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腹腔注射烟草烟雾提取物制备小鼠慢性阻塞性肺疾病模型的评价
目的 对烟草烟雾提取物(CSE)腹腔注射诱导小鼠慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)模型进行评价并探讨可能的发病机制.方法 6～8周龄体重为21～23 9的SPF级近交系C57BL/6雄性小鼠36只,按照随机数字表法分为2组,每组18只,腹腔注射CSE建立小鼠慢阻肺模型,测定小鼠肺力学参数、肺泡灌洗液中细胞总数和细胞分类数目、观察肺组织病理学改变同时测量平均内衬间隔(MLI)及肺泡破坏指数(DI);检测基质金属蛋白酶12(MMP12)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)及肺组织匀浆中促炎细胞因子[肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β及IL-6]、Th1型细胞因子IFN-γ 、Th2型细胞因子IL-5、IL-13和中性粒细胞趋化因子的表达水平.结果 实验21、41和61 d,CSE组小鼠肺总量(TLC)分别为(0.73±0.02)、(0.83±0.04)和(0.97±0.02)ml,均显著高于对照组的(0.65土0.01)、(0.67±0.02)和(0.71±0.04) ml,差异有统计学意义(t值分别为4.109、3.666和5.994,均P＜0.01);41和61 d呼吸系统顺应性(compliance)分别为(0.041土0.002)和(0.039±0.001) ml/cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa),较对照组的(0.030±0.001)和(0.032±0.003) ml/cmH2O均显著增加,差异有统计学意义(t值分别为4.788和2.508,均P＜0.05);41和61 d呼吸系统阻力分别为(0.959±0.016)和(0.976±0.020) cmH2O·s·ml-1,均显著低于对照组的(1.043±0.022)和(1.085±0.043) cmH2O·s·ml-1,差异有统计学意义(t值分别为2.928和2.321,均P＜0.05).21、41和61 d肺泡灌洗液中细胞总数分别为(23.83±2.63) ×104、(20.67±1.69)×104、(18.67±1.56)×104,明显高于对照组的(7.33±0.61) ×104、(7.67±0.76)×104、(6.67±0.88)×104,差异有统计学意义(t值分别为6.119、7.027、6.685,均P＜0.01),其中以中性粒细胞和巨噬细胞为主.肺组织出现慢阻肺典型病理学改变,包括炎症细胞浸润,实验组3个时间点的MLI分别为(48.0±1.4)、(56.1±2.4)和(59.3±3.3) μm,显著高于对照组的(40.5±1.2)、(43.7±1.2)和(43.5±1.2)μm,差异有统计学意义(t值分别为4.015、4.695、4.612,均P＜0.01),DI分别为(15.2±1.3)％、(22.4±1.3)％、(23.8±1.0)％,高于对照组的(11.1±0.9)％、(10.8±1.0)％、(12.4±0.7)％,差异有统计学意义(t值分别为2.532、7.225、8.471,均P＜0.05).MMP12和NE表达增加,TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ及KC较对照组小鼠均明显升高.结论 小鼠腹腔注射CSE可在较短时间内建立慢阻肺模型,肺部炎症和蛋白酶/抗蛋白酶失衡可能参与发病过程.
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烟草烟雾提取物诱导人小气道上皮抗原R对转录因子snail表达的影响
目的 观察烟草烟雾提取物(CSE)刺激的小气道上皮中人抗原R的表达情况,探讨人抗原R对上皮间质转化(EMT)关键转录因子snail的调控作用.方法 体外培养人小气道上皮细胞(HSAEpiC)并给予CSE刺激,按CSE浓度和时间分为对照组、1％-24 h组、3％-24 h组、1％-48 h组及3％-48 h组.应用实时荧光定量PCR法、Westem blot法检测CSE刺激下人抗原R mRNA和蛋白水平.采用小RNA(siRNA)干扰技术特异性降低人抗原R表达,根据转染情况分为对照组、转染对照组及转染组,观察转染后mRNA和蛋白表达的变化,检测CSE刺激及人抗原R干扰时转录因子snail、上皮细胞标志物E-钙黏蛋白及间叶细胞标志物波形蛋白表达水平变化.结果 CSE刺激后,人抗原R mRNA及蛋白水平表达均升高,1％-24 h组mRNA吸光度值从(1.12±0.04)升高到(1.26±0.05),蛋白表达量从(1.17 ±0.06)升高到(1.42 ±0.06);3％-48 h组mRNA吸光度值从(1.41±0.06)升高到(1.49±0.06);蛋白表达量从(1.35±0.08)升高到(1.42±0.06),组内前后比较差异有统计学意义(均P＜0.05).人抗原R siRNA转染后,mRNA[(0.33±0.06),(1.02±0.10)]及蛋白表达水平明显降低[(0.46±0.07),(0.97±0.06),均P＜0.01];对照siRNA转染后人抗原R表达变化无统计学意义[mRNA:(1.02±0.10),蛋白:(0.97 ±0.06),均P＞0.05].3％ CSE刺激48 h后,人抗原R(1.47±0.11)、snail(1.46±0.05)和波形蛋白(1.56±0.05)表达升高,E-钙黏蛋白(0.49±0.05)表达降低;人抗原R siRNA转染后,人抗原R(0.84±0.06)、snail(1.22±0.06)、波形蛋白(1.11±0.09)表达降低,E-钙黏蛋白表达升高(0.73±0.06,均P＜0.05).结论 CSE促进了小气道上皮细胞中人抗原R的表达;人抗原R参与了EMT关键转录因子snail的调控过程,并可能通过该作用调控EMT进程.
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烟草烟雾提取物影响主动脉平滑肌细胞GATA-2的表达
背景：吸烟是动脉粥样硬化形成的主要危险因素之一。目的：观察烟草烟雾提取物对大鼠血管平滑肌细胞中GATA-2浓度的影响及早期生长反应因子1在其中的作用。方法：体外培养大鼠血管平滑肌细胞，用不同浓度(0，5%，10%，20%)烟草烟雾提取物刺激，采用RT-PCR的方法检测烟草烟雾提取物对GATA-2的影响。用筛选出的适合的烟草烟雾提取物浓度处理大鼠血管平滑肌细胞不同时间(0，4，8，12，24 h)后，检测GATA-2 mRNA的变化，以及加入生长反应因子1抑制剂后GATA-2 mRNA的变化。结果与结论：与0浓度烟草烟雾提取物相比，5%低浓度烟草烟雾提取物刺激后，GATA-2 mRNA表达较10%中浓度和20%高浓度增加的更显著。不加烟草烟雾提取物组即0 h 组血管平滑肌细胞中有少量 GATA-2的mRNA，5%烟草烟雾提取物刺激后于4 h内开始增加，8 h达高峰。加入生长反应因子1抑制剂后5%烟草烟雾提取物诱导的血管平滑肌细胞GATA-2 mRNA表达明显降低。提示烟草烟雾提取物可通过生长反应因子1促进GATA-2增加，抑制生长反应因子1后，GATA-2的表达减少。
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芹菜素对烟草烟雾提取物诱导血管内皮细胞损伤的作用
目的 探讨芹菜素改善烟草烟雾提取物诱导的血管内皮细胞损伤的机制.方法 培养人脐静脉内皮细胞株,给予烟雾提取物(CSE)模拟吸烟环境和不同浓度芹菜素.实验分为正常对照组、CSE组、芹菜素组,检测细胞存活率、凋亡率、细胞内活性氧ROS水平,以及细胞上清液中IL-6、TGF-β、INF-γ各因子的表达.结果 芹菜素在24h和48 h均能显著缓解不同浓度CSE诱导的内皮细胞存活率的降低,降低不同浓度CSE诱导的内皮细胞的凋亡率,同时芹菜素可抑制CSE诱导的细胞内ROS水平,以及上清液中炎性因子IL-6、TGF-β、INF-γ的升高,差异均有统计学意义(P ＜0.05,P＜0.01).结论 芹菜素以血管内皮细胞凋亡和炎性反应为标靶,抑制吸烟引起的血管内皮细胞损伤,为临床治疗提供理论依据.
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PLTP在香烟诱导A549细胞合成白介素8中的作用
目的：研究磷脂转运蛋白（ Phospholipid transfer protein ，PLTP）对香烟诱导人肺泡上皮A549细胞合成白介素8（Interleukin－8，IL－8）的影响。方法：体外培养人肺泡上皮A549细胞株24 h，加入不同浓度的烟草提取物（Cigarette smoking extracts，CSE）共培养24 h；1．0％CSE与A549细胞株共培养6、12、24、48 h；PLTP siRNA预处理后，加入CSE共培养24 h。3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴盐（ MTT）法检测A549细胞增殖情况；实时定量PCR（ RT－PCR）检测PLTP和IL－8 mRNA的表达量；蛋白质印迹法（ Western blot ）检测PLTP的表达量；酶联免疫吸附法（ Enzyme－Linked Immunosorbent Assay ， ELISA）检测IL－8相对含量。结果：0．125％烟草提取物促进A549细胞增殖，0．25％、0．5％、1．0％ CSE浓度对A549细胞生长无明显影响，而2．0％、4．0％CSE浓度抑制A549细胞增殖；不同浓度的（0．25％、0．5％、1．0％） CSE作用24 h后，PLTP和IL－8 mRNA及蛋白表达量增加，并且IL－8蛋白分泌呈现一定时间依赖性；PLTP siRNA处理后，IL－8表达量明显升高（ P＜0．001）。结论：PLTP基因缺失促进香烟诱导A549细胞合成IL－8。
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PLTP在香烟诱导HBECs合成IL-8中的作用
目的：：研究磷脂转运蛋白(PLTP)对香烟诱导人支气管上皮细胞(HBECs)合成白介素8(IL-8)的影响。方法：Wistar大鼠连续3 d被动吸烟,收集支气管肺泡灌洗液( BALF),苏木精-伊红( HE)染色,免疫组织化学法( IHC)检测蛋白表达；体外培养HBECs,不同浓度烟草提取物( CSE)刺激；PLTP siRNA干扰后,进行CSE刺激。 MTT法检测细胞增殖,同时检测IL-8含量及PLTP表达。结果：烟熏组BALF白细胞计数以及分类计数较对照组均明显升高( P<0.01), IHC显示烟熏组PLTP和IL-8蛋白表达高于对照组；高浓度CSE (2%、4%)抑制HBECs增殖( P<0.001)；不同浓度的CSE作用24 h后, IL-8 mRNA及蛋白表达量增加,而PLTP蛋白表达量下降,并且IL-8蛋白分泌呈现时间依赖性；PLTP siRNA处理后,IL-8表达量明显升高(P<0.001)。结论：PLTP基因缺失促进香烟诱导HBECs合成IL-8。
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烟草烟雾通过TGF-β1/Smad2通路诱导RLE-6TN发生上皮间质转化
目的:探讨烟草烟雾提取物(Cigarette smoke extract,CSE)在诱导大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞RLE-6TN发生上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用及机制.方法:以不同浓度(0.25％,0.5％及1％)CSE刺激RLE-6TN细胞株;TGF-β1受体抑制子(SB431542)预处理后,加入1％ CSE共培养.实时定量PCR (RT-PCR)检测E-cadherin和Vimentin RNA表达;印迹法(Western blot)检测TGF-β1、Smad2、磷酸化的Smad2(p-Smad2)、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达量.结果:经不同浓度的CSE作用,E-cadherin无论是在RNA还是在蛋白水平表达均下调,而Vimentin表达均上调;同时,TGF-β1、p-Smad2和N-cadherin蛋白表达量增加;TGF-β1受体抑制子(SB43542)干预后,p-Smad2表达量明显降低(P＜0.05),E-cadherin蛋白表达量较对照组明显增加(P＜0.05),N-cadherin和Vimentin蛋白表达量较对照组明显降低(P＜0.05).结论:CSE可能通过激活TGF-β1/Smad2信号通路,参与调节E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,从而诱导RLE-6TN发生EMT.
关键词： 大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞 烟草烟雾提取物 上皮间质转化 TGF-β1 P-Smad2 -
烟草烟雾提取物对人牙龈成纤维细胞在3Y-TZP表面生长状态的影响
目的:观察比较不同浓度烟草烟雾提取物(Cigarette Smoke Extract,CSE)对人牙龈成纤维细胞(HumanGingival Fibroblasts,HGFs)在3mol％氧化钇作为稳定剂的四方氧化锆多晶体陶瓷(3Y-TZP)种植材料表面粘附、增殖、形态伸展及细胞状态的影响.方法:原代培养HGFs并进行细胞来源鉴定；SRB法检测不同浓度CSE作用下HGFs在材料表面粘附、增殖情况；免疫荧光染色,病理图像分析系统计数评价HGFs细胞铺展面积及形状系数改变；激光共聚焦显微镜下观察拍照,观察凋亡形态；扫描电镜观察细胞粘附的形态结构改变.结果:细胞波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性；随CSE浓度升高,HGFs在材料表面粘附、增殖、铺展面积、形状系数及形态伸展均呈下降趋势,各实验组与对照组间均存在显著差异(P＜0.05),抑制作用随浓度升高更加明显,呈浓度依赖性.结论:CSE对HGFs在3Y- TZP种植材料表面的生长可产生明显抑制作用.提示吸烟对陶瓷种植体植入后的软组织界面产生不良影响,其损害程度可能与烟草有害物质的接触量有相关性.
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红霉素对烟草烟雾提取物作用下人巨噬细胞释放相关炎症因子的影响
目的:研究红霉素(EM)对烟草烟雾提取物(CSE)作用下人巨噬细胞释放相关炎症因子的影响.方法:体外培养人类单核细胞系U937细胞,在细胞培养液中加入佛波酯(PMA)将其诱导分化为人巨噬细胞.将细胞分为3组:对照组、CSE组、EM+ CSE组.CSE组用1％浓度CSE刺激24 h,EM+ CSE组用1 mg/L EM预处理24 h后,用1％浓度CSE刺激24 h.用液相芯片技术检测各组细胞上清液中嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)、白介素(IL) 17A、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1β、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、IL-8、MIP-1α、IL-1β、IL-6含量.结果:CSE显著促进人巨噬细胞释放eotaxin、IL-17A、MIP-1β、MCP-1、IL-8、MIP-1α、IL-1β、IL-6(P＜0.05),而EM能抑制CSE引起的上述炎症因子释放增加(P＜0.05).结论:EM可能通过抑制CSE刺激引起的人巨噬细胞释放eotaxin、IL-17A、MIP-1β、MCP-1、IL-8、MIP-1α、IL-1β、IL-6等细胞因子,抑制烟草烟雾暴露相关疾病进展.
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热休克蛋白27在烟草烟雾提取物介导的牙龈成纤维细胞损伤中的表达变化
目的：???观察在不同质量分数烟草烟雾提取物（CSE）干预下，热休克蛋白（HSP）27在人牙龈成纤维细胞（HGFs）损伤过程中的表达。方法???取原代培养并经过鉴定的3~8代HGFs，采用细胞划痕试验检测不同刺激质量分数（0、2.5%、5.0%、12.5%、25.0%、50.0%）的CSE对HGFs体外迁移的影响，并采用Western?blot方法检测HSP27在HGFs中的表达。结果???CSE质量分数越高，细胞的迁移能力越弱；HSP27在正常HGFs中呈弱阳性表达，在CSE刺激后的HGFs中呈强阳性表达，且随CSE质量分数的增高，HSP27的相对表达量有逐渐增高的趋势，与细胞迁移能力相反。结论???HSP27在CSE介导的HGFs损伤中表达升高，在CSE介导的上皮损伤中有重要作用。
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烟草烟雾提取物促进髓样树突状细胞共刺激分子的表达
目的 通过体外实验研究烟草烟雾提取物(CSE)对小鼠髓样树突状细胞(mDC)成熟的影响及可能的机制.方法 小鼠骨髓来源的单个核细胞加入粒-单集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)和含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液诱导出可供实验用的高纯度的未成熟DC (iDC),分空白对照组和CSE刺激组;CSE刺激组按15 mL/L的终浓度加入CSE,两组继续培养24h,流式细胞检测技术检测mDC的共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达.结果 空白对照组的mDC低表达CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ;CSE刺激后mDC表达CD40、CD80和MHC-Ⅱ比空白对照组明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 烟草烟雾提取物促进小鼠骨髓来源的mDC的CD40、CD80和MHC-Ⅱ的表达.
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PI3K抑制剂对正常人外周血单个核细胞糖皮质激素抵抗的作用
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是以气流受限为特征的全身慢性进行性疾病,炎症是重要的发病机制之一,糖皮质激素作为一种有效的抗炎药物,在炎症性疾病的治疗中起着至关重要的作用,但由于COPD患者体内存在糖皮质激素抵抗,使激素对COPD慢性炎症的疗效较差[1].有研究显示氧化应激可激活炎症细胞的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)信号通路,使组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)表达降低,导致糖皮质激素抵抗[2-3].因此,本研究采用烟草烟雾提取物(cigarette smoking extracts,CSE)及PI3K抑制剂作用于正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),观察并证实氧化应激下,应用PI3K抑制剂是否能够减轻炎症细胞的糖皮质激素抵抗作用,以便为COPD的防治提供新的思路.
