三维生物打印在皮肤组织工程中的应用研究进展
摘要： Deep skin wounds require skin grafts for coverage.Current treatments such as tissue engineered skin or skin substitutes can not meet the needs of clinical application due to the technical problems involving preservation,transportation,and a lengthy preparation process.In comparison with traditional methods such as freeze-drying,three-dimensional bioprinting can precisely dispense living cells,nucleic acid,growth factor,and phase-changing hydrogels according to the wound form,while maintaining high cell viability.Besides,it has excellent performance in high resolution,flexibility,reproducibility,and high throughput,showing great potential in the fabrication of tissue engineered skin.This review mainly introduces the common techniques of three-dimensional bioprinting,and their application in skin tissue engineering,focusing on the latest research progress,and summarizes the current challenges and future development of three-dimensional skin printing.
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2723名上海市儿童看护人对小面积烧伤急救知识认知水平的横断面调查与分析
目的 了解上海市儿童看护人对小面积烧伤急救知识认知水平,提升儿童小面积烧伤急救水平. 方法 2017年11月-2018年3月,采用随机数字表法抽取上海7个市辖区,从中采用便利抽样法抽取4所托儿所、5所幼儿园、6所小学、2所初中的共2 750名学生,每名学生限定1名看护人作为研究对象,采用自制问卷通过微信和腾讯QQ对看护人的小面积烧伤急救知识认知情况进行横断面调查.统计儿童年龄、烧伤经历、烧伤后瘢痕形成情况,不同年龄段儿童烧伤患病率;看护人受教育程度及其与看护儿童的社会关系;儿童小面积烧伤后其看护人第一反应处理措施;看护人选择自行为患儿涂抹民间偏方药物情况,不同学历看护人选择白行为患儿涂抹民间偏方药物情况;看护人选择自行为患儿涂抹生活物品情况;看护人对规范化小面积烧伤急救措施知悉情况,不同学历看护人知悉全部规范化小面积烧伤急救措施情况;看护人第一时间就诊医院类别选择情况,不同小面积烧伤急救措施知悉水平的看护人、其看护儿童有/无烧伤经历的看护人选择第一时间前往开设烧伤专科的三级甲等医院就诊情况;看护人对开设烧伤专科或专门从事烧伤救治的医疗机构类别选择情况,不同小面积烧伤急救措施知悉水平的看护人选择前往综合性三级甲等医院烧伤科就诊情况.对数据行Pearsonx2检验及卡方分割法检验. 结果 问卷有效回收率为99.0％(2 723/2 750).儿童的年龄段以6～11岁为主[64.7％(1 762/2 723)],儿童烧伤患病率为19.4％(527/2 723).各年龄段儿童烧伤患病率总体比较,差异无统计学意义(x 2=1.424,P＞0.05).儿童烧伤后瘢痕形成百分比为27.3％(144/527).儿童看护人受教育程度以大学本科为主[40.2％(1 094/2 723)],与儿童社会关系以儿童母亲为主[74.6％ (2 030/2 723)].假设其看护儿童发生小面积烧伤,74.0％(2 016/2 723)的看护人的第一反应是赶紧用自来水冲洗并脱去患处衣物;19.2％(523/2 723)的看护人选择自行为患儿涂民间偏方药物,初中学历看护人选择自行为患儿涂抹民间偏方药物百分比明显高于大专、大学本科、研究生学历看护人(x2=18.502、20.642、13.319,P＜0.05);49.2％(1 340/2 723)的看护人选择自行为患儿涂抹各类生活物品;39.2％(1 068/2 723)的看护人知悉全部规范化小面积烧伤急救措施,大学本科学历看护人知悉全部规范化小面积烧伤急救措施百分比明显高于高中及中专学历看护人(x2=11.234,P＜0.05).假设其看护儿童发生小面积烧伤,39.0％(1 063/2 723)的看护人选择第一时间前往就近医院就诊,知悉与不知悉/不全知悉全部规范化小面积烧伤急救措施的看护人选择第一时间前往开设烧伤专科三级甲等医院就诊的百分比相近(x2=3.528,P＞0.05),其看护儿童有烧伤经历与其看护儿童无烧伤经历的看护人选择第一时间前往开设烧伤专科三级甲等医院就诊的百分比相近(x2 =3.521,P＞0.05);在所有开设烧伤专科或专门从事烧伤救治的医疗机构中,28.0％(762/2 723)的看护人选择前往综合性三级甲等医院就诊,知悉全部规范化小面积烧伤急救措施的看护人选择前往综合性三级甲等医院就诊的百分比明显高于不知悉/不全知悉全部规范化小面积烧伤急救措施的看护人(x2 =4.890,P＜0.05). 结论 上海市儿童看护人以儿童母亲为主、学历以大学本科为主,对小面积烧伤急救知识的认知水平低,仅少部分看护人知悉全部规范化小面积烧伤急救措施,尚有部分看护人存在自行为患儿涂抹民间偏方药物或生活物品的错误想法.应通过烧伤模拟演练、网络等多种渠道加强烧伤现场基本急救知识宣教,并引导看护人在儿童发生烧伤后将其送往开设烧伤专科的医院就诊,以期获得更专业的医疗救治.
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缺氧诱导因子1α对大鼠血管内皮细胞通透性的调控作用及相关机制
目的 探讨缺氧诱导因子1 α(HIF-1α)对大鼠血管内皮细胞通透性的调控作用及相关机制. 方法 取12只雄性SD大鼠,35 ～ 38 d龄,分离主动脉培养血管内皮细胞,4d后观察细胞形态,并取第2或3代细胞进行以下实验.(1)取大鼠血管内皮细胞,采用随机数字表法(分组方法下同)分为空白对照组、阴性对照组、HIF-1α干扰序列1组、HIF-1α干扰序列2组和HIF-1α干扰序列3组,每组3孔.阴性对照组和HIF-1 α干扰序列1组、HIF-1α干扰序列2组和HIF-1α干扰序列3组细胞经脂质体2000分别转染GV248空质粒和含HIF-1α干扰序列1、干扰序列2、干扰序列3的GV248重组质粒,空白对照组细胞仅加入脂质体2000.转染24 h后,采用实时荧光定量反转录PCR法和蛋白质印迹法(检测方法下同)分别检测各组细胞HIF-1 α的mRNA和蛋白的表达,选取干扰效率高的序列.(2)另取大鼠血管内皮细胞,分为空白对照组、阴性对照组和HIF-1α低表达组,每组3孔.空白对照组细胞仅加入脂质体2000,阴性对照组和HIF-1α低表达组细胞经脂质体2000分别转染GV248空质粒及实验(1)中筛选的低表达HIF-1α重组质粒.培养14 d,检测各组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平.(3)另取大鼠血管内皮细胞,分为空白对照组、阴性对照组、HIF-1α高表达组,每组3孔.空白对照组细胞仅加入脂质体2000,阴性对照组、HIF-1 α高表达组细胞经脂质体2000分别转染GV230空质粒和HIF-1 α高表达重组质粒.培养14 d,检测各组细胞HIF-1 α的mRNA和蛋白表达水平.(4)取实验(1)中3组、实验(2)中3组细胞,检测肌球蛋白轻链激酶(MLCK)、磷酸化肌球蛋白轻链(p-MLC)和带状闭合蛋白1(ZO-1)的mRNA和蛋白表达水平.对数据行单因素方差分析、t检验. 结果 培养4d,细胞呈梭形,成功培养出大鼠血管内皮细胞.(1)HIF-1α干扰序列1组、HIF-1α干扰序列2组和HIF-1α干扰序列3组细胞HIF-1α的干扰效率分别为47.66％、45.79％、62.62％,干扰序列3组细胞干扰效率高.转染24 h后,HIF-1 α干扰序列3组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平明显低于空白对照组(t=18.404、9.140,P＜0.01)及阴性对照组(t=15.099、7.096,P＜0.01).(2)培养14 d后,HIF-1α低表达组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平明显低于空白对照组(t=21.140、5.440,P＜0.01)和阴性对照组(t=14.310、5.210,P＜0.01).(3)培养14d后,HIF-1 α高表达组细胞HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平明显高于空白对照组(t=19.160,7.710,P＜0.01)及阴性对照组(t=19.890、7.500,P＜0.01).(4)转染24 h后,HIF-1α低表达组细胞MLCK、p-MLC的mRNA表达水平显著低于空白对照组(t=2.709、4.011,P＜0.05或P＜ 0.01)和阴性对照组(t=2.373、3.744,P＜0.05或P＜0.01),HIF-1α低表达组细胞ZO-1的mRNA表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组(t=4.285、5.050,P＜0.01).HIF-1α高表达组细胞MLCK、p-MLC的mRNA表达水平显著高于空白对照组(t=9.118、11.313,P＜0.01)和阴性对照组(t=9.073、11.280,P＜0.01),HIF-1 α高表达组细胞ZO-1的mRNA表达水平显著低于空白对照组和阴性对照组(t=2.889、2.640,P＜0.05).(5)转染24 h后,HIF-1α低表达组细胞MLCK、p-MLC的蛋白表达水平显著低于空白对照组(t=2.652、3.983,P＜0.05或P＜0.01)和阴性对照组(t=2.792、4.065,P＜0.05或P＜0.01),HIF-1α低表达组细胞ZO-1的蛋白表达显著高于空白对照组和阴性对照组(t=3.881、3.570,P＜0.01).HIF-1α高表达组细胞MLCK、p-MLC的蛋白表达水平为1.18士0.24、0.68±0.22,显著高于空白对照组的0.41±0.21、0.35±0.14(t=5.011、3.982,P ＜0.05或P＜0.01)和阴性对照组的0.43±0.20、0.36 ±0.12(t=4.880、3.862,P＜0.05或P＜0.01).HIF-1α高表达组细胞ZO-1的蛋白表达水平为0.08±0.06,显著低于空白对照组的0.20±0.09和阴性对照组的0.19±0.09(t=4.178、3.830,P＜0.05或P＜0.01). 结论 HIF-1α通过上调MLCK、p-MLC,下调ZO-1的表达,从而增加大鼠血管内皮细胞通透性.
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经皮穴位电刺激对患者额部皮肤软组织扩张器注水扩张过程中疼痛的作用
目的 探讨经皮穴位电刺激(TEAS)对患者额部皮肤软组织扩张器注水扩张过程中疼痛的作用. 方法 2016年6月-2017年6月,上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科门诊收治符合入选标准的额部皮肤软组织扩张器注水扩张患者100例,其中男43例、女57例,年龄27～55岁,对其进行前瞻性随机对照研究.采用随机数字表法将患者分为TEAS护理组和常规护理组,每组各50例.常规护理组采用常规护理方法对患者于每次门诊注水时、注水2d后进行常规护理;TEAS护理组患者在常规护理的基础上,于每次门诊注水时,由责任护士对患者进行TEAS治疗,准确定位上星穴、头维穴、合谷穴,采用脉冲针灸治疗仪同时对3处穴位进行电刺激,每次30 min.责任护士嘱患者及其家属于每次门诊注水2d后开展居家TEAS,每天2次,每次30 min.责任护士进行远程指导并每天电话回访.2组患者护理均持续至整个扩张疗程结束.扩张疗程结束后,责任护士通过数字评价量表对患者扩张过程中的整体疼痛程度和剧烈疼痛程度进行评分,通过简化舒适状况量表对患者扩张过程中的整体舒适度及其各维度进行评分.对数据进行独立样本t检验、x2检验. 结果 扩张过程中,TEAS护理组患者整体疼痛程度评分和剧烈疼痛程度评分为(5.4±1.2)、(6.5±1.0)分,明显低于常规护理组的(6.1±1.3)、(7.5±1.4)分,t=-2.62、-4.00,P＜0.05或P＜0.01.扩张过程中,TEAS护理组患者整体舒适度生理维度、社会文化维度、心理精神维度、环境维度及总分分别为(9.6±2.9)、(20.1±2.8)、(29.1±1.9)、(22±3)、(80±6)分,明显高于常规护理组的(5.7±2.1)、(16.8±2.8)、(26.0±2.8)、(21±4)、(69±8)分,t=8.03、6.35、7.60、2.11、10.64,P＜0.05或P＜0.01. 结论 适当强度、频率、持续时间的TEAS可缓解额部皮肤软组织扩张器注水扩张过程中患者的疼痛,改善患者舒适度.
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游离第3足趾胫侧微型皮瓣修复手指末节指腹皮肤软组织缺损
目的 探讨游离第3足趾胫侧微型皮瓣修复手指末节指腹皮肤软组织缺损的效果.方法 2013年8月-2017年5月,笔者单位收治18例手指末节指腹皮肤软组织缺损患者,其中男12例、女6例,年龄16 ～54岁.患者中累及拇指3例、示指8例、中指4例、环指3例,缺损面积为2.0 cm×1.4 cm～3.5 cm×2.4 cm.根据创面面积和形状设计游离第3足趾胫侧微型皮瓣,皮瓣长宽均分别较创面长宽扩大0.1～0.2 cm,面积为2.1 cm×1.5 cm～3.7 cm×2.6cm.皮瓣皮下静脉与指掌侧浅表静脉或指背浅表静脉行端端吻合,第3足趾胫侧趾底动脉与受指指固有动脉于无张力下行端端吻合;皮瓣第3足趾胫侧趾底神经与受指指同有神经吻合.足部供区直接拉拢缝合或取同侧小腿上段内侧全厚皮修复.观察术后皮瓣成活情况及患者随访情况. 结果 术后皮瓣存活良好,血运较佳.18例患者中2例失访,另16例随访4～36个月,皮瓣质地、外形较佳,重建的手指末节指腹饱满、具有指纹,功能恢复良好,皮瓣两点辨别觉距离5 ～ 10 mm,足部供区术后即愈合者14例,另2例患者植皮边缘或中央区域坏死经换药后愈合.足部植皮处耐磨,供区损伤小,不妨碍穿鞋和行走,无足部不适. 结论 游离第3足趾胫侧微型皮瓣修复手指末节指腹皮肤软组织缺损,指腹外形良好、供区损伤小,手术操作简单,值得临床推广.
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体外研究己糖激酶Ⅱ在缺血缺氧小鼠心肌细胞自噬流变化中的作用
目的 探讨己糖激酶Ⅱ在体外培养的缺血缺氧小鼠心肌细胞白噬流变化中的作用.方法 取6只1～2d龄雌雄不限C57BL/6小鼠,分离心脏并培养原代心肌细胞,取原代细胞进行以下实验.(1)按照随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为6组,即正常对照3、6、9h组及缺血缺氧3、6、9h组,每组4孔.DMEM/F12培养基常规培养(常规培养条件下同)48 h后,正常对照3、6、9h组更换新鲜DMEM/F12培养基分别培养3、6、9h,缺血缺氧3、6、9h组更换无糖无血清培养基后于37℃含体积分数1％氧气、体积分数5％二氧化碳的低氧培养箱(缺氧培养条件下同)内分别培养3、6、9h.细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞活力.(2)细胞分组及处理同实验(1),每组1孔.蛋白质印迹法检测细胞微管相关蛋白1轻链3Ⅰ(LC3Ⅰ)、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达.(3)将细胞分为正常对照组、单纯缺血缺氧9h组和缺血缺氧9h+2-脱氧葡萄糖(2-DG)组,每组4孔.常规培养48 h后,正常对照组更换新鲜DMEM/F12培养基培养9h;单纯缺血缺氧9h组更换无糖无血清培养基,缺血缺氧9 h+ 2-DG组更换溶有物质的量浓度为10 mmol/L 2-DG(20 μmol)的无糖无血清培养基,2组均缺氧培养9h.CCK-8法检测细胞活力.(4)细胞分组及处理同实验(3),每组1孔.蛋白质印迹法检测细胞LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和p62蛋白表达.(5)细胞分组及处理同实验(3),每组2孔.透射电镜下观察心肌细胞中自噬体/自噬溶酶体情况.(6)将细胞分为正常对照组、单纯缺血缺氧9h组、缺血缺氧9h+己糖激酶Ⅱ小干扰RNA1(HK-Ⅱ siRNA1)组和缺血缺氧9 h+HK-Ⅱ siRNA2组,每组4孔.正常对照组和单纯缺血缺氧9h组常规培养48 h,缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h +HK-ⅡsiRNA2组分别转染200 nmol/L HK-ⅡsiRNA1和HK-ⅡsiRNA2后常规培养48 h.正常对照组更换新鲜DMEM/F12培养基培养9h,单纯缺血缺氧9h组、缺血缺氧9h+HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组更换无糖无血清培养基后缺氧培养9h.CCK-8法检测细胞活力.(7)细胞分组及处理同实验(6),每组1孔.蛋白质印迹法检测细胞LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达.除实验(5)外,各实验均重复3次.对数据行单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正. 结果 (1)缺血缺氧3、6、9h组心肌细胞活力分别为0.450±0.022、0.385±0.010、0.335±0.015,分别明显低于对应正常对照3、6、9h组的0.662±0.026、0.656±0.028、0.661±0.021(t=6.21、9.12、12.48,P＜0.01).(2)与对应正常对照3、6、9h组比较,缺血缺氧3、6、9h组心肌细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均显著增加(t3h =16.15、10.99、5.30,t6h=6.79、10.42、9.42,t9h=15.76、16.51、7.20,P＜0.05或P＜0.01).(3)单纯缺血缺氧9h组心肌细胞活力为0.353±0.022,较正常对照组的0.673±0.027明显降低(t=9.29,P＜0.01);缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞活力为0.472±0.025,较单纯缺血缺氧9h组明显升高(t=3.60,P＜0.05).(4)与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9h组心肌细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值及p62蛋白表达均明显增加(t=9.45、8.40,P＜0.01);与单纯缺血缺氧9h组比较,缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值及p62蛋白表达均明显减少(t =4.39、4.74,P＜0.05).(5)正常对照组心肌细胞中仅可见个别双层膜结构的白噬体/自噬溶酶体;与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9h组心肌细胞中双层膜结构的自噬体/自噬溶酶体明显增多;与单纯缺血缺氧9h组比较,缺血缺氧9 h+2-DG组心肌细胞中自噬体/自噬溶酶体数量明显减少.(6)单纯缺血缺氧9h组心肌细胞活力为0.358±0.023,较正常对照组的0.673±0.026明显降低(t =9.12,P＜0.01);缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组心肌细胞活力分别为0.487±0.027、0.493±0.022,较单纯缺血缺氧9h组明显升高(t=3.63、4.28,P＜0.05).(7)与正常对照组比较,单纯缺血缺氧9h组心肌细胞LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均明显增加(t=6.08、6.31、4.83,P＜0.05或P＜0.01);与单纯缺血缺氧9h组比较,缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA1组和缺血缺氧9 h+HK-ⅡsiRNA2组心肌细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62和己糖激酶Ⅱ蛋白表达均明显减少(t =5.10、7.76、15.33,4.17、8.42、12.11,P＜0.05或P＜0.01). 结论 缺血缺氧上调体外培养的小鼠心肌细胞己糖激酶Ⅱ蛋白表达水平,通过损害自噬流导致心肌细胞活力下降;抑制己糖激酶Ⅱ活性或其表达可减轻心肌细胞缺血缺氧损害.
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三种诱导因子在骨髓间充质干细胞向淋巴管内皮细胞分化中的作用
目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子C(VEGF-C)在骨髓间充质干细胞(BMSC)向淋巴管内皮细胞(LEC)分化中的作用. 方法 取第3～5代大鼠BMSC进行实验.(1)取大鼠BMSC,采用随机数字表法(分组方法下同)分为阴性对照组、CD90组、CD44组、CD34组,每组样本数为3,阴性对照组细胞加入磷酸盐缓冲液5μL,余3组细胞分别加入相应抗体5 μL,流式细胞仪检测细胞表面抗原阳性情况.(2)取3个批次大鼠BMSC,均分为空白对照组、VEGF-C组、HGF组、bFGF组、VEGF-C+HGF组、VEGF-C+bFGF组、HGF+bFGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组,每组样本数为3.空白对照组细胞加入2 mL完全培养基,VEGF-C组细胞中加入2 mL完全培养基和10 μg/mL VEGF-C 10 μL,HGF组细胞加入2 mL完全培养基和10 μg/mL HGF 16 μL,bFGF组细胞加入2 mL完全培养基和1μg/mL bFGF 20 μL,VEGF-C+ HGF组、VEGF-C +bFGF组、HGF+ bFGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组细胞加入2 mL完全培养基及同前相应浓度和量的诱导因子.培养10d,倒置相差显微镜下观察细胞形态,蛋白质印迹法和实时荧光定量反转录PCR法分别检测淋巴管内皮透明质酸受体1(LYVE-1)、VEGF受体3(VEGFR3)及整合素α9蛋白和mRNA表达.(3)取大鼠BMSC,分为空白对照组、HGF+ VEGF-C+ bFGF组、bFGF+ VEGF-C+HGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组,每组样本数为3.空白对照组细胞加入2 mL完全培养基;HGF+VEGF-C +bFGF组细胞加入2 mL完全培养基、10 μg/mL HGF 16 μL、10 μg/mL VEGF-C 10μL,6h后加入1 μg/mL bFGF 20 μL.bFGF+VEGF-C+HGF组细胞加入2 mL完全培养基以及1μg/mLbFGF 20 μL和10 μg/mL VEGF-C 10 μL,6h后加入10 μg/mL HGF 16 μL;VEGF-C+ HGF+ bFGF组细胞同时加入2 mL完全培养基及同前浓度及量的3种诱导因子.另取2个批次大鼠BMSC,同前进行分组,除将HGF+ VEGF-C+ bFGF组、bFGF+ VEGF-C+ HGF组6h的间隔时间调整为12、24 h外,其余处理方法同前.培养10 d,蛋白质印迹法检测LYVE-1、VEGFR3及整合素α9的蛋白表达.对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正. 结果 (1)阴性对照组、CD90组、CD44组、CD34组细胞表面抗原阳性表达率分别为0.39％、99.84％、99.90％、0.57％.(2)培养10 d,空白对照组、HGF组、bFGF组、HGF+ bFGF组细胞呈长梭形,其余各组细胞呈多边形.(3)培养10d,空白对照组、HGF组、bFGF组、HGF+ bFGF组细胞无LYVE-1、VEGFR3和整合素α9蛋白表达.培养10 d,VEGF-C+ HGF+ bFGF组细胞LYVE-1、VEGFR3和整合素α9的蛋白表达量均明显高于VEGF-C组(t=24.21、11.04、15.43,P＜0.01)、VEGF-C+ HGF组(t=10.81、9.93、10.20,P ＜0.01)、VEGF-C+ bFGF组(t=11.67、6.32、19.00,P＜0.01). VEGF-C +HGF组及VEGF-C+bFGF组细胞LYVE-1的蛋白表达量明显高于VEGF-C组(t=8.69、15.20,P＜0.01);VEGF-C+bFGF组细胞VEGFR3的蛋白表达量明显高于VEGF-C组及VEGF-C+HGF组(t=8.67、7.21,P＜0.01);VEGF-C+ HGF组细胞整合素α9的蛋白表达量明显高于VEGF-C组及VEGF-C+ bFGF组(t=8.80、8.83,P＜0.01).(4)培养10d,空白对照组、HGF组、bFGF组、HGF+ bFGF组细胞均无LYVE-1、VEGFR3和整合素α9 mRNA表达.培养10d,VEGF-C组细胞LYVE-1、VEGFR3的mRNA表达量明显低于VEGF-C+ bFGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组(tLYVE-1=6.22、18.01,tVEGFR3=8.49、15.34,P＜0.01),整合素α9的mRNA表达量明显低于VEGF-C+ HGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组(t=13.24、9.65,P＜0.01).VEGF-C+HGF+bFGF组细胞LYVE-1、VEGFR3和整合素α9的mRNA表达量明显高于VEGF-C+ HGF组、VEGF-C+ bFGF组(t =13.92、11.95,13.72、5.27,5.64、9.10,P＜0.01).VEGF-C+ HGF组细胞VEGFR3 mRNA表达量明显低于VEGF-C+ bFGF组(t=6.91,P＜0.01),整合素α9 mRNA表达量明显高于VEGF-C+ bFGF组(f=11.69,P＜0.01).(5)间隔6、12、24 h培养10d,空白对照组细胞均无LYVE-1、VEGFR3及整合素α9蛋白表达.间隔6、12、24 h培养10 d,HGF+ VEGF-C+ bFGF组、bFGF+ VEGF-C+ HGF组、VEGF-C+ HGF+ bFGF组细胞LYVE-1、VEGFR3及整合素α9蛋白表达量相近(F6h=2.25、2.47、2.19,F12 h=2.93、1.47、3.25,F24h =0.28、0.20、1.01,P＞0.05). 结论 VEGF-C是诱导BMSC向LEC分化必需的因子,HGF和bFGF可能分别是通过上调整合素α9和VEGFR3的表达来促进分化的,但二者的诱导作用可能是各自独立的.3种诱导因子联合作用诱导分化效果佳.
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大鼠施万细胞与成纤维细胞联合移植对大鼠失神经支配穿支皮瓣神经再生的影响及其机制
目的 探讨大鼠施万细胞与成纤维细胞(Fb)联合移植对大鼠失神经支配穿支皮瓣神经再生的影响及其机制. 方法 (1)从2只孕14 ～16 d SD大鼠胚胎躯干分离培养Fb并观察细胞形态,取第3代细胞用于后续实验.免疫组织化学法观察细胞纤维粘连蛋白和Ephrin-B2蛋白的表达,实时荧光定量反转录PCR法检测细胞Ephrin-B2 mRNA的表达(样本数为3).(2)从45只出生1～3dSD大鼠双侧坐骨神经和臂丛神经分离培养施万细胞并观察细胞形态,取第3代细胞用于后续实验.免疫荧光法及流式细胞仪检测S100阳性细胞率,样本数分别为9、3.(3)于DMEM高糖培养基中,取1×105个/mL Fb、施万细胞各1 mL共培养,设为施万细胞+Fb共培养组;另取1×105个/mL施万细胞2 mL单独培养,设为施万细胞单独培养组.每组5孔细胞.培养6、24 h于倒置相差显微镜下观察2组施万细胞的成簇群情况并计数,另用免疫荧光法观察培养24 h时施万细胞+Fb共培养组施万细胞的成簇群情况,蛋白质印迹法检测培养24 h时2组施万细胞EphB2、Sox2和N-钙黏蛋白的蛋白表达(样本数为20).(4)取100只8周龄雄性SD大鼠,每只大鼠腹壁制成1个原位回植失神经支配穿支皮瓣,按随机数字表法分为单纯皮瓣组、Fb单独移植组、施万细胞单独移植组、施万细胞+Fb共移植组,每组25只.Fb单独移植组、施万细胞单独移植组大鼠皮瓣分别注射0.4 mL Fb、施万细胞(均为2×106个),施万细胞+ Fb共移植组大鼠皮瓣注射0.4 mL Fb与施万细胞混合细胞(共2×106个,细胞数量比为1∶1),单纯皮瓣组大鼠皮瓣注射等体积的DMEM高糖培养基.注射后2、5、7、9、14 d,按随机数字表法每组分别取5只大鼠,取皮瓣组织,免疫荧光法观察再生神经数量、直径及排列.对数据行完全随机设计t检验、重复测量方差分析、t检验及Bonferroni校正. 结果 (1)从大鼠胚胎躯干分离培养的第3代细胞大小、形态较均一,呈长梭形,细胞核所占比例较大;细胞内纤维粘连蛋白及Ephrin-B2蛋白呈强阳性表达,Ephrin-B2 mRNA的表达量为0.004 1 ±0.0008.细胞鉴定为Fb.(2)从新生大鼠坐骨神经和臂丛神经分离的原代细胞培养5d后可见胞体拉长,呈巢状、栅栏状或旋涡状生长;第3代细胞经免疫荧光法及流式细胞仪检测显示,S100阳性细胞率分别为(95.9±1.0)％和(95.8±1.1)％.细胞鉴定为施万细胞.(3)培养6、24 h,施万细胞+Fb共培养组施万细胞成簇群数均明显高于施万细胞单独培养组(t=6.500、10.614,P＜0.01).培养24 h,施万细胞+Fb共培养组施万细胞聚集成簇群,Fb分散围绕在施万细胞簇群周围,施万细胞EphB2、N-钙黏蛋白和Sox2蛋白表达均明显高于施万细胞单独培养组(t=2.975、19.717、11.159,P＜0.05或P＜0.01).(4)注射后2d,4组大鼠皮瓣组织内均见少量散在、排列较杂乱、较短而细的神经纤维.注射后5 ～14 d,施万细胞+Fb共移植组大鼠皮瓣组织中神经纤维数量逐渐增多,且直径较粗大、排列有序;施万细胞单独移植组大鼠皮瓣组织内神经纤维数量有所增加,但直径细小、排列杂乱,数量较施万细胞+Fb共移植组少;单纯皮瓣组和Fb单独移植组大鼠皮瓣组织内神经纤维逐渐发生溃变,数量逐渐减少甚至消失. 结论 大鼠Fb与施万细胞联合移植可通过激活Ephrin/Eph-Sox2-N-钙黏蛋白信号通路调控施万细胞迁移使其聚集成簇群,从而促进大鼠失神经支配穿支皮瓣神经有序再生.
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四例严重烧伤患者并发早期急性肾损伤的原因及治疗方法分析
目的 分析4例严重烧伤患者并发早期急性肾损伤(AKI)的原因并探讨相关治疗方法. 方法 回顾性分析2014年6月-2017年12月暨南大学医学院附属广州红十字会医院(下称笔者单位)收治的4例严重烧伤并发早期AKI患者的临床资料.患者均为男性,年龄为23 ～33(30±5)岁,烧伤深度深Ⅱ～Ⅲ度,并发四肢肌筋膜室综合征和不同程度的横纹肌损伤,均经外院治疗后转入笔者单位.将患者按烧伤总面积从小到大编号,1、2、3、4号患者烧伤总面积分别为10％、80％、90％、95％体表总面积,并发早期AKI时间分别为伤后48、11、29、48 h,转入笔者单位时间分别为伤后60、11、29、144 h.2、3号患者转入院时已出现低血容量性休克.4例患者转入院后均行连续性肾脏替代治疗(CRRT),在血流动力学监测和器官功能监护的支持下,积极对并发肌筋膜室综合征的四肢行切开、彻底减压探查,清除已坏死的肌肉组织或行截肢术.对四肢焦痂切开减压后创面,采用桀亚敷料皮或猪皮临时覆盖、多次清创并结合负压封闭引流治疗形成新鲜肉芽创面后,和其他分期切削痂创面,分别用自体皮行Meek植皮及微粒皮、网状皮、小皮片移植等覆盖.记录患者治疗结局,行CRRT时间,手术次数,血肌酐、肌红蛋白恢复正常时间,住院时间及随访情况. 结果 本组4例患者转入笔者单位后均治愈,其中1、4号患者共5个患肢因并发肌筋膜室综合征并有大量肌肉坏死无法保留,行截肢术.1、2、3、4号患者分别行19、35、14、25 d CRRT,行5、6、10、8次手术,于转入院后22、35、37、48 d血肌酐恢复正常,于转入院后18、28、25、30 d血肌红蛋白恢复正常,于住院52、105、148、156 d创面基本愈合后出院.随访1～36个月,4例患者肾功能均无异常. 结论 1、4号患者早期AKI由严重烧伤并发肌筋膜室综合征导致横纹肌溶解所致,另2例还与低血容量性休克、肾灌注不足有关.在行CRRT的同时积极去除病因,在血流动力学监测和器官功能支持下积极手术治疗烧伤创面等,可有效提高严重烧伤并发早期AKI救治成功率.
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E2F1转录因子对小鼠全层皮肤缺损创面中M2型巨噬细胞的调节机制
目的 探讨E2F1转录因子对小鼠全层皮肤缺损创面中M2型巨噬细胞的调节机制.方法 引进E2F1基因敲除杂合子C57BL/6小鼠、野生型C57BL/6小鼠,自行繁殖并于小鼠出生后2周通过PCR法鉴定出E2F1基因敲除纯合子小鼠和野生型小鼠.采用随机数字表法分别选取12只经鉴定后生长至6～8周龄的雄性E2F1基因敲除纯合子C57BL/6小鼠、野生型C57BL/6小鼠,设为E2F1基因敲除组与野生型组,在每只小鼠背部制成1个全层皮肤缺损创面.伤后2、7d,每组分别采用随机数字表法选取6只小鼠处死,切取创面组织,采用免疫荧光法观察CD68和CD206双阳性M2型巨噬细胞表达并计算CD206阳性细胞百分比,蛋白质印迹法检测CD206蛋白表达,实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)法检测精氨酸酶1 mRNA表达.另取2组伤后7d创面组织标本,分别采用蛋白质印迹法和实时荧光定量RT-PCR法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的蛋白和mRNA表达.前述实验均重复4次.另取野生型组小鼠伤后7d创面组织标本3个,采用免疫共沉淀法及蛋白质印迹法检测E2F1与PPAR-γ的关系,重复2次.对数据行非配对t检验. 结果 E2F1基因敲除纯合子C57BL/6小鼠和野生型C57BL/6小鼠PCR产物大小分别为227、172 bp,与所设计DNA片段大小一致.伤后2、7d,与野生型组比较,E2F1基因敲除组小鼠创面组织中CD68和CD206双阳性M2型巨噬细胞较多;与野生型组的(0.129±0.017)％、(0.282±0.071)％比较,E2F1基因敲除组小鼠创面组织中CD206阳性细胞百分比[(0.234±0.032)％、(0.584±0.023)％]明显增加(t=3.29、3.54,P＜0.05).伤后2、7d,与野生型组的0.43±0.06、0.97±0.08比较,E2F1基因敲除组小鼠创面组织中CD206蛋白表达(1.00 ±0.23、1.63 ±0.26)明显增加(t=2.41、2.45,P＜0.05).伤后2、7d,与野生型组的0.163 ±0.026、0.108±0.017比较,E2F1基因敲除组小鼠创面组织中精氨酸酶1 mRNA表达(0.482 ±0.105、0.195±0.031)明显增加(t=3.04、2.86,P＜0.05).伤后7d,与野生型组的0.20±0.04、0.20±0.04比较,E2F1基因敲除组小鼠创面组织中PPAR-γ蛋白与mRNA表达(0.61±0.12、0.51 ±0.13)均明显增加(t=3.36、2.86,P＜0.05).伤后7d,野生型组小鼠创面组织检测显示,PPAR-γ对E2F1存在单向作用. 结论 E2F1转录因子通过抑制PPAR-γ的表达影响M2型巨噬细胞的极化,从而抑制小鼠全层皮肤缺损创面愈合过程.
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富血小板血浆对大鼠背部超长随意皮瓣成活的影响
目的 观察富血小板血浆(PRP)对大鼠背部超长随意皮瓣成活的影响. 方法 取16只鼠龄6～8周雄性SD大鼠(下同)全血,每只9～ 10 mL,采用改良APPLE法制备PRP;全自动血液细胞分析仪对全血及PRP进行血小板计数,检测PRP制作成功.另取32只大鼠,按随机数字表法分为PRP组和对照组,每组16只.于每只大鼠背部制成1个矩形超长随意皮瓣并原位回植,皮瓣面积为8 cm×2cm.在皮瓣两侧分别设计等距的3点,PRP组大鼠从每个注射点真皮及皮下注射0.1 mL PRP,对照组大鼠注射同等体积的生理盐水.术后7d,观察大鼠皮瓣成活情况并计算皮瓣成活率.术后7d,每组处死8只大鼠,取皮瓣近、中、远端组织,苏木精-伊红染色观察皮瓣组织学变化.取术后24 h(每组处死8只大鼠)、7d2组大鼠距蒂部3～4 cm处皮瓣组织,实时荧光定量反转录PCR检测血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子AA(PDGF-AA)和PDGF-BB mRNA表达量,硝酸还原酶法测定一氧化氮含量.对数据行t检验. 结果 (1)术后7d,PRP组大鼠皮瓣较干燥,未出现脓性分泌物,皮瓣远端出现痂壳附着,痂壳自然脱落后露出色泽淡红愈合皮肤;对照大鼠皮瓣可见大量炎性渗出物,皮瓣远端1/2 ～2/3发生坏死且形成痂壳,痂壳不易剥脱.PRP组大鼠皮瓣成活率为(67±6)％,明显高于对照组的(52±10)％,t=1.94,P＜0.05.(2)PRP组大鼠近端皮瓣未见明显炎性细胞浸润,纤维组织排列整齐,较多微血管形成;中端皮瓣可见少量炎性细胞浸润,纤维组织排列稍紊乱,较多微血管形成.远端皮瓣纤维组织排列较混乱,较多炎性细胞浸润,较多微血管形成,有少量血管栓塞.对照组大鼠近、中、远端皮瓣均有大量炎性细胞浸润,纤维组织排列混乱,微血管形成较少.(3)术后24h、7d,PRP组大鼠VEGF、PDGF-AA及PDGF-BB mRNA的表达量明显高于对照组(t=6.46、5.61、2.88、10.18、6.10、7.67,P＜0.001).(4)术后24 h,PRP组大鼠皮瓣组织一氧化氮含量为(5.0±0.9) μmol/g,明显高于对照组的(3.4 ±0.9)μmol/g(t=19.14,P＜0.001).术后7 d,PRP组大鼠皮瓣组织一氧化氮含量为(3.3±0.8) μmol/g,与对照组大鼠的(3.0±0.6)μmol/g相近(t=2.93,P＞0.05). 结论 PRP能改善大鼠背部超长随意皮瓣的成活率,可能与PRP可通过凋节血管生成相关因子,提高一氧化氮含量,抑制细胞过度凋亡,从而减轻缺血再灌注损伤,改善微循环障碍有关.
