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miR-21对肺癌干细胞增殖、侵袭和化疗敏感性的影响
目的：探讨miR-21对肺癌干细胞增殖、侵袭能力，以及对化疗药物敏感性的影响。方法采用流式细胞边缘群分选技术从人肺癌细胞系A549中分离出肺癌干细胞。应用脂质体分别介导成熟miR-21的阻遏物( in-hibitors)和模拟物(mimics)来抑制和增强肺癌干细胞miR-21的表达；实时荧光定量PCR检测肺癌干细胞中miR-21表达水平的变化；噻唑蓝( MTT)法检测转染干预前后肺癌干细胞的增殖情况和对化疗药物的敏感性；Transwell小室检测肺癌干细胞迁移能力。结果抑制组肺癌干细胞miR-21表达水平明显低于非转染组和阴性对照组，而增强组肺癌干细胞miR-21表达水平则显著高于非转染组和阴性对照组( P<0.05)；抑制组肺癌干细胞转染后各时间点增殖率较非转染组和阴性对照组明显降低，而增强组肺癌干细胞转染后各时间点增殖率较非转染组和阴性对照组显著升高(P<0.05)；Transwell实验显示抑制组转染后48 h穿过人工基底膜的细胞数为(29.55±5.48)个，明显少于非转染组和阴性对照组，而增强组转染后48 h穿过人工基底膜的细胞数为(74.47±8.63)个，明显多于非转染组和阴性对照组(P<0.05)；顺铂(DDP)和吉西他滨(GEM)对抑制组转染后48 h肺癌干细胞的IC50值明显低于非转染组和阴性对照组(P<0.05)；DDP和GEM对增强组转染后48 h肺癌干细胞的IC50值则明显高于非转染组和阴性对照组(P<0.05)。结论下调miR-21的表达可以抑制肺癌干细胞的增殖和侵袭能力，增强其对化疗药物的敏感性。
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白杨素抑制H1299细胞系肺癌干细胞样细胞肿瘤球形成
目的 观察白杨素是否抑制人肺癌H1299细胞系干细胞样细胞肿瘤球形成能力,并探讨其作用机制是否涉及CK2α表达和Notch1信号.方法 干细胞条件培养基悬浮培养与扩增H1299细胞系球形成细胞作为肺癌干细胞样细胞.不同浓度白杨素处理,肿瘤球形成法检测H1299球形成细胞的肿瘤球形成率;Western blot分析CK2α、Notch1和CD44蛋白表达.CK2α siRNA转染探讨白杨素作用机制.结果 白杨素(5、10和20μM)处理H1299球形成细胞72 h,肿瘤球形成率以浓度依赖方式降低;CK2α、Notch1和CD44蛋白表达下调.CK2 αsiRNA转染H1299球形成细胞导致Notch1信号抑制,并协同白杨素抑制肿瘤球形成.结论 白杨素具有抑制肺癌干细胞样细胞肿瘤球形成作用,其作用机制涉及下调CK2 α表达抑制Notch1信号传导.
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肺癌干细胞中存在容积激活氯通道
目的:研究肺癌干细胞中是否存在容积激活氯通道.方法:用免疫磁珠法分选非小细胞肺癌细胞系A549中CD133+细胞,用流式细胞术检测其纯度.用全细胞膜片钳记录CD133+细胞中是否存在容积激活氯电流.结果:本实验中免疫磁珠法分选出的CD133+肺癌干细胞,流式细胞术检测其纯度为92.14%;在22/40(55%) CD133+细胞上记录到容积激活氯电流.结论:CD133+肺癌干细胞中存在容积激活氯通道.
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吉非替尼诱导前后肺癌干细胞miRNAs的表达差异
目的 检测吉非替尼诱导前后肺癌干细胞miRNAs的表达差异情况,探讨miRNAs对肺癌干细胞吉非替尼耐药的影响.方法 采用流式细胞边缘群分选技术从人肺癌细胞系A549 中分离出肺癌干细胞.将肺癌干细胞置于含1 μmol/L 吉非替尼培养液中培养诱导5 d,采用miRNA芯片检测诱导前后肺癌干细胞中差异表达的miRNAs;实时荧光定量PCR(RT-PCR)验证miRNA芯片结果.将筛选出的miRNAs构建阻遏物和模拟物,并采用阳离子脂质体法转染至肺癌干细胞中(转染阻遏物的为抑制组,转染模拟物的为增强组).同时将未经转染处理肺癌干细胞作为非转染组和转染无关序列的肺癌干细胞作为阴性对照组.噻唑蓝(MTT)法观察其对吉非替尼敏感性的影响.结果 miRNA芯片结果显示吉非替尼诱导前后肺癌干细胞中有19条表达改变大于2倍的miRNAs.其中上调的miRNAs 有14条,下调的miRNAs 有5条.RT-PCR验证的结果与芯片结果相符.将筛选出来的miR-21构建阻遏物和模拟物,并成功转染至肺癌干细胞中.结果显示:吉非替尼对抑制组转染后48 h肺癌干细胞的半数抑制剂量(IC50)明显低于非转染组和阴性对照组(P<0.05);吉非替尼对增强组转染后48 h肺癌干细胞的IC50值则明显高于非转染组和阴性对照组 (P<0.05).结论 吉非替尼诱导前后肺癌干细胞中存在差异表达的miRNAs,调控肺癌干细胞miR-21的表达可以影响肺癌干细胞对化疗药物的敏感性.
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Notch1及Bmi-1在肺癌干细胞中表达的相关性及临床意义
目的：探讨Notch1和Bmi-1基因在肺癌干细胞组织中表达的相关性及其与肺癌病理特征之间的关系。方法：收集114例肺癌患者术后标本组织，对肺癌干细胞进行培养、分离、鉴定，应用免疫组化 SP法检测114例肺癌干细胞组织和30例正常肺组织中 Notch1和 Bmi-1的表达。结果：肺癌干细胞组织中Notch1和Bmi-1的表达均显著高于正常肺组织（P＜0．01）。Notch1与Bmi-1的表达呈正相关（r＝0．736，P＜0．05），且与肺癌的分化程度及淋巴结转移有关（P＜0．05），而与性别及肺癌组织类型无关（P＞0．05）。结论：Notch1与Bmi-1在肺癌干细胞中均呈现过表达，并呈正相关，与肺癌的恶性程度、转移密切相关，有望成为治疗肺癌的新靶点。
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Wnt5a在肺癌A549细胞球增殖和上皮间质转化中的作用及机制研究
目的 研究Wnt5a在A549细胞球增殖和EMT中的作用及相关机制.方法 利用无血清培养出A549细胞球后应用流式细胞术对其进行CD133+ CD44+表达检测.实验分为对照组、Wn5a组、p38组和Wnt5a+ p38组.应用Western blot观察各组Wnt5a、p-p38、β-catenin、Vimentin和E-cadherin蛋白的表达变化,并利用MTT和裸鼠成瘤实验观察Wnt5a shRNA慢病毒感染前后A549细胞球的生长抑制率和成瘤能力.结果 流式细胞术检测A549细胞球中CD133+CD44+阳性率为60.5％;Wnt5a蛋白在Wnt5a组和Wnt5a+ p38组中的表达较对照组明显下调(P＜0.05),p-p38蛋白、β-catenin蛋白、Vimentin蛋白在Wnt5a组、p38组和Wnt5a+ p38组的表达明显低于对照组(P＜0.05),而E-cadherin蛋白在上述3组中的表达显著高于对照组(P＜0.05).Wnt5a shRNA慢病毒感染A549细胞球12、24h和48 h时抑制率显著高于对照组(P＜0.05),并且该细胞的成瘤能力较对照组显著下调.结论 下调Wnt5a表达可抑制A549细胞球的增殖及EMT能力,可望成为治疗非小细胞肺癌的靶点.
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mmu-miR-294调控MMP3靶基因对LLC细胞侵袭迁移的影响
目的 预测并验证小鼠mmu-miR-294调控的靶基因,探讨其在肺癌发生发展中的生物学功能.方法 生物信息学预测mmu-miR-294可能调控的靶基因金属蛋白酶(MMP3),双荧光素酶检测验证mmu-miR-294调控MMP3的真实性；脂质体2000介导转染mmu-miR-294模拟物进入Lewis(LLC)细胞株,通过Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力的改变.结果 重组质粒经XbaⅠ单酶切能获得约5000 bp和100 bp的酶切片段,阳性克隆测序,双荧光素酶报告基因检测证明合成寡核苷酸链序列插入正确；脂质体2000介导转染mmu-miR-294模拟物,过表达实验组MMP3蛋白水平较对照组明显降低.转染mmu-miR-294模拟物后LLC细胞的侵袭迁移能力显著降低(P＜0.01).结论 低表达mmu-miR-294有助于维持LLC的侵袭转移特性,增加其表达水平可以有效抑制LLC的侵袭迁移能力.mmu-miR-294可能通过调控其靶基因MMP3表达而发挥功能.
关键词： mmu-miR-294 肺癌干细胞 肺癌 MMP3 -
依他尼酸联合顺铂化疗促肺癌A549细胞凋亡的作用及机制研究
目的 探讨依他尼酸(ethacrynic acid,EA)杀伤肺癌A549细胞球的作用及机制研究.方法 无血清培养基中培养A549细胞球,应用Western blot检测CD133、SOX2、EpCAM和ABCG2的蛋白表达水平.应用l、2、5、10、20 mg/mL的浓度顺铂(cisplatin,DDP)分别处理A549及细胞球48 h,用MTT检测48 h内细胞的存活率.应用比色法检测10、50、100、200 μmol/L EA对A549细胞球中谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)活性的抑制作用.应用流式细胞术、Western blot、Real-time-PCR、相差显微镜观察检测200 μmol/L EA处理A549细胞球前后ROS水平、细胞成球能力、β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白以及β-catenin启动子活性的变化情况.应用β-catenin腺病毒感染A549细胞球后,再用200 μmol/L EA的处理A549细胞球,利用Real-time PCR和Western blot检测β-catenin S、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白的变化,并用MTT检测A549细胞球增殖的抑制作用.结果 成功培养出悬浮的A549细胞球,其高表达肿瘤干细胞标志物CD133、SOX2、EpCAM以及耐药相关蛋白ABCG2,并可耐受不同浓度DDP的杀伤作用.200 μmol/L EA处理A549细胞球后ROS水平明显升高,而GST活性、β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白的表达、β-catenin的启动子活性、A549细胞球的成球能力显著下降,并且200 μmol/L EA联合5 mg/mL DDP可增强对抑制A549细胞球增殖的作用和增加细胞凋亡的水平(P＜0.05).过表达β-catenin后,200 μmol/L EA对β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白的抑制作用较空载体组显著减弱.此外,过表达β-catenin可显著缓解200 μmol/L EA联合5 mg/mLDDP对A549细胞球的增殖抑制作用.结论 EA通过抑制GST活性和β-catenin水平,发挥抑制A549细胞球增殖和干性,促进其凋亡的作用.EA可望成为治疗肺癌及肺癌干细胞的药物.
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西黄丸经Wnt信号转导通路关键蛋白β-catenin调控人肺癌干细胞增殖
目的:研究西黄丸经Wnt信号转导通路关键蛋白β-catenin调控人肺癌干细胞增殖的机制.方法:培养人肺腺癌细胞系LAC,应用流式细胞荧光激活(FACS)技术,筛选鉴定具干细胞特性的SP细胞;50只C57BL/6小鼠分为西黄丸高剂量组、中剂量组、低剂量组,环磷酰胺组、模型组5组,SP细胞调整细胞密度1×107/ml,每只小鼠右腋皮下接种0.2ml瘤细胞悬液,成瘤后,分组按32g/kg、16g/kg、8g/kg给以西黄丸药液灌胃,CTX组7.5mg/kg,模型组予等量生理盐水,连续给药14d,处死小鼠,剥取瘤块称瘤重,并计算抑瘤率.日本大耳白兔随机分为5组,按上述剂量和方法给药,各组连续给药3d后腹主动脉采血,离心,获得含药血清.SP细胞密度调至2×107/ml,种入培养瓶,分为西黄丸高、中、低剂量组,CTX组、空白组5组,分别加入如前所述制备的各组含药血清(血清、培养液体积比30％),培养24h后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法和蛋白印迹(Western Blot)法分别检测3-catenin mRNA及蛋白表达.结果:西黄丸32g/kg、16g/kg可明显抑制C57 BL/6小鼠体内肺癌移植瘤,同时可明显降低β-catenin mRNA及蛋白表达.结论:西黄丸可经由抑制β-catenin的表达,阻止肺癌干细胞Wnt信号转导通路激活,从而抑制肺癌干细胞增殖为肺癌细胞.
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肺癌干细胞标志物的研究现状
肺癌具有高度异质性,能够抵抗化疗药物治疗,5年生存率小于15％.尽管我们关于肺癌的知识在不断增多,但仍很难确定肺癌的异质性和耐药性的发病基础.肿瘤干细胞模型近年来吸引了很多注意力,通过这种模型可以解释各种肿瘤的异质性、耐药性、休眠、复发和转移.肿瘤干细胞理论较少涉及肺癌研究.本文综述了肺癌干细胞的鉴定方法,包括其细胞表面标志物和生物学特征,还讨论了肺癌干细胞与肺癌预后的关系,从而为消灭肺癌干细胞、攻克肺癌提供理论依据.
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肺癌干细胞作为靶点的肺癌治疗策略研究进展
肺癌发病率高、死亡率高,严重威胁人类健康,是肿瘤研究的热点之一.肺癌干细胞是指存在于肺癌组织中的一类细胞亚群,具有自我更新及分化能力并可能导致了肿瘤发生及肿瘤异质性的产生.肺癌干细胞理论可以解释肺癌复发、转移、抗化疗药物等特性,针对这类细胞的靶向治疗有一定的运用前景.本文简要介绍肺癌干细胞的标志物、其异常的信号通路等,并概述靶向肺癌干细胞的治疗策略.
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肺上皮干/祖细胞种类和研究方法进展
分离和鉴定肺上皮干/祖细胞,深入了解他们在肺脏生理病理条件下的具体作用机理,对于防治包括肺癌在内的肺脏疾病有重要意义.本综述介绍了已鉴定的肺上皮干/祖细胞种类和肺上皮干/祖细胞研究方法的新进展,前者具有区域特异性,主要包括位近端气道的基底细胞和导管细胞,位细支气管的Clara细胞、变异Clara细胞、细支气管肺泡干细胞和诱导出的krt5+细胞及位肺泡的Ⅱ型肺泡上皮细胞和Ⅱ型肺泡上皮祖细胞;后者主要包括肺损伤模型、谱系示踪技术、三维培养技术、移植、慢性标记细胞法及单细胞转录组学分析等.后简述了肺上皮干/祖细胞与肺癌的关系以及肺癌干细胞靶向药物治疗进展.
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人大细胞肺癌干细胞样细胞的富集及其功能研究
背景与目的 目前国内外还没有确切的、得到公认的肺癌干细胞的筛选标记分子、指标和方法,常用方法 为通过流式细胞技术,借鉴其他肿瘤干细胞分选标记来分选肺癌干细胞,但其筛选特异性低、工作量巨大.本研究采用无血清悬浮培养法富集肺癌干细胞,对肺癌干细胞的筛选方法 进行探索.方法 采用添加生长因子的无血清培养基对人大细胞肺癌细胞株L9981进行悬浮培养,获得肺癌细胞球体.对含血清培养贴壁L9981细胞和无血清培养成球后的L9981细胞,通过显微镜下观察比较二者的生物学形态,应用Vi-cell细胞活力分析仪计数细胞并绘制生长曲线比较二者的增殖能力,通过Transwell实验研究它们的侵袭能力差异,并通过接种裸鼠观察二者在体内的成瘤性来研究肺癌细胞球体的生物学功能.结果 与血清贴壁培养L9981细胞相比,无血清培养L9981细胞成球形生长,贴壁L9981和L9981球体细胞的倍增时间分别为(56.05±1.95)h和(33.00±1.44)h,球体细胞的侵袭和成瘤能力分别为贴壁L9981细胞的5倍和20倍.结论 通过无血清悬浮培养的L9981细胞可以形成肺癌球体细胞群,L9981球体细胞的侵袭和成瘤能力均明显高于贴壁L9981细胞,显示L9981球体细胞中富集了肺癌干细胞样的细胞.无血清悬浮培养肺癌球体细胞可作为富集肺癌干细胞样细胞的一种候选方法.
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milk-145通过下调OCT4基因仰制肺腺癌干细胞增殖
背景与目的 milk-145是通过miRNA芯片及qPCR验证筛选出的一种潜在肺癌"保护性"mRNA.本研究旨在探讨milk-145与肺癌干细胞之间的关系及分子机制.方法 miRNAZL片对肺腺癌患者瘤旁和正常组织进行表达谱分析;生物信息学软件预测milk-145潜在的靶基因;脂质体2000介导转染milk-145模拟物和阻遏物进人A549细胞株;实时定量PCR检测milk-145表达水平;Western blot检测OCT4蛋白水平;双荧光素酶报告基因验证milk-145是否作用于OCT4 mRNA的3'UTR区预测靶位;细胞增殖实验检测milk-145对于A549细胞生长的作用;流式细胞术检测干细胞表型CD 133'的表达.结果 在肺腺癌组织中milk-145表达明显低于瘤旁正常组织;miRanda软件预测OCT4是milk-145潜在靶基因;与对照组相比,milk-145模拟物组和阻遏物组milk-145表达分别明显上调和下调;milk-145对A549细胞的生长有双向调节作用,过表达milk-145抑制细胞生长;过表达milk-145可明显降低OCT4蛋白水平及干细胞表型CD 133百分比,而抑制milk-145表达则明显增加OCT4蛋白水平及CD 133百分比.双荧光素酶报告基因检测证明milk-145可作用于OCT4 mRNA的3'UTR区预测靶位.结论 milk-145可通过下调OCT4基因表达抑制A549肺腺癌细胞株中干细胞的增殖,是一种潜在的肺癌"保护性"miRNA.
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肺癌干细胞的分离、鉴定及耐药特性的总结
根据世卫组织统计数据来看,肺癌已经成为常见恶性肿瘤之一,其10年存活率低到10%左右.当前研究发现,肿瘤干细胞在恶性肿瘤发病、转移、复发中起着重要作用.本文首先介绍当前肿瘤干细胞的分离和鉴定研究的进展.当前,肺癌干细胞的研究还比较少,本文设计无血清培养法分离和鉴定肺癌干细胞,而后研究其相关耐药性.
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肺癌干细胞的研究进展
肺癌干细胞（ lung cancer stem cell，LCSC）是肺组织中一小部分具有自我更新和增殖分化潜能，并具耐药功能的特定细胞群。它与肺癌的发生、进展、转移、耐药关系密切。本文对肺癌干细胞的起源、分选以及所涉及到的相关信号通路和标志物等方面进行综述，为未来肺癌的临床诊断及治疗提供新的思路。
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肺干细胞、肺癌细胞和肺癌干细胞
干细胞和肿瘤发生发展的关系是近年来肿瘤研究领域的热点,随着研究的深入,越来越多的证据表明肿瘤细胞中的某些亚群具有干细胞的特性.干细胞学说认为,肿瘤干细胞是肿瘤的发生、生长、耐药以及转移、复发的根源,并且可能是由机体的正常干细胞或其前体细胞在一系列内外因素作用下增殖分化失常形成的.因此,肿瘤是一种干细胞疾病.目前人们已经能够成功分离白血病干细胞、乳腺癌和脑肿瘤干细胞[1-3].对其他一些实体瘤的研究也提示有相应的肿瘤干细胞存在[4-6],这其中包括肺癌干细胞[7-8]. 现就目前对正常肺干细胞和肺癌干细胞的研究现状作一综述.
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亚硒酸钠对肺癌干细胞侵袭和迁移的影响
目的:研究亚硒酸钠对肺癌干细胞侵袭和迁移的影响.方法:利用免疫磁珠细胞分选技术分选出肺癌干细胞,CCK-8实验检测不同浓度亚硒酸钠对肺癌干细胞活力的影响,Transwell小室法检测亚硒酸钠对肺癌干细胞侵袭能力的影响,细胞划痕法检测亚硒酸钠对肺癌干细胞迁移能力的影响,Western blot检测不同浓度亚硒酸钠对肺癌干细胞中SBP1及Ki67蛋白表达的影响.结果:成功分选出了纯度为82％的CD133+肺癌干细胞.CCK-8实验结果显示亚硒酸钠能够剂量依赖性地抑制肺癌干细胞的活力.Transwell小室法检测结果显示亚硒酸钠能够抑制肺癌干细胞的侵袭能力.细胞划痕实验结果显示亚硒酸钠能抑制肺癌干细胞的迁移能力.Western blot检测结果显示亚硒酸钠能够剂量依赖性地促进肺癌干细胞中SBP1的表达,抑制Ki67蛋白的表达.A549小鼠肺癌移植瘤结果显示,与控制组(注射生理盐水组)相比,瘤内注射亚硒酸钠能够显著抑制肿瘤的生长.结论:亚硒酸钠能够抑制肺癌干细胞的生长、侵袭和迁移,可能是治疗肺癌的潜在药物.
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p53抑制干细胞的自我更新能力而增敏奥沙利铂诱导肺癌细胞凋亡的作用及机制
目的:研究p53通过增加肿瘤干细胞不等向分裂的比例而增敏奥沙利铂(Oxaliplatin,L-OHP)诱导肺癌细胞凋亡的作用及机制,探索影响肺癌化疗效果的因素.方法:用Nutlin-3(N-3)调控肺癌细胞野生型p53的表达,研究p53对L-OHP诱导细胞凋亡及对肺癌干细胞不同分裂模式的影响;使用Akt激活剂及shRNA-GSK3β调控表达的肺癌细胞系,研究p53通过Akt调控奥沙利铂诱导的肺癌细胞凋亡,并抑制肺癌干细胞自我更新能力.在肺癌标本中检测GSK3β与磷酸化Akt1的表达及与预后的关系.结果:Nutlin-3上调了A549及H460细胞中野生型p53的表达,有效抑制了细胞增殖,增强L-OHP诱导细胞凋亡效果.Nutlin-3抑制磷酸化Akt1,促进肺癌干细胞不等向分裂,进而抑制肿瘤干细胞的比例,增敏L-OHP诱导肺癌细胞凋亡.Akt1磷酸化活性在p53介导的下游GSK3β表达增加的调控中起关键作用.50nmol/L的L-OHP通过抑制Akt1活性促进凋亡,10μmol/L的Nutlin-3对L-OHP诱导的肺癌细胞凋亡有协同作用,是通过共同调控Akt1/GSK3β通路的活性实现,Akt1的激活与GSK3β的抑制均显著地抵消了p53对L-OHP诱导的肺癌干细胞比例降低.结论:p53通过抑制磷酸化Akt1的水平调控GSK3β表达,促肺癌干细胞不均等分裂,增敏L-OHP诱导凋亡.肺癌中GSK3β的高表达与磷酸化Akt1的低表达预示较好的临床治疗效果.
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Id1在人肺癌细胞系A549肿瘤细胞球中的表达
目的:探讨Id1在人肺癌细胞系A549肿瘤细胞球中的表达情况,为肺癌干细胞的基因靶向治疗提供理论依据.方法:应用于细胞无血清培养技术培养A549细胞肿瘤细胞球,采用克隆形成实验检测肺癌肿瘤球细胞增殖能力,流式细胞术检测ABCG2在肺癌肿瘤球细胞中的表达情况,Westem blotting检测Id1在肺癌肿瘤球细胞中的表达情况.结果:与贴壁细胞相比,人肺癌细胞系A549肿瘤细胞球细胞具有较强的克隆能力,且高表达ABCG2,符合肺癌干细胞的特点,Id1在人肺癌细胞系A549肿瘤细胞球细胞中高表达.结论:Id1可能成为靶向肺癌干细胞肺癌治疗的靶点.
