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丙烯酰胺对施万细胞源性神经生长因子及受体的影响
目的 探讨施万细胞(Schwann cells,Scs)源性神经生长因子(nerve growth factor,NGF)及其受体(TrkA、P75)在丙烯酰胺(acrylamide,ACR)所致运动神经元损伤及损伤后自然修复过程中的变化.方法 原代培养大鼠Scs,插入式混合培养Scs与运动神经元VSC4.1,ACR(终浓度为40 μg/ml)染毒24 h,染毒后去除毒物暴露24 h,建立ACR损伤及损伤后自然修复的细胞模型；Western-blot和RT-PCR分别检测混合培养体系中Scs所分泌的NGF及其受体TrkA、P75的蛋白和mRNA水平变化.结果 ACR对混合培养体系内的运动神经元VSC4.1具有明显细胞毒性,细胞形态损伤显著,去除ACR暴露后损伤减轻；与对照组相比,ACR染毒24 h及自然修复24 h,NGF蛋白含量显著增加(P＜0.05),ACR染毒24 h后P75含量减少(P＜0.05),修复24 h,P75的含量变化不显著(P＞0.05),未检出TrkA蛋白表达；与对照组相比,ACR染毒24 h,NGF mRNA、TrkA mRNA、P75 mRNA表达水平显著升高(P＜0.05)；修复24 h,NGF mRNA表达水平无明显改变(P＞0.05),TrkA mRNA、P75 mRNA水平显著降低(P＜0.05).结论 施万细胞源性NGF在ACR对运动神经元VSC4.1损伤及修复过程中与其受体结合,通过正负反馈调节发挥一定的神经元保护作用.
关键词： 施万细胞 丙烯酰胺 运动神经元VSC4.1 神经生长因子及其受体 -
施万细胞对丙烯酰胺致背根神经节感觉神经细胞损伤的保护作用
目的 研究施万细胞(Schwann cells,Scs)在丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)致感觉神经细胞损伤过程中的保护作用.方法 体外原代培养并纯化大鼠Scs和背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)感觉神经细胞,并使用插入式培养皿进行两种细胞的混合培养,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度的ACR对神经细胞的损伤作用并验证Scs的整体保护作用,检测在单独和混合培养条件下神经细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率的变化,并应用钙离子荧光指示剂Fura-2/AM测定ACR作用后两种培养条件下神经细胞内钙离子浓度.结果 MTT试验检测到ACR对DRG感觉神经细胞的半数抑制浓度(IC50)约为85μg/ml.在此浓度下,混合培养的神经细胞的相对存活率高于单独培养组,LDH释放率低于单独培养组,且均有统计学意义(P<0.05).ACR染毒浓度为20μg/ml时,混合培养的神经细胞内钙离子浓度显著低于单独培养组.结论 ACR对DRG感觉神经细胞具有明显的毒性作用,而Scs在ACR致感觉神经细胞损伤过程中具有一定保护作用.
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施万细胞在周围神经损伤修复中可能的分子机制
施万细胞(schwann cells Scs)是周围神经系统中特有的一类神经胶质细胞,它包绕周围神经的轴突,是周围神经的成髓鞘细胞.根据功能定位Scs分为4类:成髓鞘Scs、非成髓鞘Scs、卫星Scs和终板Scs [1].Scs的功能非常活跃,在维持周围神经功能及损伤修复过程中发挥重要的作用.近些年的研究表明,周围神经受损后,Scs能够反应性的分裂增殖,分泌营养因子、细胞外基质和细胞黏附分子,为周围神经的再生提供适宜的微环境.因此Scs作为神经损伤修复的关键因子,也逐渐成为目前神经毒理学领域的研究热点(图1).
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丙烯酰胺对大鼠施万细胞相关功能蛋白表达的影响
目的 探讨施万细胞相关功能蛋白:髓磷脂相关糖蛋白(MAG)、神经生长因子(NGF)、p75神经营养素受体(p75NTR)及神经细胞黏附分子(NCAM)在丙烯酰胺所致周围神经损伤及修复过程中的变化;通过比较坐骨神经和外周血中相关功能蛋白变化的相关性.方法 Wistar大鼠随机分为低(n=12)、中(n=12)、高(n=22)丙烯酰胺染毒组(7.5、15和20 mg/kg)和生理盐水对照组(n=22),腹腔注射染毒3周,建立周围神经损伤动物模型.染毒结束后,对照组及高剂量组中各留5只大鼠继续饲养4周,观察周围神经损伤后的恢复情况.Western blot法检测各组大鼠坐骨神经中MAG、p75 NTR、NGF和NCAM蛋白的表达水平,ELISA法检测染毒期末及恢复期末血浆MAG的含量.结果 (1)丙烯酰胺染毒大鼠出现周围神经损伤体征且雌性动物更为显著,恢复4周后症状可缓解.(2)坐骨神经相关功能蛋白变化:与对照组比较,中、高剂量丙烯酰胺组MAG含量减少(P＜0.05),恢复组MAG含量变化不显著;高剂量丙烯酰胺组的p75NTR含量较对照组显著升高(P＜0.05),恢复组p75 NTR含量略有上升,且在雌性组有统计学差异(P＜0.05);NGF含量在雄性各染毒组间变化不显著,雄性恢复期染毒组大鼠NGF含量显著升高(P＜0.05);雄性高剂量丙烯酰胺组的NCAM含量显著增加(P＜0.05),雄性恢复期大鼠NCAM含量略有上升但无统计学差异;雌性大鼠各组中均未检测到NCAM及NGF的表达.(3)外周血相关功能蛋白变化:与对照组相比,高剂量染毒组大鼠血浆中MAG含量明显下降(P＜0.05),恢复组MAG含量无明显变化.结论 施万细胞4种功能蛋白的变化反映了丙烯酰胺致周围神经损伤及修复的功能状态;血浆中MAG含量变化与其在坐骨神经中的变化具有相关性.
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丙烯酰胺致周围神经损伤中施万细胞钙通道途径的变化
目的 探讨施万细胞对丙烯酰胺诱导的周围神经损伤的影响机制.方法 (1)丙烯酰胺周围神经损伤/修复动物模型:免疫组化法检测大鼠神经元钙通道的特异位点(Synapsin-I)和施万细胞特异标志蛋白(S-100β)的变化.(2)细胞模型(原代施万细胞、背根神经节神经元单独培养+插入式培养皿介导混合培养):噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度丙烯酰胺对神经细胞的损伤作用并探讨施万细胞的整体保护效应;Fura-2/AM负栽荧光分光光度法测定单独和混合培养条件下神经细胞内Ca~(2+)浓度的变化.结果 丙烯酰胺染毒大鼠表现明显的周围神经毒性症状,恢复4～5周症状缓解.染毒末S-100β的阳性信号明显减弱提示施万细胞损伤,随恢复期延长,S-100β阳性信号渐增强提示施万细胞损伤后的恢复性变,synapsin-I与S-100β的变化趋势基本一致.丙烯酰胺作用后混合培养组神经细胞的存活率(51.08%±3.24%)大于单独培养组(42.08%±5.42%),混合培养的神经细胞内钙离子浓度显著低于单独培养组.结论 施万细胞影响丙烯酰胺诱导的周围神经损伤后的修复过程,钙通道是其发挥该有益作用的途径之一,synapsinI是其关键的作用位点之一.
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附子对高糖刺激下施万细胞中Krox20-Oct6信号通路及其调控的髓鞘蛋白的影响
目的：观察附子对高糖培养下施万细胞中Krox20-Oct6途径及其调控的髓鞘蛋白的影响,以揭示附子治疗糖尿病周围神经病变的机制。方法将施万细胞分为以下6组：(1)正常组(低浓度葡萄糖)；(2)对照组(甘露醇)；(3)模型组(高浓度葡萄糖)；(4)附子水提物高、中、低剂量组(10μg/mL,1.0μg/mL,0.1μg/mL)。常规培养3天后,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞Oct6、Krox20、髓鞘碱性蛋白和髓鞘蛋白Z mRNA的表达水平,采用Western blot法检测各组细胞的Oct6和Krox20蛋白的表达水平,采用免疫荧光法检测各组细胞的髓鞘碱性蛋白和髓鞘蛋白Z蛋白的表达水平。结果 PCR结果显示,与正常组相比,模型组中Oct6、Krox20、髓鞘碱性蛋白和髓鞘蛋白Z mRNA表达水平下降；与模型组比,附子水提物各剂量组中Oct6、Krox20、髓鞘碱性蛋白和髓鞘蛋白Z mRNA表达水平上升。 Western blot结果证明,与正常组相比,模型组中Oct6蛋白、Krox20蛋白表达水平下降；与模型组比,附子水提物各剂量组中Oct6蛋白、Krox20蛋白表达水平上升。免疫荧光结果提示,与正常组相比,模型组中髓鞘碱性蛋白蛋白及髓鞘蛋白Z蛋白表达水平下降；与模型组比,附子水提物各剂量组中髓鞘碱性蛋白蛋白及髓鞘蛋白Z蛋白表达水平上升。结论高浓度葡萄糖通过抑制 Krox20-Oct6途径使施万细胞髓鞘蛋白生成能力下降,而附子可能通过Krox20-Oct6途径促进髓鞘蛋白的形成,从而改善糖尿病周围神经病变。
关键词： 糖尿病周围神经病变 附子 施万细胞 Krox20-Oct6信号通路 -
参芪降糖颗粒对高糖环境下施万细胞氧化应激的调节作用
目的 探讨参芪降糖颗粒对高糖环境下施万细胞氧化应激的调节作用.方法 采用高糖环境下培养的施万细胞建立氧化应激模型,实验分为正常对照组、高糖组、参芪降糖含药血清组和甲钴胺含药血清组,干预48小时后,用酶标仪检测细胞中总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,应用流式细胞仪检测活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)水平.结果 高糖干预48小时后,与正常对照组比较,高糖组细胞T-AOC和SOD含量明显降低,ROS、MDA水平显著升高(P＜0.01);与高糖组比较,参芪降糖含药血清能显著提高细胞T-AOC和SOD含量,明显下调ROS和MDA水平(P＜0.05).结论 参芪降糖颗粒能够明显提高具有抗氧化能力物质T-AOC和SOD水平,清除有害的氧化代谢产物ROS和MDA,通过抑制高糖环境下施万细胞的氧化应激而发挥对糖尿病周围神经病变的保护作用.
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丝裂原激活蛋白激酶在内毒素脂多糖诱导大鼠施万细胞一氧化氮合酶表达中的作用
目的 主要研究丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号途径在内毒素脂多糖(LPS)诱导大鼠施万细胞(Scs)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因表达和一氧化氮(NO)产生中的作用.方法 先用3种MAPK的特异性抑制剂PD98059(ERK1/2)、SB202190(P38 MAPK)和SP600125(JNK)以不同浓度预处理细胞1h,再用LPS作用施万细胞4 h后,用RT-PCR检测细胞中iNOS mRNA、IL-6 mRNA和TNF-α mRNA的表达;Western blotting观察iNOS蛋白水平的表达变化;通过测定细胞培养液中亚硝酸盐含量来观察NO的水平.结果 LPS可显著激活施万细胞中MAPK信号通路诱导iNOS表达.MAPK的抑制剂预处理细胞后,可显著抑制细胞iNOS mRNA和NO的合成及IL-6 mRNA和TNF-α mRNA的表达.结论 MAPK信号通路参与了LPS介导的大鼠施万细胞iNOS基因表达和NO产生,通过阻断细胞内信号转导通路来减少iNOS及其他细胞因子的产生,为抑制周围神经损伤后的炎症以及免疫反应发生提供了一条新思路.
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重组睫状神经营养因子对受损周围神经施万细胞相关基因表达的作用
目的研究重组睫状神经营养因子(CNTF)对受损周围神经施万细胞基因表达的作用.方法用硅管套接切断的大鼠坐骨神经,在受损神经局部给予重组CNTF,术后用免疫组织化学ABC法结合计算机图像分析观测S100蛋白(S100)、生长相关蛋白-43(GAP-43)、磷酸化酪氨酸(PTyr)、信号转导子和转录激活子(STAT)3的免疫反应阳性物质在修复侧远段神经的分布和相对含量. 结果 CNTF组修复侧远段神经相应区域S100、GAP-43、PTyr、STAT3阳性物质的含量显著或非常显著高于生理盐水组. 结论重组CNTF能上调受损神经施万细胞S100、GAP-43、PTvr和STAT3的表达,提示重组CNTF通过强化受损神经施万细胞JAK-STAT途径,上调其S100和GAP-43的基因表达.
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施万细胞对培养的神经干细胞存活及其分化的影响
目的探讨施万细胞能否在体外促进神经干细胞的存活和分化.方法分离和克隆新生大鼠海马组织的神经干细胞;同时获取坐骨神经和臂丛神经,从中分离和纯化施万细胞.将施万细胞和神经干细胞进行共培养,借助免疫细胞化学技术检测培养的神经干细胞巢蛋白(nestin)的表达及其分化后神经丝蛋白(NF)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.应用扫描电镜观察神经干细胞的形态变化.结果与施万细胞一起培养的神经干细胞存活数量增加,分化为神经元样细胞的数量也明显增加.这些神经元样细胞的初级突起比对照组的明显增长.施万细胞能使神经干细胞胞体表面不规则的凹凸变得平整.共培养的施万细胞和神经干细胞可以3种方式接触生长:1.胞体与胞体接触;2.胞体与突起接触;3.突起与突起接触.结论施万细胞能促进体外培养的神经干细胞的存活及其分化为神经元样细胞.
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神经型一氧化氮合酶相关分子NIDD mRNA在周围神经损伤后的表达变化
目的 探讨正常及损伤的周围神经中神经型一氧化氮合酶(nNOS)相关分子(NIDD)的表达定位与变化.方法 在利用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)研究大鼠坐骨神经损伤对nNOS及其相关分子NIDD mRNA表达变化的基础上,通过原位杂交与间接免疫荧光相结合的方法进一步研究其表达定位情况.结果 nNOS及NIDD mRNA主要分布在正常和损伤坐骨神经的施万细胞(SCs)中,损伤后表达增多,分别在神经夹伤后2周以及切断后1周的近、远侧断端中出现表达高峰.原代培养的SCs中也检测到nNOS及NIDD,其mRNA分布在核周细胞质区域.结论 周围神经损伤对nNOS相关分子NIDD的表达有影响,SCs表达NIDD可能参与神经损伤后再生修复机制.
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施万细胞和MK801对大鼠脊髓半横切后背核神经元存活及其表达NOS的影响
目的观察单独或联合应用施万细胞和MK801对大鼠脊髓半横切后受损伤的背核神经元存活及其表达NOS的影响.方法应用细胞培养、免疫组织化学、核荧光标记、荧光逆行追踪和酶组织化学等技术.结果T11脊髓半横切后15d,生理盐水对照组的L1脊髓段损伤侧背核神经元的存活数量比未损伤侧减少,其中胞体面积＞400μm3的神经元明显减少,而且部分存活的神经元NOS活性增高,背核面积及神经元胞体面积缩小.施万细胞组、MK801组、施万细胞与MK801联合组的L1脊髓段损伤侧背核神经元的存活数量则比术后同期对照大鼠增多,胞体面积＞400μm3神经元的存活数量显著增多.施万细胞与MK801联合组作用明显.MK801组存活的神经元中NOS活性明显减弱,且能阻止背核及其神经元胞体的面积的缩小.结论施万细胞与MK801均可促进轴突被切断的背核神经元的存活,两者有协同作用,且MK801还能防止背核及其神经元胞体缩小.
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人参环氧炔醇对体外培养施万细胞表达神经营养因子的影响及可能机制的研究
目的 研究人参环氧炔醇(PND)对体外培养施万细胞(SCs)神经营养因子(NTFs)表达的影响;并探讨其机制.方法 用含有不同浓度的PND培养液分别处理SCs,以免疫组织化学法检测PND对SCs NTFs表达的影响;放射免疫方法测定SOs内环磷酸腺苷(cAMP)水平的变化,并进行图像处理及统计学分析.结果 PND分别在2.5～20.0μmol/L及5.0～20.0μmol/L剂量范围内可分别促进体外培养SCs NGF及大脑衍生神经营养因子(BDNF) 的表达(P<0.05),在10μmol/L剂量对两者促进作用均明显(P<0.01);在2.5～20.0μmol/L剂量范围内PND可提高体外培养SCs胞内cAMP含量(P<0.05),而在10μmol/L剂量作用显著(P<0.01).结论 PND能明显促进体外培养SCs NGF、BDNF的表达和分泌;PND可提高SCs的胞内cAMP水平,并与PND促进体外培养SCs NGF、BDNF 表达之间存在相关性,提示其可能是PND提高体外培养SCs NGF、BDNF表达的调控机制及信号传导通路.
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施万细胞和一氧化氮合酶抑制剂对大鼠脊髓损伤后背核神经元存活及其轴突再生的影响
目的探讨施万细胞(SCs)和一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NNA联合应用能否促进脊髓损伤后背核神经元存活及其轴突再生. 方法20只成年大鼠分为对照组、SCs组、L-NNA组和SCs+L-NNA组.在SCs+L-NNA组动物T11脊髓段半横断后在损伤处植入施万细胞,术后腹腔内注射L-NNA.结果脊髓半横断后30d,对照组L1脊髓段损伤侧背核神经元数量减少,其胞体皱缩,NOS表达阳性.SCs组存活的神经元增加的同时其NOS表达增强,胞体也发生皱缩.L-NNA组和SCs+L-NNA组存活的神经元也增加,但NOS表达降低,其胞体皱缩得到改善.各组中仅在SCs+L-NNA组L1脊髓损伤侧背核观察到有被FG标记的神经元胞体,提示其再生轴突穿越损伤区到达头端脊髓组织.结论SCs和L-NNA都可促进脊髓半横断背核受损伤神经元的存活;两者联合应用能更好地促进受损伤背核神经元存活及其轴突再生.
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体外培养的施万细胞在平面和聚乙醇酸纤维网架上的迁移
目的观察培养的施万细胞(SCS)在平面或聚乙醇酸(PGA)纤维的立体网架上迁移特性. 方法用光、电镜技术观察在不同培养环境和培养时间中,SCS在平面或立体网架上的形态变化. 结果平面上SCS一般为长梭形,同群细胞间以突起相连接;同群细胞迁移有方向和速率一致的特征.立体网架上细胞有球形和长橄榄形两种,细胞间也互相接触;细胞迁移速度快于平面,纤维上的长橄榄形细胞快于球形细胞;长橄榄形细胞长轴往往与纤维呈一定夹角,有包裹纤维的趋势. 结论 PGA在SCS生长中具有良好的生物相容性;与平面相比SCS更易在立体网架的纤维上迁移,长橄榄形的SCS有包裹纤维的趋势.
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施万细胞对大鼠脊髓半横切后背核神经元存活及其表达NOS的影响
目的探讨移植的施万细胞对大鼠脊髓半横切后背核神经元存活及其表达NOS的影响.方法50只成年SD大鼠被分为实验组和对照组.在胸11脊髓段半横切后立即在损伤处移植入施万细胞. 结果脊髓半横切后,15 d和25 d对照组L1脊髓段损伤侧背核神经元的存活数均比未损伤侧的明显减少.存活的神经元胞体出现明显皱缩,有些神经元呈现NADPH-d阳性.15 d和25 d施万细胞组L1脊髓段损伤侧背核神经元的存活数则比同期对照组的明显增加,表达NOS的存活神经元数也随之增多.但存活的神经元胞体仍然是皱缩的. 结论移植的SCs可促进受损伤的背核神经元存活及其表达NOS,但不能阻止其胞体出现皱缩.
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高糖对培养大鼠施万细胞生长、凋亡的影响及其机制探讨
目的 研究高糖对大鼠施万细胞(SCs)生长及凋亡的影响,并探讨其可能机制. 方法将培养的SCs分别用含不同浓度葡萄糖的培养液孵育72h,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞活力,原位缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,Western blotting检测Bcl-2及Bax的表达. 结果 高浓度葡萄糖(60mmol/L、90mmol/L)组SCs活力降低,细胞凋亡率增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降及凋亡蛋白Bax表达升高. 结论 高糖抑制SCs生长,诱导细胞凋亡,可能与Bcl-2表达下降及Bax表达升高有关.
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施万细胞对植入大鼠脊髓损伤区内的神经干细胞存活和分化的影响
目的探讨施万细胞对植入损伤脊髓内的神经干细胞的存活及其分化的影响. 方法分离和克隆新生大鼠海马组织的神经干细胞;同时获取坐骨神经和臂丛神经,从中分离和纯化施万细胞.在移植前先用核荧光(Hoechst33342)标记神经干细胞.实验组为神经干细胞和施万细胞联合移植入大鼠脊髓半横断处,对照组为单独神经干细胞移植.应用免疫组织化学和酶组织化学技术,在移植后7d、14d、21d和30d分别观察神经干细胞的存活和分化情况. 结果实验组的神经干细胞比对照组迁移的更远,分化为神经丝蛋白染色阳性神经元样细胞的数量比对照组的多,并且有较长的突起长出.在30d实验组中,移植的神经干细胞有部分呈乙酰胆碱酯酶(AchE)染色阳性.而在对照组中,移植区内仅有少数呈AchE染色弱阳性的神经干细胞. 结论在脊髓损伤处,施万细胞可促进移植的神经干细胞存活、迁移和向神经元样细胞分化;有些神经元样细胞能长出较长的突起,有些呈现乙酰胆碱酯酶活性.
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含种子细胞的丝素组织工程神经移植物修复大鼠脊髓损伤
目的 探讨体外构建含种子细胞的蚕丝丝素组织工程神经移植物(TENGs)的方法,评价其对大鼠脊髓损伤修复的影响.方法 分离大鼠皮肤前体细胞并向施万细胞诱导分化,S-100免疫荧光染色鉴定.将皮肤前体细胞诱导分化的施万细胞(SKP-SCs)作为种子细胞,联合蚕丝丝素神经导管和纤维支架共培养.共培养7d后将蚕丝丝素TENGs置入大鼠背侧T8～T10半横断损伤的脊髓中,于术后不同时间点利用BBB评分观察行为学的变化,术后8周取材,切片,免疫荧光染色观察脊髓损伤修复情况以及种子细胞的存活情况.结果 相差显微镜下体外培养的SKP-SCs大部分细胞形态呈双极或3极,免疫荧光染色显示,SKP-SCs呈S-100阳性,将SKP-SCs与蚕丝丝素支架材料共培养,蚕丝丝素支架表面均匀贴附大量的细胞,生长状态良好.将该移植物移植入大鼠T8～T10半横断损伤脊髓处,术后BBB评分显示,从4周起至8周均优于对照组,且结果具有统计学差异;术后8周时取材切片仍能观察到大鼠体内有大量种子细胞存活.结论 含种子细胞的蚕丝丝素组织工程神经移植物对于修复大鼠脊髓损伤具有一定的促进作用.
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β1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ对施万细胞增殖的影响
目的探讨周围神经施万细胞表达β1,4-半乳糖基转移酶-Ⅰ(β-1,4-GalT-Ⅰ)对其增殖的影响.方法将构建的正、反义β-1,4-GalT-Ⅰ表达质粒,转染到施万细胞中,分析转染细胞倍增时间、3H-TdR掺入情况以及细胞周期变化.结果转染正义β-1,4-GalT-Ⅰ后施万细胞的增殖受到抑制,这种作用随转染浓度增大而增强;在G1/G0期的细胞数目增加,S期的数目减少.而转染反义β-1,4-GalT-Ⅰ有相反的作用. 结论β-1,4-GalT-Ⅰ对施万细胞的增殖有抑制作用,可能在周围神经施万细胞的增殖调节中发挥重要作用.
关键词： β1 4-半乳糖基转移酶-Ⅰ 施万细胞 细胞增殖 大鼠
