著的抑制作用.结论:酪酸梭菌对肠道致病菌有显著的抑制作用.

不同诱导条件对体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响

目的:已证实骨髓间充质干细胞体内移植能改善心脏功能,但其机制尚不清楚.观察不同诱导条件对骨髓间充质干细胞体外分化为心肌样细胞的影响.方法:实验于2005-05/2006-04在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成.①实验材料:健康供体骨髓(自愿捐赠),孕16周水囊引产胎儿(胎儿家属同意捐赠).②实验方法:取健康供体骨髓,采用淋巴细胞分离液并结合骨髓间充质干细胞贴壁特性分离细胞.取第4代骨髓间充质干细胞进行诱导实验,分为生物诱导组和化学诱导组.生物诱导组分别采用胚胎心肌细胞与骨髓间充质干细胞直接混合培养、胚胎心肌细胞与骨髓间充质干细胞间接混合培养及胚胎心肌细胞匀浆液诱导培养,化学诱导组用5,10,15 μmol/L 5-aza分别处理12,24,48 h进行诱导.③实验评估:采用免疫细胞荧光染色法检测胞浆中的肌节肌动蛋白.结果:①骨髓间充质干细胞只有在其与胚胎心肌细胞直接混合培养时,才能分化为心肌样细胞,而在其他生物诱导模型下却未见其分化为心肌样细胞.②化学诱导组骨髓间充质干细胞经免疫细胞荧光染色鉴定后,均未见胞浆中有肌节肌动蛋白表达,证实经5-aza诱导处理后,未见骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞.结论:①胚胎心肌细胞可诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞,机械因素是促进骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞必不可少的因素之一.②骨髓间充质干细胞经5-aza诱导是否分化为心肌样细胞未能获得证实.

两份人脐血间充质干细胞混合培养及向神经元样细胞的分化

背景:脐血间充质干细胞可诱导分化为神经样细胞,但在临床中发现干细胞培养细胞增殖的数量不足.目的:观察两份脐血间充质干细胞混合培养的生长情况,以及经碱性成纤维细胞生长因子诱导脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化.设计、时间及地点:于2007-01/10在郑州大学基础医学院微生物与免疫学实验室完成以细胞为对象的对照观察性实验.材料:健康分娩产妇自愿捐献的脐血60~180mL.方法:应用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液以密度梯度法获取脐血间充质干细胞,加入碱性成纤维细胞生长因子诱导分化.当细胞传至第3代时,随机取培养的6份脐血间充质干细胞(半量)为A组,6份脐血间充质干细胞(半量)为B组,将A、B组各剩余的半量脐血间充质干细胞混合为C组.3组细胞密度均为1.0×104 L-1.主要观察指标:以活细胞计数和MTT比色法比较3组细胞扩增数量,免疫组织化学检测脐血间充质干细胞神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白的表达.结果:活细胞计数和MTT比色检测显示,将两份不同脐血间充质干细胞混合后,细胞贴壁比单份脐血间充质干细胞快(P＜0.05),增殖也非常快(P＜0.05).3组细胞经碱性成纤维细胞生长因子诱导后均表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白,并且巢蛋白阳性表达率无差别(P＞0.05).结论:混合脐血间充质干细胞之间有互相促增殖作用,应用碱性成纤维细胞生长因子诱导的脐血间充质干细胞可表达神经胶质细胞标志物、神经元特异性烯醇化酶和巢蛋白.

血管化人工骨的体外构建和体内异位成骨

背景:血管化在骨形成和改建中起重要作用,目前大的组织块难以获得充足的氧气和营养供应,因此组织工程中就出现了需要适当血管化的问题.目的:建立体外血管化人工骨模型并且体内异位成骨的实验体系.方法:分离培养鼠骨髓间充质干细胞和肾血管内皮细胞,体外构建鼠骨髓间充质干细胞和鼠肾血管内皮细胞直接接触培养血管化人工骨组,以间接接触三维培养体系和两种细胞单独培养体系作为对照.体外通过测定蛋白质含量,碱性磷酸酶活性和骨钙素,分析骨髓间充质干细胞在不同混合培养模型中的成骨能力.建立鼠骨髓间充质干细胞和肾血管内皮细胞的三维培养体系,再将两种细胞直接接触组材料和骨髓间充质干细胞单独培养组的材料分别植入鼠左右腿肌肉内,通过软X射线摄影和苏木精-伊红染色检测分析不同植入方法的血管形成和成骨能力.结果与结论:当两种细胞混合培养时,具有很好的细胞兼容性.两种细胞单独培养碱性磷酸酶活性和骨钙素较间接接触混合培养降低,而两种细胞混合培养时,体系中碱性磷酸酶活性和骨钙素水平增加.动物实验结果显示在混合培养体系中的骨髓间充质干细胞的成骨能力高于单独培养(P < 0.05).体内实验表明在血管化人工骨中的软X射线骨密度,血管数量和新形成的骨量均高于对照组(P < 0.05).提示在两种细胞混合培养时骨髓间充质干细胞的成骨能力可以被细胞因子和细胞膜蛋白质调节,和传统的人工骨比较,血管化人工骨有加速骨髓间充质干细胞分化,增加了局部的血管微循环生存率,以及加速成骨和更好的抗感染能力.

滑膜间充质干细胞与软骨细胞三维条件下混合培养向软骨细胞的分化

背景：软骨细胞通过自分泌及旁分泌的作用可以为滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化提供所需的生长因子及微环境，三维条件下更有利于细胞的黏附增殖与分化。
　　目的：观察滑膜间充质干细胞与软骨细胞混合培养于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料中向成软骨细胞分化的能力。方法：取SD大鼠滑膜组织及软骨组织，用酶消化法获得滑膜间充质干细胞及软骨细胞分别进行培养。取第3代滑膜间充质干细胞及第2代软骨细胞，将二者以1∶2的比例混合培养负载于壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料21 d，进行激光共聚焦扫描及免疫组织化学检测。
　　结果与结论：培养72 h后，扫描电镜观察细胞黏附于支架材料表面，并可见细胞分泌大量基质成分。培养21 d后，激光共聚焦扫描可见细胞在支架表面分布均匀，逐层扫描后细胞逐渐减少。免疫组织化学检测可见基质能被Ⅱ型胶原染色，细胞染色呈现棕黄色。结果表明壳聚糖/Ⅰ型胶原复合支架材料提供三维生长空间，利用软骨细胞分泌生长因子及细胞间的相互作用可以诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化。

脂肪间充质干细胞对J774.1细胞的免疫调控

背景：近期研究发现脂肪间充质干细胞针对T细胞、B细胞和树突状细胞均有抑制免疫反应的能力，但对于其是否可以对巨噬细胞起到相应的免疫调控能力还不清楚。
　　目的：观察脂肪间充质干细胞与J774.1细胞共培养后白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达。
　　方法：将脂肪间充质干细胞按照2×107/孔分别接种于transwel 的上层小室和24孔板中，再利用含1 mg/L脂多糖的培养液重悬J774.1细胞，将J774.1细胞接种到含脂肪间充质干细胞的transwel 下层小室和24孔板中，同时设立未激活J774.1细胞阴性对照组和脂多糖激活J774.1阳性对照组。培养48 h收集细胞样，提取RNA样本，荧光定量PCR法检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA 水平。
　　结果与结论：相对于单纯脂多糖激活的阳性对照组J774.1细胞，脂肪间充质干细胞与J774.1细胞的接触型混合培养可以明显降低J774.1细胞的白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达量，而非接触共培养组中，只有白细胞介素6 mRNA 水平发生了明显的降低。以上结果表明脂肪间充质干细胞具有抑制脂多糖激活 J774.1细胞的免疫反应的能力。

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Matrix- mixed culture: new methodology for chondrocyte culture and preparation ofcartilage transplants.J Biomed Mater Res 2000 Mar 5;49(3):305- 311 基质混合培养 : 软骨细胞培养和软骨移植物制备的新方法

凝结芽胞杆菌TBC 169株对肠道致病菌的抑菌作用

目的研究凝结芽胞杆菌TBC 169株对大肠埃希菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌、普通变形杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用.方法先将大肠埃希菌、痢疾杆菌等6种菌分别进行单独培养,测定不同培养时间内的pH和活菌数,然后将凝结芽胞杆菌TBC 169株分别和致病菌进行混合培养,再测pH和活菌数,并与单独培养时的测定情况进行比较.结果凝结芽胞杆菌TBC 169株对大肠埃希菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌等6种菌均有明显的抑制作用,尤其是对伤寒沙门菌和铜绿假单胞菌的抑制作用更强.结论凝结芽胞杆菌TBC 169株对肠道致病菌有显著的抑制作用.

一株功能性益生菌FQ15生物学特性的研究

目的 研究一株新分离的功能性益生菌FQ15的生物学特性.方法 通过药敏试验研究FQ15对21种抗生素的耐药性;同时,利用耐酸、耐受胆盐等抗逆性实验确定其是否具备功能性的基本要求,后采用平板抑菌实验研究FQ15对8种常见致病菌是否具有抑菌效果,并通过混合培养方法,确定其对致病性大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌的拮抗作用.结果 FQ15对7种常见的抗生素有耐药性,在pH不低于3.0的环境下能够正常的生长,能够耐受0.1%～0.7%浓度的胆盐,对8种常见致病菌均具有很好的抑菌效果,并且在与致病菌混合培养中36 h内可以彻底清除金黄色葡萄球菌,48 h内可以完全消灭大肠埃希菌.结论 新分离的功能性益生菌FQ15具有良好的生物学特性,而且对临床常见的病原菌具有较强的体外抑制作用.

烤瓷冠修复初期表面细菌黏附的实验研究

目的:分析烤瓷冠修复初期变形链球菌(Ua)、内氏放线菌(An)和牙龈卟啉单胞菌(Pg)在修复体表面黏附的先后顺序和定植数量,为临床上选择合适的修复体和尽可能减少细菌在修复体表面附着和定植提供参考.方法:将烤瓷材料制作完成并逐级打磨抛光后,和釉质一起放入分别含有上述3种细菌的混合培养基中厌氧培养,在6、12和24 h3个时间段,分别定量检测试件表面黏附的细菌数量以及液体培养基中的细菌数量,采用SPSS6.0软件包对数据进行统计学处理.结果:2种试件表面及液体培养基中均未检测到Pg.前6h,Ua/An在2组试件表面的附着烤瓷组少于釉质组:12h后,An在烤瓷表面增加快,釉质次之;24h后,烤瓷组和釉质组的Ua/An几乎无变化.结论:3种细菌混合培养时,Pg受到强烈抑制.烤瓷修复初期,不需考虑对牙龈卟啉单胞菌的抑制.如要抑制Ua/An,对烤瓷修复体而言,前12h是关键期.烤瓷冠是可优先选择的良好修复体.

常用口腔修复材料表面细菌黏附的实验研究

目的:分析冠修复初期口腔常见菌种在修复体表面黏附和定植的数量,为临床选择合适的修复体和尽可能减少细菌在修复体表面附着和定植提供参考.方法:将烤瓷、钻铬合金逐级打磨抛光后,与釉质一起放入分别含有变形链球菌(Ua)、内氏放线菌(An)和牙龈卟啉单胞菌(Pg)的混合培养基中作厌氧培养,在6h、12h和24h 3个时间段,分别定量检测试件表面黏附的细菌数量以及液体培养基中的细菌数量,采用SPSS6.0软件包对结果进行F检验.结果:3种试件表面及液体培养基中均检测不到Pg,烤瓷组和釉质组黏附的细菌少于钴铬合金组.前6h,Ua/An在3组试件表面的附着相同;12h后,An在钻铬合金表面增加快,烤瓷次之,釉质慢;24h后,Ua在钴铬合金组表面多,在烤瓷和釉质组表面的黏附情况相似,An在钴铬合金组表面增加快,烤瓷组和釉质组的Ua/An几乎没有变化.结论:3种细菌混合培养时,段受到强烈的抑制.如要抑制Ua的附着和定植,对于钴铬合金修复体,前6h是关键期.而对于烤瓷修复体,前12h是关键期.如要抑制An的附着与定植,对于钴铬合金修复体,前24h是关键期,对于烤瓷修复体,前12h是关键期.烤瓷修复体优于钴铬合金修复体.

阿萨希毛孢子菌对单核细胞产生细胞因子影响的研究

毛孢子菌(Trichosporon spp.)是一种机会致病真菌,可引起皮肤局限性及系统性感染.近年来国外有关该菌在免疫缺陷和肿瘤患者中引起播散性感染的报道逐渐增多[1,2],但也有报道由该菌所致的播散性毛孢子菌病患者无免疫性或肿瘤疾患存在[3].肿瘤坏死因子α(TNF-α)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素10(IL-10)是单核细胞抗感染中产生的细胞因子,具有行多种生物学活性.本实验通过阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)与人单核细胞的混合培养,观察该菌对单核细胞产生TNF-α、GM-CSF、IL-10的影响,以探讨细胞因子在阿萨希毛孢子菌致播散性毛孢子菌病感染中的作用.