丙型肝炎病毒1a、1b 和2a 型 E1E2原核质粒的构建和序列分析
摘要： 目的：构建陕西地方株丙型肝炎病毒（HCV）1a、1b 和2a 型包膜糖蛋白 E1E2的原核质粒并测序比对。方法采用逆转录－巢式聚合酶链反应（RT－nest PCR）扩增获得 HCV 1a、1b 和2a 型 E1E2片段，与 pMD－18 simple vector 连接，转化感受态细菌 DH5α，小量提取质粒 DNA 并测序。测序结果与 Gene bank 中其他标准序列比对以获取同源性数据。同时重点分析 E2蛋白高变区（HVR）1和2氨基酸序列。 MEGA 4软件绘制种系进化树图。结果成功扩增约2 kb 的目的片段并构建原核质粒，测序结果正确。1b 亚型 E1E2的核苷酸和氨基酸序列的同源性差。 HCV E2的HVR1和2的序列比对显示，同种基因亚型在 HVR 1的变异性大，而 HVR 2的序列变异性不显著。不同基因亚型的毒株在 HVR 1和2的变异性极大，而1b 亚型在 HVR 1和2的变异性比1a 和2a 型突出。结论陕西地方株 HCV 1b 型 E1E2区比1a 和2a 型更易发生突变，1b 型 E2的 HVR 变异性更显著。
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兰茵凤扬化浊解毒方治疗大鼠溃疡性结肠炎的作用机制
目的 观察兰茵凤扬化浊解毒方对溃疡性结肠炎(UC)大鼠结肠组织中δ阿片受体(DOR)、β-arrestin1、Bcl-2 mR-NA表达的影响.方法 60只Wistar大鼠随机分为正常组10只与造模组50只.采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇联合造模法造模.造模组大鼠按照随机数字表分为模型组9只、中药高、中、低剂量组各9只,美沙拉嗪组9只,予相应药物灌胃2 w,观察大鼠疾病活动指数(DAI)评分、结肠黏膜病理学改变,结肠组织中δ阿片受体(DOR)、β抑制蛋白(β-arrestin1)及Bcl-2 mRNA的表达情况.结果 DAI评分:与空白组比较,其余各组均升高,与模型组比较,各治疗组均降低(P<0.05).DOR mRNA与β-arrestin1 mRNA:与模型组相比,各治疗组DOR mRNA及β-arrestin1 mRNA表达均明显降低(P<0.05),而中药中剂量组与美沙拉嗪组比较无明显差异(P>0.05).Bcl-2 mRNA:与模型组相比,各治疗组Bcl-2 mRNA表达均明显降低(P<0.05),中药高剂量组与空白组比较无明显差异(P>0.05).结论 兰茵凤扬化浊解毒方可能通过对DOR-β-arrestin1-Bcl-2信号转导通路活化环节的干预,促进肠黏膜中T细胞凋亡,从而恢复肠道免疫稳态达到治疗UC的目的.
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白藜芦醇、染料木黄酮、姜黄素和大黄素对2BS细胞生长增殖能力的影响
目的 观察白藜芦醇、染料木黄酮、姜黄素和大黄素对细胞衰老及细胞生长增殖能力的影响.方法 配置白藜芦醇、染料木黄酮、姜黄素和大黄素不同浓度的DMEM培养基,分别培养人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS),观察2BS细胞形态、体外传代次数,以MTT法观察细胞生长增殖能力变化,以单细胞凝胶电泳(彗星试验)法观察细胞DNA单链断裂水平.结果 低浓度白藜芦醇、染料木黄酮、姜黄素和大黄素DMEM培养基培养的细胞体外传代次数均较对照组细胞下降;上述抗氧化剂在低浓度时可促进细胞生长增殖,但在高浓度时抑制细胞生长增殖;四种抗氧化剂均可断裂单链DNA,且随浓度加大损伤作用愈大.结论 白藜芦醇、染料木黄酮、姜黄素和大黄素具有促进细胞生长增殖和细胞毒性双重作用,其细胞毒性源于其对DNA损伤作用.
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薯蓣皂苷元体外作用对胶原诱导性关节炎小鼠Th1/Th2型细胞因子的影响
目的 探讨薯蓣皂苷元体外作用对胶原诱导性关节炎( CIA)小鼠外周淋巴细胞分泌细胞因子水平的影响.方法 建立CIA小鼠模型,无菌取外周淋巴组织,提取淋巴细胞体外培养,将淋巴细胞分为空白组、细胞模型组、高、中、低剂量组,采用基因芯片法检测各组培养上清中辅助性T细胞(Th)1/Th2 型细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-4、IL-5的表达水平.结果 薯蓣皂苷元作用后IFN-γ表达水平有降低趋势,其中高剂量组薯蓣皂苷元对IFN-γ表达有显著的抑制作用(P<0. 01).经薯蓣皂苷元作用后TNF-α有降低趋势,但与模型组比较差异并无统计学意义(P>0. 05).经薯蓣皂苷元作用后IL-4水平有上升趋势,其中中、高剂量薯蓣皂苷元可以显著提高IL-4水平(P<0. 05).低、中、高剂量薯蓣皂苷元作用后可以显著提高IL-5水平(P<0. 01,P<0. 05).结论 薯蓣皂苷元体外对CIA小鼠外周淋巴细胞Th1/Th2型细胞因子具有一定的调节作用,可能与其治疗类风湿关节炎有关.
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盐酸小檗碱对人腺样囊性癌ACC2细胞增殖及周期的影响
目的 研究盐酸小檗碱对人腺样囊性癌ACC2细胞的生长抑制作用和对细胞周期的影响.方法 CCK8法检测不同剂量的盐酸小檗碱对 ACC2 细胞的增殖抑制作用,并采用流式细胞术分别检测细胞周期及凋亡情况.结果 在浓度1 ~20 μg/ml范围内,不同浓度的盐酸小檗碱对人腺样囊性癌ACC2细胞均有抑制作用,且有一定的浓度依赖性.盐酸小檗碱细胞浓度为4. 00、7. 50及12. 13 μg/ml作用24 h 后,ACC2细胞在S 期比例增多,凋亡率明显增加.结论 盐酸小檗碱通过干预细胞周期和凋亡对人腺样囊性癌ACC2细胞的增殖起抑制作用,同时与药物浓度有一定的依赖性.
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养心氏片对心力衰竭大鼠心肌凋亡的影响
目的 探讨养心氏片对心力衰竭大鼠心肌凋亡的影响及其机制.方法 将大鼠随机分为正常对照组(空白组)、模型组、养心氏片组、地高辛组,模型组、养心氏片组、地高辛组均注射阿霉素造模,地高辛组及养心氏片组大鼠分别采用地高辛及养心氏片干预;6 w后检测大鼠心率(HR)、左室舒张期末压(LVEDP)、左室峰压( LVSP)、左室内压变化速率( dp/dtmax),后颈总动脉取血检测生化指标,计算心重(HW)/体重(BW),暴露心室心底部及心尖部,利用Masson染色观察胶原纤维增生及形态学情况, Western印迹检测心尖部磷酸化连接蛋白(P-Cx)43及β-actin水平;利用TUNEL检测试剂盒检测大鼠心肌组织凋亡细胞.结果 地高辛组及养心氏片组大鼠LVEDP水平均显著低于模型组(P<0. 05),HR、LVSP、dp/dtmax水平明显高于模型组(均P<0. 05),养心氏片组大鼠LVEDP水平显著低于地高辛组(P<0. 05);地高辛组及养心氏片组脑钠肽(BNP)、肌钙蛋白(cTn)I、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、HW/BW均显著低于模型组(均P<0. 05),养心氏片组大鼠BNP水平显著高于地高辛组(P<0. 05);地高辛组及养心氏片组大鼠心肌细胞胶原容积分数及心肌细胞凋亡指数显著低于模型组(P<0. 05);地高辛组及养心氏片组大鼠P-Cx43/β-actin水平明显低于空白组(P<0. 05);P-Cx43/β-actin水平与大鼠心肌细胞凋亡呈显著正相关(P<0. 05).结论 养心氏片可通过调控P-Cx43的表达而改善心力衰竭大鼠的心肌凋亡,并提高大鼠心功能,减轻心肌细胞纤维化及心室重构.
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腹膜透析液对大鼠腹膜间皮细胞血管内皮生长因子及其受体表达的影响
目的 观察不同浓度葡萄糖腹膜透析液(dextrose)、艾考糊精腹膜透析液(icodextrin)对大鼠腹膜间皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)及其受体VEGFR1、VEGFR2、sFlt-1合成的影响.方法 分离、培养SD雄性大鼠腹膜间皮细胞(RPMCs),第二代细胞用于实验研究.实验分为5组,分别以不同腹膜透析液〔1.50％dextrose(低糖组)、2.50％dextrose(中糖组)、4.25％dextrose(高糖组)、7.50％icodextrin组(糊精组)〕进行刺激培养,无血清DMEM为阴性对照(对照组).RT-PCR法检测VEGF及其受体VEGFR1、VEGFR2、sFlt-1 mRNA表达,Western印迹法检测RPMCs的VEGFR1、VEGFR2蛋白表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清中VEGF及sFlt-1表达.结果 各组均见VEGFR1、VEGFR2、sFlt-1 mRNA和蛋白表达.在核酸和蛋白水平,中糖组、高糖组VEGFR1表达明显高于低糖组、糊精组及对照组(P<0.01,P<0.05);中糖组、高糖组VEGFR2表达显著低于低糖组、糊精组及对照组(均P<0.01);低糖组VEGFR2蛋白表达显著低于对照组(P<0.01).在核酸水平,中糖组、高糖组VEGF、sFlt-1表达明显高于对照组(P<0.01);RPMCs培养上清液中,VEGF、sFlt-1蛋白表达强弱趋势与RT-PCR一致.结论 正常培养的RPMCs表达VEGFR1、VEGFR2及sFlt-1.腹膜透析液,尤其是高浓度dextrose,能明显上调VEGF、VEGFR1及sFlt-1的表达,但下调VEGFR2的表达,提示其可通过调节VEGF受体从而调节VEGF系统,这可能是导致长期腹膜透析过程中腹膜血管增生的机制之一.icodextrin的生物相容性可能优于高浓度dextrose.
关键词： 腹膜间皮细胞 血管内皮生长因子 血管内皮生长因子受体 腹膜透析 生物相容性 -
硫化氢对长期过量饮酒小鼠心肌纤维化及miR-221表达的影响
目的 研究硫化氢(H2 S)对长期过量饮酒小鼠心肌纤维化的作用.方法 44只实验小鼠随机分成4组:对照组、模型组、硫氢化钠(NaHS)组和DL-炔丙基甘氨酸(PAG)组.除对照组外,其他小鼠采用每日自由饮用4％(Vol/Vol)的乙醇水溶液12 w诱导酒精性心肌纤维化模型.另外,NaHS组小鼠予每日腹腔注射NaHS溶液(50μmol/kg).PAG组小鼠予每日腹腔注射PAG溶液(40 mg/kg).12 w后,用VG染色观察胶原沉积,免疫组化测定心肌中Ⅰ型胶原蛋白的表达水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-221的表达水平.结果 模型组小鼠心肌胶原沉积较对照组明显加重,Ⅰ型胶原蛋白表达明显增多,miR-221表达也显著上调(P<0.05).NaHS组上述指标变化均得到明显改善.相反,PAG组上述指标变化进一步明显加重.结论 H2S具有改善长期过量饮酒导致的心肌纤维化的作用,其机制可能与下调miR-221的表达有关.
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中等强度运动对2型糖尿病大鼠间充质干细胞的影响
目的 探究糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)向成骨细胞分化能力的改变及中等强度运动对糖尿病大鼠BM-SC的成骨诱导能力的影响.方法 40只6周龄雄性SD大鼠按体重分层分为对照组(n=8)和糖尿病建模组(n=32).通过高脂饲料喂养和注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型,将建模成功的大鼠按体重分层分为糖尿病组(n=9)和糖尿病运动组(n=8).提取每组2只大鼠右腿胫骨的BMSC以每孔5×106的密度铺于6孔板上,利用平板计数法(CFU)方法检测其增殖情况;3只大鼠右腿胫骨的的BMSC分别种至大皿中,体外分离培养,7 d后提取BMSC中总RNA用RT-PCR法检测Runt相关转录因子(Runx)2、核因子κB受体活化因子(RANK)和RANK配体(L)mRNA的表达.结果 大鼠BMSC经过体外培养7 d,经碱性磷酸酶(ALP)染色,糖尿病运动组6孔板的成骨细胞数目多,并且显著多于糖尿病组.与对照组相比,糖尿病组Runx2 mRNA表达显著下调(P<0.05);与糖尿病组相比,糖尿病运动组Runx2 mRNA表达显著上调(P<0.01).与对照组相比,糖尿病组RANK和RANKL mRNA表达显著上调(P<0.01);与糖尿病组相比,糖尿病运动组RANK和RANKL mRNA表达显著下调(P<0.01).结论 中等强度运动可以改善糖尿病大鼠BMSC向成骨细胞分化的能力.
关键词： 运动 糖尿病 骨髓间充质干细胞 成骨细胞 Runt相关转录因子2 核因子κB受体活化因子 -
ApN/TNF-α信号途径在有氧运动防治ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化过程中的抗炎症作用
目的 观察有氧运动对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化(AS)的防治效果,探讨脂联素(ApN)/肿瘤坏死因子(TNF)-α信号途径的抗炎症作用.方法 8周龄雄性ApoE-/-小鼠随机分为对照组(C,10只)和运动组(E,10只).14 w运动干预结束后取材观察主动脉管壁的病理变化,检测脂肪组织ApN mRNA表达和血清ApN水平及主动脉脂联素受体(AdipoR)1、TNF-α蛋白表达水平.结果 C组小鼠主动脉血管壁纤维板断裂,可见大量泡沫细胞浸润和纤维斑块,E组小鼠较C组主动脉病变有所延缓;E组小鼠ApN mRNA表达及血清水平显著高于C组(P<0.05);E组小鼠主动脉AdipoR1蛋白表达显著高于C组(P<0.05),主动脉TNF-α蛋白表达显著低于C组(P<0.05).结论 有氧运动通过增强ApoE-/-小鼠ApN信号途径,抑制主动脉TNF-α蛋白表达,发挥防治AS的抗炎症作用.
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Cyclin G2在人食管鳞癌组织中的表达及意义
目的 检测Cyclin G2(CCNG2)在人食管鳞癌组织中的表达及其与食管鳞癌临床病理参数的关系.方法 用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测28例食管鳞癌新鲜组织及相应癌旁正常食管组织中CCNG2 mRNA的相对表达水平,运用免疫组化方法检测59例食管鳞癌组织中CCNG2蛋白表达情况,并分析CCNG2蛋白表达与食管鳞癌临床病理参数的关系.结果 CC-NG2 mRNA在食管鳞癌及癌旁正常食管组织中都有表达,但在食管鳞癌中的表达水平显著低于正常食管组织.经免疫组化检测,CCNG2蛋白在食管鳞癌组织中表达率为22.03％(13/59),正常食管上皮中CCNG2的蛋白表达率为74.58％(44/59),CCNG2在食管鳞癌组织中的表达水平与食管鳞癌的组织分化程度、TNM分期、浸润程度和淋巴结转移相关(P<0.05),在不同性别和年龄患者中,CCNG2的表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 CCNG2 mRNA和CCNG2蛋白在食管鳞癌组织中呈低表达,在食管鳞癌的发生发展及转移过程中可能起了重要作用.
