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SD胚鼠心脏成纤维细胞的原代培养及鉴定
目的：建立适用于胚胎大鼠心脏成纤维细胞体外分离、培养及鉴定的技术方法。方法从SD孕19 d大鼠子宫中分离出胚胎鼠，再从胎鼠中分离出心脏，将心脏剪成肉糜状，用胰蛋白酶加上Ⅱ型、Ⅳ胶原酶联合消化法分离心脏成纤维细胞，再通过差速贴壁分离法分别收集、培养胚胎大鼠心脏成纤维细胞。在光学显微镜下观察心脏成纤维细胞形态特征的变化，用第2代心脏成纤维细胞用波形蛋白（vimentin）、结蛋白（desmin）、血管性血友病因子（vWF）、平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫荧光鉴定。结果差速贴壁法分离的心脏成纤维细胞原代培养120 min已经完全贴壁，培养第3~5代细胞生长良好，24 h心脏成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定纯度高达97%，培养2~3 d时心脏成纤维细胞增殖活力强。结论差速贴壁分离法结合免疫荧光鉴定可分离胚胎大鼠心脏成纤维细胞，此种方法可得到产量大，纯度高，活力好的心脏成纤维细胞，适用于细胞水平上的心血管疾病发病机制的研究。
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银杏内酯对大鼠基底前脑神经元生长发育的影响
目的：观察银杏内酯对培养的胚胎大鼠基底前脑胆碱能神经元和NADPH-d阳性神经元生长发育的作用。方法：取E17Wistar大鼠胚胎基底前脑进行体外细胞培养，并给予银杏内酯。进行乙酰胆碱酯酶(acetyl cholinesterase, AChE)和NADPH-d酶组织化学染色，并在光镜下进行阳性细胞计数和显微测量胞体及突起发育状况。结果：给予银杏内酯处理后，培养物中乙酰胆碱酯酶阳性神经元和NADPH-d阳性神经元数量均较对照组显著增加，且神经元发育状况好于对照组，胞体大，突起多且长。结论：银杏内酯可以促进体外培养的基底前脑神经元中乙酰胆碱酯酶和NADPH-d的表达，并能促进表达这两种酶的神经元生长发育。
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BDNF,NT-3对体外培养的胚鼠脊髓AChE和NADPH-d阳性神经元生长发育的影响
利用AChE和NADPH-d酶组织化学染色法研究了脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)对离体培养的胚胎大鼠脊髓胆碱能神经元和一氧化氮能神经元生长发育的影响.结果显示:BDNF处理组和NT-3处理组AChE阳性神经元数和NADPH-d阳性神经元数均显著高于对照组(P＜0.05).BDNF组AChE阳性神经元和NADPH-d阳性神经元胞体平均直径、每细胞突起数和长突起长度均显著高于对照组(P＜0.05).NT-3组NADPH-d阳性神经元的生长发育与对照组无明显差异,仅AChE阳性神经元的每细胞突起数和长突起长度显著高于对照组(P＜0.05),对胞体发育无影响.结果提示:BDNF,NT-3促进脊髓神经元的存活和生长发育,二者的作用具有选择性和特异性.
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低氧诱导因子-1α基因重组腺病毒体外转染胚鼠神经干细胞研究
低氧诱导因子(HIF)-1α是低氧应答时基因表达和维持内氧环境稳定的调节中心~([1])神经干细胞(NSCs)是进行基治疗的良好载体~([2])我们将Hif-1a基因重组腺病毒体钋转染NSCs后~([3]),过免疫原位杂交和Western blot检测等方法证明成功建立基因工程化NSCs.
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大鼠神经干细胞生长及增殖规律的体外研究
目的:体外无血清条件下培养胚鼠神经干细胞,观察其生长及分化情况.方法:取孕16～18 d SD系大鼠的胚胎海马组织,在含EGF、bFGF和B27的DMEM/F12培养基中培养,电子显微镜下观察其增殖分化过程,并通过免疫荧光方法鉴定分化后的细胞类型.结果:神经干细胞在无血清培养基中生长旺盛,8 d左右就可以形成胞体透亮、折光性好的干细胞球,分化后的细胞显示NSE、GFAP免疫阳性.结论:无血清培养条件下神经干细胞生长良好,而在含血清的培养基中可以分化为神经元和星形胶质细胞.
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胚鼠室管膜神经干细胞体外诱导分化实验研究
目的探寻胚鼠室管膜分离培养及诱导分化为神经干细胞(NSCs)的可行性及规律性,为进一步寻找非神经组织性NSCs种子源提供阳性参照.方法将分离的胚脑室管膜组织以神经干细胞培养液孵育,确定神经干细胞的佳体外生存环境,细胞培养所涉及的细胞因子主要有:EGF、bFGF和LIF(分别为20 ng/ml).以细胞克隆方法判断神经干细胞增殖;以镜下细胞形态初步判断神经干细胞分化.结果胚鼠室管膜源性神经干细胞在相应培养条件下呈现出神经干细胞快速增殖,形成由多细胞组成的细胞球(神经球);进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养,单个的细胞又很快变成岛屿状神经球.神经干细胞连续培养可进一步有小芽形成并发育成突起状结构、建立神经纤维联系,其中有的胞体增大,逐渐发育为较成熟的长突起细胞,长突起相互连接、交织成网.结论由胚鼠室管膜分离培养神经干细胞是可行的;神经干细胞在发育分化过程,基本上遵循着游离神经干细胞、神经细胞球、分化神经元/胶质细胞的生长规律,显现出神经干细胞有别于一般神经细胞的增殖及多分化特性.
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昆明胚鼠生殖腺发育的形态学观察
目的研究及观察发育不同时期胚鼠生殖腺发育的形态变化.方法取发育不同时期的胚鼠进行石蜡切片及H、E染色.结果从胚胎切片标本中可观察到,交配后第11天出现生殖嵴,第12天出现未分化生殖腺,第13天可在胚胎标本切片上区分雌雄性,第14天雄性的生殖腺演变为睾丸,出现生精小管,为实心的小管.第16天出现睾丸间质细胞,支持细胞的细胞核明显可见.第16天雌性的生殖腺演变为卵巢,皮质及髓质两者分化明显.第20天睾丸内可见生精小管横断面数目明显增多,管腔内出现空腔,管内有一层精原细胞和一层精母细胞.卵巢内可见一团团粗大的生卵泡性索沿着卵巢周边分布,内含许多原始的卵原细胞,此时有原始的卵泡出现.结论11～12 d为分离原始生殖干细胞(PGCs)佳时期.
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胚鼠神经干细胞培养与鉴定
目的体外获取高浓度神经干细胞(NSC).方法加入bFGF培养E12天大鼠胚脑的全部细胞,用荧光免疫组化法显示.结果加bFGF的神经干细胞(Neural stem cell,NSC)大量分裂,形成大量的细胞分裂球,传到4代时,90%以上的细胞表达nestin.对照组分裂的细胞少,维持到第二代细胞逐渐死亡.结论bFGF对胚胎E12天大鼠脑细胞的NSC有明显的促分裂作用,应用此种方法可获得高浓度的NSC.
关键词： 神经干细胞 碱性成纤维细胞生长因子 胚鼠 分裂 -
宫内缺血缺氧致胚鼠脑细胞损伤凋亡的实验研究
目的采用胚鼠宫内窘迫的动物模型,观察胚鼠缺血缺氧性脑损伤后不同时间点脑细胞的病理变化及损伤凋亡的情况.方法孕17 d(孕中期)孕鼠,实验组钳夹子宫动脉30 min后,恢复血供.缺血后24 h、48 h及72 h取标本.对照组行同期开关腹术,但不钳夹子宫动脉.与实验组对应的相同时间取标本.用HE,尼氏染色,胆碱酯酶染色,TUNEL及电镜在镜下观察脑组织的病理改变.结果胚鼠缺血缺氧30 min,脑组织可见出血,神经细胞发生水肿、变性;尼氏体形态变化,溶解;胆碱酯酶活性减弱;缺血再灌注后24 h即出现凋亡细胞,并随缺血再灌注时间的延长逐渐增多.结论宫内窘迫所致胚鼠缺血缺氧可造成神经细胞的严重损伤和凋亡.
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碱性成纤维细胞生长因子对胚鼠海列神经前体细胞的增殖和分化作用
为观察碱性成纤维细胞生长因子对体外培养的神经前体细胞的增殖和分化作用，本实验取胚胎18 d大鼠海马神经细胞，加入25 ng／ml碱性成纤维细胞生长因子置无血清培养基中进行培养。于培养第4 d和第8 d，用四唑盐比色法测定细胞活性，并用免疫组化方法定性、定量分析神经前体细胞的分裂和分化为神经元及神经胶质细胞的状态。结果显示，培养第4 d和第8d，实验组的OD值均增高，分别是对照组的1.5倍和1.8倍。免疫组化细胞分类计数显示：培养第4 d，实验组神经前体细胞、神经元和少突胶质细胞数均明显增加，约是对照组的2倍；但星形胶质细胞数无明显的变化。培养第8 d.实验组四类细胞均增加，约是对照组的1.7倍。本实验提示，碱性成纤维细胞生长因子既能促进E18的神经前体细胞的存活和分裂又能促进其向神经元和神经胶质细胞分化。并提示如拟在体外获得较大量和较高纯度的神经前体细胞，E18不是理想的胚龄，需考虑选取胎龄更小的脑组织和加进足量的碱性成纤维细胞生长因子并进行传代培养。
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 神经前体细胞 培养 海马 胚鼠
