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BMP2在成釉细胞瘤中的表达及成熟肽片断的基因克隆
成釉细胞瘤是较常见的一种牙源性的肿瘤,目前普遍认为其来源于胚胎发育时期的成釉器,肿瘤性的成釉上皮过度增生且失去其诱导硬组织形成的活性.骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)在牙胚成釉器中有较高表达并诱导间充质细胞向成釉上皮分化,是牙釉质和牙本质形成过程中的重要因素之一.我们检测了成釉细胞瘤中的BMP的表达及作用,研究成釉细胞瘤丧失其成骨性的病理发生机制.
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防御素HNP-3成熟肽酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活和毒性检测
目的 用含防御素HNP-3成熟肽cDNA片段构建酵母双杂交诱饵质粒,进行自激活和毒性检测.方法 培养HL-60细胞,提取RNA,RT-PCR扩增含防御素HNP-3成熟肽的cDNA片段,克隆入pBluescript-SK-II质粒,经测序鉴定后,再亚克隆到人酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,PCR及测序鉴定.重组诱饵质粒用缺陷培养基筛选方法进行自激活和毒性检测. 结果构建的重组质粒pBluescript-SK-II-HNP-3,经测序鉴定,插入片段为HNP-3成熟肽的cDNA序列.亚克隆构建的重组诱饵质pGBKT7-HNP-3,测序鉴定表明其插入目的 基因序列无误.重组诱饵质粒自激活和毒性检测显示无自激活现象发生,对酵母细胞AH109无毒性作用. 结论成功构建了防御素HNP-3成熟肽的酵母双杂交诱饵载体;为用酵母双杂交技术研究与防御素HNP-3成熟肽相互作用蛋白质打下了基础.
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重组人骨形成蛋白-2成熟肽对急性放射病小鼠股骨造血间质功能的影响
造血干细胞的增殖、分化不仅依赖于干细胞本身,而且依赖于造血微环境即造血间质结构和功能的完善.我们[1]曾报道重组人骨形成蛋白-2成熟肽(rhBMP-2m)对受照小鼠造血损伤有治疗作用,但它究竟是作用于造血干细胞或是作用于造血间质细胞或两者兼而有之未见报道.笔者研究目的是利用皮下移植股骨法[2]观察骨形成蛋白(BMP)对受照小鼠股骨造血干细胞和造血间质细胞功能的影响.
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人IL-15成熟肽的原核表达
目的 构建人白细胞介素-15( interleukin 15,IL-15)原核表达克隆并在大肠杆菌中表达.方法 从经脂多糖刺激的外周血单核细胞中提出mRNA,RT-PCR扩增出IL-15成熟肽前体蛋白基因,构建原核表达克隆(PGEX-4T-2/ IL-15).IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白图谱.Western blot鉴定表达蛋白.结果 经酶切和测序分析,表明成功构建了pGEX-4T-2/ IL-15原核表达克隆;经IPTG诱导,转化的大肠杆菌表达出相对分子质量(Mr)为42×103 Daltons的融合蛋白,且该蛋白能与抗IL-15抗体发生特异性结合反应.结论 人白介素-15原核表达克隆的成功构建,并在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用奠定了基础.
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人白细胞介素-15克隆的构建及表达
从经脂多糖刺激的外周血单核细胞中提取mRNA,RT-PCR扩增出白细胞介素-15(IL-15)成熟肽前体蛋白基因,将其插入到质粒pGEX-4T-2编码谷胱肽转移酶(GST)的多克隆位点(MCS),构建原核表达克隆(PGEX-4T-2/IL-15);重组质粒经酶切、测序鉴定后转化大肠杆菌,IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白图谱,Western blot鉴定表达蛋白.结果成功构建了pGEX-4T-2/IL-15原核表达克隆,经IPTG诱导,转化的大肠杆菌表达出相对分子质量(Mr)为42×103Daltons的融合蛋白,且该蛋白能与抗IL-15抗体发生特异性结合反应.本研究可为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用奠定基础.
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酵母双杂交筛选胎肾上腺cDNA文库中HNP-1结合蛋白
[目的]筛选胎肾上腺cDNA文库中与α防御素HNP-1成熟肽具有相互作用的蛋白分子.[方法]通过聚合酶链反应(PCR)成功获得HNP-1成熟肽基因插入酵母表达载体pGBK-T7中构建诱饵质粒,同时提取胎肾上腺RNA,SMART技术制备人胎肾上腺cDNA文库,并采用Matchmaker LexA酵母双杂交系统从胎肾上腺cDNA文库中筛选与HNP-1成熟肽相互作用的蛋白.后通过PCR筛选获得阳性克隆并测序,而后经回转实验,GST pull down以及免疫共沉淀再次验证两者的相互作用关系.[结果]成功构建诱饵质粒pGBKT7-HNP-1以及胎肾上腺cDNA文库并在酵母细胞中正确表达,筛选获得HNP-1成熟肽相互作用的蛋白-melanocortin 2 receptor(ACTH-R),CCAAT-enhancer-binding proteins(C/EBP),Tramembrane trafficking protein(TMP21),low density lipoprotein receptor-related protein 6 (LAP6).终选定促肾上腺皮质激素受体(ACTH-R)作为主要研究对象,且经GST pull down以及免疫共沉淀实验获得了证实两者间具有相互作用的相应的条带.[结论]从胎肾上腺cDNA文库中成功筛选得到α防御素HNP-1成熟肽相互作用蛋白--促肾上腺皮质激素受体.
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用于酵母双杂交的α-防御素HNP-1成熟肽重组诱饵载体的构建和鉴定
目的:构建和转化人α-防御素HNP-1成熟肽的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究其相互作用蛋白分子打下基础.方法:用RT-PCR扩增HNP-1成熟肽基因,将该基因片断与腺病毒载体pBluescript-SK-Ⅱ定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;回收目的片断,将其连接入酵母表达载体pGBKT7,构建重组诱饵表达质粒pGBKT7-HNP-1,测序鉴定.缺陷培养方法检测重组诱饵载体有无毒性和自激活作用.结果序列分析表明HNP-1成熟肽重组诱饵表达质粒构建成功,重组诱饵表达质粒对酵母细胞无毒性作用,无自激活效应发生.结论构建用于酵母双杂交的α-防御素HNP-1成熟肽重组诱饵载体,为找出与人α-防御素HNP-1成熟肽相互作用蛋白分子打下了基础.
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人源性神经营养素-6成熟肽基因融合表达载体的构建及表达产物的纯化
为了得到人源性神经营养素-6(Neurotrophin-6, NT-6)成熟肽片段,本研究以经测序鉴定的人源性NT-6 cDNA为模板,通过聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增得到NT-6蛋白成熟肽编码区基因片段;将该基因克隆到融合表达载体pGEX1-λT,构建重组原核融合表达质粒pGEX-NT-6;在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导的条件下,观察融合蛋白在大肠杆菌JM109中的表达情况;利用蛋白回收试剂盒对表达产物进行纯化.结果表明经PCR扩增后,得到一分子量为460 bp左右的片段 ;含有该片段的重组质粒经电泳及双酶切鉴定表明,所得到的重组质粒即为含有目的片段的pGEX1-NT-6;与带有pGEX1-λT质粒的细菌相对照,pGEX1-NT-6质粒转化的大肠杆菌JM109,在IPTG诱导下表达了特异性的融合蛋白,该蛋白分子量为41 KD.获得的融合蛋白经凝血酶酶切后,得到了分子量大约为15 KD的 NT-6成熟肽.本研究成功构建了人源性NT-6成熟肽编码区基因融合表达载体,并纯化了其表达产物,为研究人源性NT-6的生物学功能奠定了基础.
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兔抗人BMP-2成熟肽抗血清的制备
目的利用在大肠杆菌中表达的人骨形成蛋白-2(hBMP-2)成熟肽,制备兔抗hBMP-2成熟肽抗血清.方法将含有hBMP-2成熟肽基因的表达载体pDH2m,转化大肠杆菌,热诱导表达hBMP-2成熟肽,经纯化、复性后,再用其免疫兔子,制备兔抗hBMP-2成熟肽抗血清.并以Western-blot和免疫组化方法对抗血清进行鉴定.结果Western-blot结果显示在对应于hBMP-2成熟肽位置有阳性条带,免疫组化结果显示人软骨细胞胞浆阳性着色.结论hBMP-2成熟肽在大肠杆菌中获得高表达,并成功制备了兔抗hBMP-2成熟肽抗血清.
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生长分化因子5的研究现状和应用前景
生长分化因子5(Growth/Differentiation factor 5,GDF5),亦称软骨形态发生蛋白(Cartilage-derived morphogenetic protein-1,CDMP-1)或MP52,是骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein-1,BMP)家族中较新的成员,其编码基因是Hotten等[1]于1994年从人胎儿胚胎cDNA文库中克隆获得的,基因定位于20q11.2染色体,全长488 kb,其编码多肽共含有501个氨基酸,由位于N端的信号肽,中间的前体肽以及C端的成熟肽构成.翻译后的前体蛋白裂解得到成熟肽,由其发挥生物活性作用.生长分化因子5是机体生长发育的重要调节因子,其在诱导软骨形成,促进骨、软骨、肌健韧带损伤修复方面的作用引人瞩目.GCF5在组织工程领域的应用价值已引起人们的普遍重视.
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GDF亚家族及其生物学作用
GDFs(生长分化因子)是TGF-β超家族的一个亚家族,其家族成员都是先合成前体蛋白质,由信号肽、编码前肽的N-末端区和编码成熟肽的C-末端区三部分组成,在N-末端区和C-末端区之间有一个蛋白酶解加工位点.
