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脐血间充质干细胞的分离鉴定及其向脂肪和成骨的分化
目的分离鉴定脐血(UCB)中的间充质样干细胞(MLSC),探索其向脂肪和成骨分化的可行性.方法用羟乙基淀粉沉淀法分离脐血有核细胞,利用细胞贴壁生长特性分离纯化脐血间充质样干细胞;流式细胞仪检测其表面标志;多种成分联合诱导其向脂肪、成骨方向分化,细胞化学染色检测诱导后的细胞变化.结果培养得到一组间充质样干细胞,不表达造血细胞的标志(cD34/CD45/CD14)及内皮细胞的标志CD106,强表达间充质细胞的标志CD29、CD44和CD13,在适当的诱导条件下可向脂肪及成骨方向分化.结论脐血中含有间充质样干细胞,表达间充质干细胞的表面标记,并可以向脂肪、成骨方向分化,因此可以作为组织工程的种子细胞.
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小鼠胎肝间充质干细胞的分离及鉴定
目的 分离培养小鼠胎肝间充质干细胞(flMSCs).方法 改良贴壁法分离BABL/c胎鼠肝脏间充质干细胞,测定生长曲线检测增殖能力;流式细胞术分析细胞周期和表型;体外诱导贴壁细胞向脂肪、软骨、骨组织分化并鉴定.结果 贴壁法分离的flMSCs呈均一梭形,细胞倍增时间约为24 h.83.76%±2.88%的flMSCs处于G0/G1期,表达间质系列表面标志CD44、CD29,不表达造血细胞表面标志CD45、CD11b;诱导后能向脂肪、软骨、骨组织方向分化.结论 贴壁法可以分离flMSCs,传代有助其纯化;flMSCs具有强增殖能力和分化潜能,是理想的干细胞治疗来源.
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大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为成熟肝细胞样细胞
目的 建立和优化大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离培养方法 ,探讨其肝系分化条件及潜能.方法分离5～6周龄大鼠骨髓细胞,Percoll密度梯度离心得到单个核细胞,贴壁法培养和纯化MSCs.用形态学观察、反转录聚合酶链反应和免疫细胞化学法探讨培养底物、细胞因子种类与浓度对MSCs肝分化潜能的影响.结果 57%Percoll密度梯度离心能在骨髓单个核细胞分离的质和量上达到佳.贴壁24h后去悬浮细胞、低接种密度传代培养可获增殖能力强、功能活跃的MSCs.MSCs在10 mg/L纤维连接蛋白为底物、HGF/FGF-4诱导下,纤维状细胞渐变为圆形,表达白蛋白及其mRNA,不表达甲胎球蛋白.结论 优化大鼠周龄、分离液的密度、细胞培养方法有助于获得多向分化潜能保持良好的MSCs.MSCs在HGF/FGF-4诱导下呈成熟肝细胞样细胞表现.
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人胚胎干细胞向间充质干细胞分化的低血清诱导法的建立
目的 建立人胚胎干细胞向间充质干细胞分化的低血清诱导方法.方法 用低血清培养体系培养人胚胎干细胞,每3d半量换液,7～10d后消化成单细胞用扩增培养基培养,每3d传代1次.结果 人胚胎干细胞呈克隆样增殖,边缘呈锯齿状,表达多能干细胞标志OCT4、SOX2和NANOG.诱导3d后,克隆间隙出现体积较小的成纤维样细胞,增殖能力强,经两次传代后可获得形态一致的长梭形细胞.这些细胞表达间质细胞标志VIMENTIN,细胞均表达CD105、CD90 、CD73、CD44和HLA-ABC,不表达CD34 、CD45和HLA-DR,且具有成脂和成骨分化能力.结论 用低血清诱导法能快速获得较高纯度的人胚胎干细胞源性间充质干细胞.
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用组织贴壁法从整根脐带分离培养间充质干细胞及其生物学特性的检测
目的 建立从整根脐带分离培养间充质干细胞(UC-MSCs)的技术,并对其生物学特性进行检测.方法 用组织贴壁法分离UC-MSCs,并通过传代进行纯化和扩增培养,绘制生长曲线,用流式细胞仪检测UC-MSCs表面抗原及细胞周期；在特定诱导体系中,检测UC-MSCs向脂肪、成骨及软骨分化的潜能；用RT-PCR检测多能干细胞标志多能干细胞标志Oct-4,Sox-2,NanogmRNA水平.结果 成功建立了UC-MSCs分离培养的方法；贴壁细胞均表达CD73、CD90及CDi05,不表达造血细胞表型CD34、CD45和HLA-DR;细胞倍增时间为(24.04 ±0.49)h,Go ～G1期和S+G2+M期所占比例分别为81.56％和18.44％；UC-MSCs能够向脂肪、成骨和软骨分化；表达Oa-4,Sox-2,Nanog基因.结论 组织贴壁法是一种较好的分离培养UC-MSCs的方法,培养的细胞为更原始的间充质干细胞,增殖能力强.
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持续低氧增强人骨髓间充质干细胞体外增殖
目的探讨不同方式低氧对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)增殖的影响.方法采用血球计数板计数法和流式细胞术分别观察了间歇性低氧(3% O2 、10% O2)和持续性低氧(3% O2 、10% O2、100 μmol/L CoCl2、200 μmol/L CoCl2)对hMSCs数量以及增殖指数的影响.结果间歇性低氧对hMSCs数量和增殖指数无明显影响;持续性低氧各组hMSCs数量和增殖指数均增加(P＜0.05).结论持续性低氧可促进体外培养的hMSCs增殖,说明持续性低氧作为体外的一种可控制因素,可调节hMSCs的增殖,对于hMSCs的临床应用具有一定的意义.
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人脂肪间充质干细胞对皮肤创伤修复的作用
目的 探讨人脂肪间充质干细胞(hADSCs)皮内移植对小鼠皮肤创面修复的作用,为临床皮肤创伤后修复提供新的细胞治疗方法奠定基础.方法 分离培养hADSCs,取3～5代细胞通过免疫荧光法检测间充质干细胞相关的细胞表面标志物CD90、CD105、CD34和CD45的表达,并分别置于骨、软骨和脂肪诱导分化培养基中进行诱导分化,检测其多向分化潜能.在实验小鼠背部制备一个面积为1 cm×1 cm的皮肤创面,将磁性纳米颗粒标记的hADSCs以皮内注射方式移植到小鼠创面四周.分别于伤后0、7和14 d观察创面愈合情况,并与对照组进行比较分析.结果 人脂肪间充质干细胞表达CD90和CD105,不表达CD34和CD45,具有骨,软骨,脂肪诱导分化潜能；实验小鼠皮肤创伤后3d开始,可见各组创面逐渐缩小,伤后21 d创面愈合.移植组于创伤后第7天创面愈合率为(74.6％±4.1％),14 d为(96.5％±1.5％),均显著高于对照组7d的(26.7％±1.9％),14 d的(47.3％±2.3％),(P＜0.05).结论 hADSCs移植能够提高小鼠皮肤创面愈合的速度.
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人羊膜间充质干细胞的超微结构观察
目的 观察羊膜间充质干细胞的超微结构.方法 分离和培养人羊膜间充质干细胞(AMSC),进行传代培养、扩增,在显微镜下观察细胞形态.对传代培养至第3代的hAMSC进行流式检测和鉴定细胞表型,并在透射和扫描电子显微镜下进行超微结构的观察.结果 人AMSC呈梭形和多角形；高表达表面标志CD44,CD90,CD105和波形蛋白,不表达CD34和CD45.扫描电镜下可见细胞表面有大量小泡和微绒毛突起；透射电镜下见到胞核较大,呈圆形或椭圆形；胞质内线粒体、粗面内质网和高尔基体等细胞器数量丰富,有较多小泡.结论 从羊膜中分离培养的细胞具有间充质干细胞的生物学特性的超微结构.丰富的粗面内质网和高尔基体,提示,AMSC具有产生大量分泌蛋白的功能,可能是羊膜间充质干细胞旁分泌作用的基础.
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骨髓Sca-1+间充质干细胞移植减轻小鼠迟发型超敏反应
目的 探讨骨髓Sca-1+间充质干细胞(BMSCs)在迟发型超敏反应(DTH)小鼠中的免疫调控作用.方法 BALB/c小鼠随机分为对照组及MSCs注射组.注射组于0、2及6d腹腔注射Sca-1+ BMSCs,对照组注射0.9％氯化钠注射液.所有小鼠在7和14 d时分别于背部皮下与足跖注射C57BL/6小鼠脾细胞.24h后用千分尺测量小鼠足跖的肿胀,ELISA法测外周血细胞因子及FACS法测脾脏免疫细胞比例.结果 注射组小鼠足跖的肿胀程度[ (0.368 *0.126) mm]显著轻于对照组[(0.731±0.111) mm,P＜0.01].注射组外周血中IL-10和TGF-β含量显著高于对照组(P＜0.05)；而IL-12和TNF-α水平显著低于对照组(P＜0.05).注射组小鼠脾脏调节型T细胞和树突细胞的比例均明显高于对照组(P＜0.05).结论 BMSC通过上调抑炎因子和调节型免疫细胞的数量而减轻DTH小鼠的免疫反应.
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间充质干细胞分化潜力与免疫调节的研究
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是存在于成体间质组织中的一类多能干细胞群体,早是从骨髓组织中分离得到的,随后的研究发现从其他多种组织中也能分离得到,例如脂肪组织、脐带、胎盘等.它具有两个重要的生物学特征,即多能性和免疫调节能力.多年的研究显示,间充质干细胞在体外适当条件下可以大量扩增,并保持它向多种组织类型细胞分化的潜能,例如成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、血管内皮细胞、肝细胞、肠道上皮细胞、以及神经组织细胞.对间充质干细胞免疫调节能力的研究显示,间充质干细胞可以对免疫系统的多种类型功能细胞的增殖、功能等产生影响,研究多的是对免疫系统的核心抗原提呈细胞树突状细胞和淋巴细胞产生影响.
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microRNA-373参与调控人脂肪来源间充质干细胞成骨分化
目的 用microRNA-373(miR-373)的模拟物转染人脂肪来源Flk1+间充质干细胞(MSC),探讨microRNA-373对Flk1+ MSC成骨分化的影响.方法 利用脂质体作为载体,用miR-373模拟物瞬时转染Flk1+ MSCs,然后对其进行成骨诱导,碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色观察成骨情况,real-time PCR技术检测成骨标志性基因的表达.结果ALP染色和茜素红可见明显差异；real-time PCR检测结果显示,实验组(miR-373组)成骨标志基因runt相关转录因子2(RUNX2)(0.543±0.021)、ALP(0.556 ±0.024)和骨钙蛋白(OC) (0.499±0.017)的表达都明显低于对照组(NC组)(P＜0.05).结论 miR-373参与调控Flk1+ MSC向骨细胞分化.
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干细胞基础研究的新进展
近5年来,在世界范围出现干细胞的研究热潮,有关干细胞的论文大量发表,风起云涌.然而,有部分的实验结论缺乏充足的证据,而引起质疑.例如干细胞"横向分化"的假设错误地认为干细胞可以跨胚层、跨系别地任意地变身,脂肪变肝脏,肌肉变神经等等.成体干细胞的存在是21世纪一个伟大的科学发现.越来越多的实验证明成体组织中还存在胚胎发育过程遗留下的各个胚层的干细胞和各类组织干细胞.全身各类组织中的成体干细胞含有除了生殖干细胞外的各种干细胞.至今,只有在生殖组织中才能发现生殖干细胞,因而生殖组织以外的成体干细胞又称为亚全能干细胞.成体干细胞包括造血和非造血的干细胞,非造血的干细胞又包括了各种非造血组织的干细胞,例如神经干细胞和间充质干细胞等.间充质干细胞是全身结缔组织(骨、软骨、肌肉、脂肪、纤维、血管等)的干细胞,它是创伤、烧伤、缺血坏死、骨髓损伤等修复过程中所必不可少的,有巨大的临床应用前景.随着生命科学的全面发展,干细胞领域中的认识误区将逐步得到澄清,干细胞科学也必将健康地发展起来.
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蜕膜间充质干细胞免疫调节作用及临床应用研究进展
蜕膜间充质干细胞除了具有间充质干细胞一般表型及分化潜能外,还具有低免疫原性等独特性质,是一种多能基质细胞.蜕膜间充质干细胞不但为妊娠期间胚胎植入提供适宜环境,而且通过表达免疫调控因子与多种免疫细胞相互作用,如T细胞、NK细胞及DC等,发挥其在胚胎植入、免疫耐受建立及正常妊娠维持中的重要作用.目前蜕膜间充质干细胞已经应用于造血干细胞移植、再生治疗等,具有较高的临床应用价值.本文就蜕膜间充质干细胞的来源、特征、功能及临床应用前景等进行综述.
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自体骨髓间充质干细胞复合去抗原牛松质骨载体修复兔桡骨节段性骨缺损
目的:探讨以自体骨髓间充质干细胞(MSCs)复合去抗原牛松质骨载体(BCB)修复兔桡骨节段性骨缺损的效果.方法:抽取20只新西兰大白兔的骨髓并分离、培养、扩增和建立诱导MSCs,将其和BCB复合.手术建立兔双桡骨干15mm骨骨膜缺损的动物模型,实验侧植入MSCs/BCB,对照侧植入BCB,通过X线、组织学检查等手段观察不同时相的骨缺损修复情况.结果:在第12周时,实验侧骨缺损得到骨性修复,对照侧则未能修复.结论:MSCs在体内能成骨,MSCs/BCB能有效地修复节段性骨缺损.
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纤维蛋白胶对骨髓间充质干细胞黏附作用的影响
目的:探讨纤维蛋白胶(FG)对骨髓间充质干细胞(MSCs)黏附作用的影响,以提高组织工程骨(TEB)成骨能力.方法:将成骨诱导后人MSCs体外与同种异体的脱钙骨基质(DBM)复合构建组织工程骨,根据DBM中是否加入FG分为两组,A组加入FG,B组未加入FG.于构建后10 h计算细胞黏附率,24 h后用荧光显微镜观察MSCs在支架材料上的黏附情况,3 d、7 d用扫描电镜观察比较两组种支架材料的MSCs生长与增殖的差异.结果:体外构建10 h后,A组的细胞黏附率为(95.3±9.2)%,B组为(89.2±8.7)%,两者之间差异具有统计学意义(P＜0.05).24 h后荧光显微镜下见A组上黏附的细胞数量明显多,部分呈簇状和团状较均匀地密布;而B组细胞数量较少,呈散在非均匀分布.构建后3 d A组网孔间出现细胞外基质,至第7 d基质变得稠密;B组细胞外基质较少.结论:纤维蛋白胶与MSCs具有良好的组织相容性,能明显促进MSCs的黏附生长.
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双基因转染犬骨髓间充质干细胞复合HA/ZrO2生物材料新型组织工程骨的构建及其体外成骨能力的研究
目的：构建骨形态发生蛋白2(BMP-2)、血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)双基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合羟基磷灰石复合二氧化锆(HA/ ZrO2)生物材料的新型组织工程骨,并观察该组织工程骨在体外的成骨能力。方法采用有机泡沫作为模版,干铺烧制法制备新型的蜂窝状 HA/ ZrO2梯度生物材料,电镜观察新型生物材料的表面特性,生物力学试验机检测其力学性能。采取1岁龄健康 beagle 犬骨髓分离原代 BMSCs 进行培养,建立双基因修饰的 BMSCs 复合蜂窝状 HA/ ZrO2梯度生物材料的共培养体,构建新型组织工程骨。实验分为4组：未转染组,只转染BMP-2(BMP-2组)和 VEGF165(VEGF165组)单一目的基因的 BMSCs,以及转染 BMP-2、VEGF165共基因慢病毒的 BMSCs 组(BMP-2+ VEGF165组)。显微镜下观察细胞在支架材料上的生长情况,用碱性磷酸酶染色检测各组细胞成骨分化能力,免疫组织化学染色检测其成骨细胞特异性蛋白骨Ⅰ型胶原及骨钙素的分泌。结果新型材料电镜下其表面整体呈多孔状,孔径125~550μm,各孔之间存在缝隙联结；其平均抗弯强度为812.25 MPa,高可达987.12 MPa；共培养体建立后扫描电镜观察转染后的 BMSCs 在支架材料上黏附生长状况良好,双基因联合转染组细胞分泌基质旺盛；BMP-2+VEGF165组细胞碱性磷酸酶活性检测明显高于其他各组(F =1029.398,P <0.01),免疫组织化学染色在不同阶段发现成骨细胞早晚期分泌的骨Ⅰ型胶原及骨钙素特异性蛋白。结论新型的蜂窝状HA/ ZrO2梯度生物材料是一种合适种子细胞生长的支架材料,并且其力学满足人体四肢承重骨的需要；VEGF165、BMP-2双基因转染 BMSCs 后具有协同作用,能够促进其在体外的成骨分化。
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用骨髓间充质干细胞建立抗砷细胞模型
目的 用低剂量NaAsO2长期诱导人骨髓间充质干细胞(BMSCs),获得抗砷细胞,探讨机体抗砷机制.方法 选取胎儿BMSCs,采用细胞抑制率在5%～10%时的NaAsO2浓度(1 μmol/L)作为砷诱导浓度,同时设不加砷培养的胎儿BMSCs作为同步对照,用噻唑蓝法(MTT)监测细胞抗砷性是否产生;采用氢化物发生-原子荧光方法检测细胞砷含量,二硫代二硝基苯甲酸直接显色法,比较抗砷细胞与同步对照组胞内GSH,GST等砷代谢指标的变化,验证细胞是否获得抗砷性.结果 胎儿BMSCs经过18周NaAsO2诱导后,细胞对急性砷中毒的耐受性明显提高,排砷能力增强,细胞内GSH和GST活性增高.结论 胎儿BMSCs在低剂量NaAsO2长期诱导下,能分化为具有抗砷能力的细胞.
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小鼠卵黄囊间充质干细胞的培养及鉴别
目的 研究小鼠卵黄囊间充质干细胞(YS-MSCs)的分离、培养和鉴定.方法 显微分离妊娠10d的小鼠胚胎卵黄囊,经0.1%的Ⅰ型胶原酶消化1h得到卵黄囊细胞,取贴壁细胞培养,并于接近汇合时进行传代培养,透射电镜下观察YS-MSCs的超微结构;流式细胞仪检测YS-MSCs表面标志;钙钴法测定YS-MSCs碱性磷酸酶(AKP)活性;细胞组织化学检测YS-MSCs化学变化;地塞米松、胰岛素定向诱导YS-MSCs分化为脂肪细胞,油红0检测中性脂肪.结果 体外可获得YS-MSCs,细胞大多数呈梭形;透射电镜下YS-MSCs表面有微绒毛,胞浆中有丰富的线粒体、粗面内质网、高尔基复合体;核大,形态不规则;流式细胞术分析YS-MSCs免疫表型显示,原代和第1代YS-MSCs均为CD44、CD105阳性,CD34也有少量表达;细胞化学YS-MSCs PAS-过碘酸雪夫染色阳性,苏丹黑-B (S8)及碱性磷酸酶(AKP)染色阴性;YS-MSGs经成脂诱导后,胞浆中有脂滴形成,经油红0染色脂滴呈鲜红色.结论 小鼠YS-MSCs的生物学特性与成体间充质干细胞相似,且更为原始,提示其可作为组织工程的种子细胞来源.
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恒河猴骨髓间充质干细胞的生物学特性
目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)的细胞生物学特性. 方法免疫细胞化学检测细胞ALPase、Vimentin和Laminin活性.流式细胞术测定细胞周期和细胞表面抗原.MTT法测定细胞的生长曲线.原位杂交检测细胞端粒酶活性. 结果 MSCs ALPase和Laminin呈阴性,Vimentin呈阳性.细胞周期中G1、S、G2期的细胞所占百分比分别为89.5%、7.8%、7.7%;MSCs具有独特的表现特征,即CD166、CD29、CD44、CD105表达呈强阳性,阳性率高达96.7%以上,而CD34和HLA-DR呈阴性表达.细胞的平均倍增时间为32?h.细胞端粒酶活性呈阳性反应. 结论培养的细胞为未分化的骨髓间充质干细胞,而不是造血干细胞和成纤维细胞,且细胞具有较强的增殖能力.
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人间充质干细胞移植改善四氯化碳诱导性肝硬化大鼠的肝纤维化
目的研究人间充质干细胞(MSCs)移植对四氯化碳诱导性肝硬化大鼠肝纤维化的影响.方法 实验动物随机分为对照组和肝硬化组,肝硬化组采用60%的四氯化碳植物油皮下注射7周制成肝硬化大鼠模型,再随机分成肝硬化7周组、MSC对照组和MSC移植组.在MSC移植组,人胚胎脐带血源的MSCs鉴定后,经肠系膜上静脉注射移植入大鼠体内,3周后处死所有大鼠,行肝组织冰冻切片,抗人表皮生长因子受体(EGF-R)的免疫组织化学显色和天狼猩红染色. 结果肝硬化7周组、MSC对照组和MSC移植组大鼠的血清碱性磷酸酶白蛋白(ALP)、(ALB)和胆固醇(CHO)含量出现了不同程度的异常.肝硬化7周组大鼠肝组织中有大量的胶原纤维增生并形成假小叶;MSC对白蛋白照组与肝硬化7周组相似;仅在MSC移植组的大鼠肝中观察到散在的棕黄色的抗人EGF-R阳性细胞,肝组织中胶原纤维的量明显小于MSC对照组.结论经肠系膜上静脉移植人MSC,可明显改善四氯化碳诱导性肝硬化大鼠的肝纤维化程度,为肝硬化的治疗提供实验依据.
