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绿色荧光蛋白小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及成骨诱导
目的分离培养绿色荧光蛋白(GFP)小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)并成骨诱导分化.方法密度梯度离心法分离GFP小鼠MSCs,体外传代扩增,条件培养基成骨方向诱导,利用荧光显微镜、HE染色、细胞化学和免疫组织化学方法进行观察.结果 MSCs在传代和诱导分化过程中稳定表达GFP,经成骨方向诱导10 d后,出现大量碱性磷酸酶和骨钙素染色阳性细胞.结论成功分离了GFP小鼠MSCs,并体外向成骨方向诱导分化.
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诱导大鼠间充质干细胞形成的神经元样细胞的形态特征
目的 研究诱导大鼠骨髓间充质于细胞(MSCs)形成的神经元样细胞的形态特征.方法 通过贴壁法培养鉴定大鼠骨髓MSCs,体外培养扩增纯化后加入新生鼠脑匀浆上清诱导48 h.倒置显微镜和透射电镜下观察诱导前后细胞的形态结构变化,免疫细胞化学方法鉴定诱导后细胞的性质.结果 倒置显微镜下可见MSCs呈纺锤形和多角形,核居中,有1或2个核仁,诱导后细胞呈神经元样,细胞伸出较长的轴突样和树突样突起;免疫组织化学方法显示NSE、NF阳性,GFAP阴性.透射电镜下可见诱导前MSCs胞质较丰富,有较多的细胞器,细胞核呈圆形或椭圆形,也可见不规则形核,核染色质较疏松,有明显核仁,多为1个.有的MSCs表面可见较多的微绒毛.诱导后细胞胞质丰富,细胞核多为不规则形,染色质疏松,核仁较大,1～3个不等,细胞表面有发达的微绒毛.结论 MSCs是一种多分化潜能的细胞,诱导后分化成为具有成熟细胞器的神经元.
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干细胞/基因联合治疗
细胞治疗与基因治疗的相互交融形成了更行之有效的干细胞/基因联合治疗,本文简要介绍干细胞/基因联合治疗中常用的细胞类型、各种载体以及它们的优缺点；例举了迄今已报道有成效的某些人类疾病的治疗或动物实验治疗的结果.此外,指出干细胞/基因联合治疗中可能遇到的致瘤性问题及其对策.
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间充质干细胞的成骨细胞分化和免疫组织化学鉴定
目的 探讨脐带的间充质干细胞分化为成骨细胞的影响因素和免疫组织化学鉴定.方法 收集306例冻存的健康胎儿脐带,采用华尔通胶组织块贴壁法从脐带组织中分离间充质干细胞,利用荧光显微镜观察原代细胞的细胞形态.脐带间充质干细胞的免疫表型和细胞周期采用免疫组织化学检测.复苏冻存的脐带间充质干细胞,并传代培养至10代.对第10代的脐带间充质干细胞进行成骨诱导,其成骨能力分别通过钙结节和骨涎蛋白的免疫荧光检测以及茜素红染色检测来确定.结果 免疫组织化学结果显示,培养的细胞高表达间充质干细胞的表面标志物CD73、CD90和CD105,但是不表达造血细胞的表面标志物CD34和CD45.复苏后细胞的存活率是90％.细胞周期显示,第10代的细胞有80％处于G0/G1期,20％处于S+G2/M期.成骨细胞刺激因子诱导干细胞的骨涎蛋白染色呈阳性,并形成矿化的钙结节.结论 冻存的脐带间充质干细胞在成骨细胞刺激因子下能被诱导分化为成骨细胞,具有高度自我增殖和多向分化能力.
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小鼠脂肪源和骨髓源间充质干细胞表面标记表达的比较
目的 探讨小鼠脂肪源间充质干细胞(ADMSCs)和骨髓源间充质干细胞(BMSCs)表面标记表达的差异.方法 分别对小鼠脂肪源和骨髓源间充质干细胞进行成骨、成脂、成心肌分化诱导、鉴定;流式细胞术与细胞免疫荧光法检测CD29、CD44、CD45和CD73的表达并进行比较.结果 BMSCs形态均一,呈长梭形;ADMSCs形态多样,呈梭形、星形、多角形等,胞体较大,表面分泌物较多;两者均可诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和心肌样细胞.流式细胞术检测显示,BMSCs表面分子CD29、CD44和CD73表达率分别为(83.43±1.97)％、(90.33±0.81)％、(2.63±0.42)％;ADMSCs表面分子CD29和CD44的表达率分别为(53.1±1.05)％、(34.8±2.1)％,CD73表达不稳定,在1.8％～19.7％之间波动.两种细胞均不表达造血干细胞标记物CD45.免疫荧光显示,CD73分子与部分CD29、CD44阳性细胞共表达.结论 小鼠BMSCs和ADMSCs均具有成脂、成骨、成心肌分化能力,但是在形态上和分子表达上均存在差异.BMSCs的CD44和CD29表达高于ADMSCs;而CD73的表达则相反,CD73在两种细胞的表达均较低,在ADMSCs的表达不稳定.
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骨髓间充质干细胞移植对溃疡性结肠炎大鼠结肠的修复作用
目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)移植后对溃疡性结肠炎(UC)大鼠结肠的修复作用.方法 分离培养、荧光标记大鼠MSCs.SD大鼠45只随机分为3组,A、B组用免疫复合法诱导UC模型,C组为正常对照组.A组移植MSCs,B组移植等量PBS.移植后3d、7d、14d取结肠组织制作石蜡切片,观察病理变化;另取A组结肠组织制作冷冻切片,荧光显微镜下观察移植细胞的分布,免疫荧光染色后激光共焦显微镜下观察移植细胞细胞角蛋白(CK)的表达.结果 MSCs生长迅速,呈均一的成纤维细胞样.移植后7d、14d,A组结肠的修复明显优于B组;移植后3d,A组结肠即可见移植细胞,且均随时间延长而增多,至14d时多(P<0.05);移植后7d、14d A组少量细胞表达CK.结论 移植后的MSCs分布于大鼠UC模型的损伤结肠,并部分分化为结肠上皮细胞以参与损伤组织的修复.
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定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞
目的建立体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为成骨细胞的模型,为将MSC3用作骨组织工程的种子细胞奠定基础.方法用成骨添加剂(地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、维生素C 50mg/L)定向诱导传代大鼠骨髓MSCs分化为成骨细胞,通过形态学、生长曲线、免疫细胞化学及碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞.结果诱导组具有成骨细胞的形态和生长特点,增殖相对缓慢,但与对照组间的差异没有统计学意义(P＞0.05),碱性磷酸酶活性增强.结论建立了体外定向诱导大鼠骨髓MSCs向成骨细胞转化的模型,成骨添加剂不影响细胞的增殖,可迅速大量获得种子细胞.
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改良差时贴壁法分离培养鉴定小鼠骨髓间充质干细胞和内皮前体细胞
目的 探索同时从小鼠骨髓分离培养间充质干细胞(MSCs)与内皮前体细胞(EPCs)及对其鉴定的方法.方法 小鼠骨髓细胞经改良差时贴壁法分离,以48h为时间点,48h内贴壁细胞传至3代后行成骨、成软骨、成脂分化诱导实验,流式细胞术(FCM)检测其表面标记;48h后收集未贴壁细胞,传至3代后行血管形成实验,传至5代后行CD31免疫荧光细胞染色实验,FCM检测其表面标记.结果 第3代48h内贴壁细胞可诱导分化为骨、软骨和脂肪细胞,FCM检测Sca-1、CD29、CD45、CD11b阳性率分别为(98.30 ±0.75)％,(97.47±1.32)％,(1.87±0.15)％,(1.03±0.71)％;第3代48h后贴壁细胞在基质胶上可形成血管样结构,第5代48h后贴壁细胞特异性表面抗原CD31呈阳性表达,FCM检测CD34、CD133、血管内皮生长因子受体(VEGFR2)阳性率分别为(88.90±1.18)％,(92.73 ±2.90)％,(87.63±1.79)％.结论 采用改良差时贴壁法可同时分离培养扩增小鼠骨髓MSCs和EPCs,且简便高效稳定可重复.
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离子通道对间充质干细胞增殖、骨向分化的作用
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有向中胚层多向分化的干细胞,其细胞表面的离子通道表达多样,功能复杂.近年来,离子通道对间充质干细胞的功能调节备受关注.越来越.多研究发现离子通道参与各种信号传递,调控细胞功能,如增殖、分化等基因的表达等.本文主要从离子通道表达的角度介绍离子通道在间充质干细胞的增殖、骨向分化中的作用.
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促进间充质干细胞归巢的研究进展及其相关机制
间充质干细胞( mesenchymal stem cells,MSCs)被认为是一种有前景的再生医学干细胞资源,其强大的组织分化能力和免疫调节能力在修复的过程中起着关键作用.其中,MSCs要发挥治疗效果大部分依赖于对损伤部位的特定归巢,而其对靶位点的低归巢率严重影响着疗效.因此,如何促进MSCs的归巢率成为了提升其疗效的研究重点.本文就MSCs的归巢过程、促进MSCs向靶组织归巢及其机制、MSCs归巢与肿瘤进行了综述.
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间充质干细胞分化为内皮细胞的意义和细胞学基础
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)主要存在于骨髓中,是多潜能干细胞,在脐血、外周血、脂肪、皮肤等多种组织中也相继分离出MSCs.MSCs具有独特的免疫特性,在异种异体环境内长期存在,使其临床应用前景更为广泛.目前,MSCs的分离培养、诱导分化及鉴定体系已趋成熟,理论上可分化为所有中胚层来源的细胞,内皮细胞来源于中胚层,因此MSCs具有分化为内皮细胞的可能性.本文对MSCs内皮分化意义和细胞学基础及其新近的研究进展作一综述.
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骨髓间充质干细胞对小鼠动脉粥样硬化炎性反应的影响
目的 研究骨髓间充质干细胞(MSC)对小鼠动脉粥样硬化炎性反应的影响.方法 分离培养载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠的骨髓MSC并进行鉴定.36只小鼠随机数字法分为3组:阴性对照(Neg)组(n=12),阳性对照(Pos)组(n=12)和MSC移植(MSC)组(n=12),3组小鼠均予高脂饮食喂养12周制作动脉粥样硬化动物模型.Pos组和MSC组小鼠分别经尾静脉注入DMEM培养液和MSC,每3周注射1次,持续12周.实验结束时处死小鼠,取小鼠脾脏、主动脉根部淋巴结组织和外周血检测CD4+CD25+调节性T细胞百分比和功能,免疫荧光组织化学检测主动脉根部斑块组织淋巴细胞和巨噬细胞浸润.酶联免疫吸附法(ELISA)检测3组小鼠血清高敏C反应蛋白(hs-CRP)、基质金属蛋白酶1(MMP-1)、干扰素γ(IFN-γ)、转化生长因子β(TGF-β)和白细胞介素10(IL-10)水平.结果 与Neg组、Pos组比较,MSC组小鼠脾脏及淋巴结组织CD4+CD25+/CD4+比例显著升高,且脾脏Foxp3+CD25+/CD4+比例也显著增加(均P＜0.05).MSC组调节性T细胞抑制效应性T细胞增殖的能力显著增加.与Neg组、Pos组比较,MSC组小鼠血清TGF-β和IL-10水平升高,而IFN-γ、hs-CRP和MMP-1水平显著降低(均P＜0.05).免疫荧光组织化学检测显示各组小鼠斑块组织中淋巴细胞和巨噬细胞浸润无明显差异.结论 MSC对动脉粥样硬化炎性反应具有抑制作用.
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系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞细胞因子分泌及其与病情活动的相关性研究
目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者骨髓间充质干细胞(MSCs)细胞因子分泌及其与疾病活动的相关性.方法 采用密度梯度离心和贴壁分离法对11例SLE患者和6例正常人骨髓MSCs进行分离培养,流式细胞术鉴定MSCs.取P2代细胞,半定量RT-PCR检测SLE患者骨髓MSCs白细胞介素-6(IL-6),IL-7,IL-11,巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和干细胞因子(SCF)的表达.结果 SLE患者MSCs均表达CD29、CD44和CD105,不表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR.两组P2代MSCs均表达IL-6、IL-7、IL-11、M-CSF和SCF.SLE患者组MSCs IL-6、IL-7表达降低(P＜0.01),IL-7的表达和SLE的活动评分(SLEDAI)呈负相关(r=-0.891,P＜0.05).结论 SLE患者MSCs细胞因子分泌异常,可能与SLE血液系统损害及病情活动相关.
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基因修饰的羊水间充质干细胞对缺血再灌注损伤心肌氧化应激水平的影响
目的 探讨AKT基因修饰的羊水间充质干细胞(AF-MSC)移植于兔缺血再灌注损伤心肌模型后对其氧化应激状态的影响.方法 将新西兰兔随机分成3组,A组:L-DMEM组、B组:AF-MSC(羊水间充质干细胞)组、C组:AKT-AFMSC(AKT-羊水间充质干细胞)组,建立兔心肌缺血再灌注损伤模型.再灌注开通前在梗死区及周边心肌外膜按分组类别直接注射:L-DMEM、AF-MSC和AKT-AFMSC.术后2h收集动脉血、术后21 d收集损伤心肌,采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力,硫代巴比妥酸(TBA)法检测丙二醛(MDA)含量.ELISA方法检测3-硝基酪氨酸(3-NT)、一氧化氮(N0)含量.结果 在再灌注后2h,AKT-AFMSC移植组与L-DMEM对照组和AF-MSC移植组比较:血清MDA含量(2.01±0.53比4.98±0.90和4.46±0.84)均显著降低(P＜0.01)、NO含量(12.38±1.54比19.15±3.40和18.47±7.22)均显著降低(P＜0.01)、3-NT含量(204.87±19.16比237.32±23.05和241.36±13.31)均显著降低(P＜0.01),SOD(185.72± 18.42比133.98±20.06和129.89±15.68)活力显著升高(P＜0.01),差异有统计学意义.术后21d,AF-MSC移植组和AKT-AFMSC移植组:较L-DMEM对照组心肌MDA含量降低(0.21±0.03和0.09±0.02比0.26±0.04)分别为P＜0.05,P＜0.01、NO含量降低(6.04±0.31和5.43±0.37比6.90±0.39)分别为P＜0.05,P＜0.01、3-NT含量降低(180.26±7.65和158.68±8.81比195.95±13.29)分别为P＜0.05,P＜0.01、而SOD活力升高(14.55±0.46和17.95±0.86比13.18±0.75)分别为P＜0.05,P＜0.01,差异有统计学意义,并且AKT-AFMSC移植组较AF-MSC移植组心肌MDA、NO、3-NT含量降低更明显(P＜0.01),SOD活力升高更明显(P＜0.01),两组相比较差异有统计学意义.结论 在缺血再灌注损伤心肌中,移植AKT基因修饰的羊水间充质干细胞能显著降低MDA、NO、3-NT水平,增加SOD活力,且较羊水间充质干细胞具有更强的抗氧化应激作用.
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间充质干细胞在结核分枝杆菌感染免疫反应中的作用研究进展
结核病(TB)每年导致200多万人死亡,在全球单一传染病死亡率中位居第二.尽管宿主产生了强大的免疫反应,但结核分枝杆菌(MTB)还是成功地逃避了宿主的免疫,并建立了一个持续性感染的状态.MTB以何种机制逃避有力的宿主免疫反应仍不完全清楚.有研究证实间充质干细胞(MSCs)参与了宿主抗MTB的免疫反应.MTB通过招募MSCs到达感染部位来抑制T细胞的免疫反应.MSCs渗入感染MTB的小鼠组织和T淋巴细胞中,参与肉芽肿的形成,诱导Tregs的分化和发育及建立T细胞耐受.MSCs可通过产生一氧化氮(NO)来抑制T细胞的免疫反应,及影响TGF-β受体Ⅱ的功能来增加TB的易感性.MSCs在MTB逃避宿主的免疫反应中起着重要的作用,有望成为TB治疗的独特靶点.
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蚕丝蛋白/PCL共混取向纤维的力学性质与细胞响应
蚕丝蛋白因其良好的机械强度、生物相容性和耐灭菌性,是目前骨修复领域不可多得的天然蛋白支架材料.为提高蚕丝蛋白支架对细胞定向移动的引导能力和力学强度,采用静电纺丝方式制备较高取向度的PCL/蚕丝蛋白共混纤维支架,并与非取向型对比.通过扫描电镜图像分析技术表征静电纺丝纤维表面的取向度,并比较不同纤维排列结构下的力学性质.间充质干细胞在骨修复中应用广泛.人源骨髓间充质干细胞来自健康献髓者,在体外培养条件下,测试不同结构材料对间充质干细胞增殖的影响,并使用活细胞工作站实时追踪细胞在不同材料表面的运动功能.结果表明,在取向静电纺丝纤维支架中,91％的纤维分布于±10°范围以内,且该支架具有力学的各向异性,具有较大的轴向拉伸模量.在间充质干细胞增殖96 min后,中取向静电纺丝纤维支架组的细胞数量产生显著差异.在取向纤维材料表面生长的间充质干细胞展现出小的细胞分布夹角,仅为6.57°±4.45°,同时,取向纤维表面的细胞长度有显著提高(236.46±82.00) μm.在进一步的实时细胞追踪中,在细胞的主要移动方向上,取向纤维表面的细胞分解移动速度达6.66 μm/h,远远高于其他表面.因而,取向静电纺丝纤维支架可能在体内应用中支持成体干细胞增殖,并加快早期细胞定向迁移.
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外周血间充质干细胞移植对球囊损伤兔血管平滑肌细胞凋亡的影响
探讨外周血间充质干细胞(MSCs)移植对模型兔颈动脉球囊成形术后平滑肌细胞凋亡的影响.粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员5 d后采集外周血,用密度梯度离心法结合反复贴壁法分离培养获得纯化的MSCs,以增强型绿色荧光蛋白(GFP)报告基因标记备用.建立兔动脉粥样硬化狭窄模型,随机分为MSCs移植组及对照组,于颈动脉球囊成形术后分别静脉注入MSCs或等体积培养液.术后7、14、28 d取球囊损伤血管标本经TUNEL法(TdT-mediated d-UTP nick end labeling)测定血管平滑肌细胞凋亡率;同时进行归巢MSCs的鉴定;此外,测定术后28 d的内膜、中膜面积,再狭窄率及再内皮化情况.术后7、14、28 d,与对照组比较,移植组平滑肌细胞凋亡率明显增高;仅在移植组血管组织中有GFP阳性细胞分布;术后28 d,移植组内膜面积、内膜中膜面积之比及再狭窄率显著低于对照组,而再内皮化程度则明显优于对照组.静脉移植外周血MSCs能够促进模型兔球囊损伤血管快速内皮化,抑制新内膜增生、减少再狭窄率;这一作用可能与损伤血管局部平滑肌细胞凋亡增加有关.
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应用搅拌式生物反应器大量扩增人胎盘间充质干细胞的实验研究
探讨应用搅拌式生物反应器培养技术体外扩增人胎盘间充质干细胞(hPDMCs)的方法.以 hPDMCs为种子细胞,利用微载体悬浮法在搅拌式生物反应器内进行体外培养,同时设置静态培养的培养瓶为对照组,观察细胞的扩增速率、细胞代谢(乳酸、葡萄糖、培养液的pH值)的变化,检测生物反应器培养前、后干细胞的表面标记物.hPDMCs 在搅拌式生物反应器内每代可以扩增 (10.55±1.62) 倍,明显高于对照组 (6.10±0.11) 倍的扩增值(P＜0.05),且细胞生长代谢指标优于对照组;流式细胞仪检测应用搅拌式生物反应器,培养后细胞表面标记物的表达率无明显改变(P>0.05). 搅拌式生物反应器能够提供良好的细胞生长环境,建立用于 hPDMCs 的大量扩增的体外三维培养体系.
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基于AFM形态学观察的细胞铺展机理的假想
本研究提出了细胞铺展机理的三个可能模型:"橡皮泥"模型、"钢筋混泥土"模型和"自我膨胀"模型.应用原子力显微镜观察了处于不同铺展程度、具有不同形态的人骨髓间充质干细胞的整体和局部外部形貌,并根据观察结果,初步推断"钢筋混泥土"模型可能就是细胞铺展的机理.尽管证据还不够充分,需要进一步的研究,却为今后的研究提供了可能的模型和研究手段.细胞铺展机理的解决必将进一步促进细胞生物学和生物医学工程等学科的发展.
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间充质干细胞与组织工程血管
间充质干细胞在再生医学领域中具有重要的应用价值,其增殖能力强,免疫原性低,具有良好的分化潜能,是理想的组织工程血管种子细胞.本文系统总结了应用间充质干细胞构建组织工程血管的研究进展,介绍了间充质干细胞分离纯化和鉴定方法,分类阐述了间充质干细胞构建组织工程血管的几种方法,并探讨了其优缺点.
