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串联质谱法两种扫描方式检测干血滤纸片上氨基酸含量的精密度和准确度
遗传代谢病是指参与体内代谢的某种酶、运载蛋白、膜受体等编码基因发生突变,使其编码的产物功能不良而引发代谢失常的一组疾病[1].许多种类的遗传代谢病已有特效治疗方法,降低病死率及远期神经系统后遗症发生率依赖于早期快速诊断前提下的及早干预治疗[2].国内外的大型实验室主要通过串联质谱技术来辅助临床医师进行遗传代谢病诊断[3-6].
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串联质谱检测干血滤纸片氨基酸方法的建立
目的 建立可靠的串联质谱技术检测干血滤纸片中氨基酸方法 ,以便用于氨基酸代谢紊乱疾病的筛查和诊断.方法 取含不同浓度氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、瓜氨酸和缬氨酸)的血滤纸片,用含已知量相应氨基酸内标的甲醇萃取,盐酸正丁醇衍生后,用串联质谱仪检测血片中氨基酸谱及其浓度.分析该方法 的精确性、样品回收率及浓度相关性.结果 氨基酸批内和批间变异系数分别为6.3%～9.7%、9.9%～14.3%.低浓度回收率为92%～100%,中等浓度回收率为94%～104%,高浓度回收率为98%～107%.不同浓度的氨基酸实测浓度与加入浓度之间的相关系数为0.999 0～0.999 9.结论 串联质谱技术检测干血滤纸片中氨基酸能够达到较高的精确性、准确性和回收率,为临床进行氨基酸分析提供了一项新技术,可用于新生儿遗传代谢病筛查、高危儿童遗传代谢病的诊断及其他与氨基酸代谢有关的疾病诊治.
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高通量检测戈谢病和尼曼匹克病A/B型的超高效液相色谱-串联质谱法的建立
目的 建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术测定干血滤纸片中酸性葡萄糖脑苷脂酶(ABG)和酸性鞘磷脂酶(ASM)活性的方法.方法 将干血滤纸片样本提取液与酶作用底物和内标的混合溶液孵育过夜,反应液经萃取、氮气吹干及复溶后采用UPLC-MS/MS检测产物浓度及内标,计算酶活性.评价该方法的线性、精密度和准确性.结果 UPLC-MS/MS测定ABG和ASM活性的批内、批间精密度为3.6％～8.4％,批内、批间准确度为101％～ 115％.正常新生儿中ABG和ASM活性呈偏态分布(P＜0.01),以第0.5～ 99.5百分位数法确定ABG及ASM活性的参考区间分别为5.52～49.50和2.02～ 15.44 μmol·L-1·h-1.经临床验证,UPLC-MS/MS能有效检出戈谢病(GD)或尼曼匹克病A/B型(NPA/B)患儿,检出率为100％.结论 UPLC-MS/MS能同时测定干血滤纸片中ABG、ASM活性.该法快速、特异,可用于新生儿中GD、NPA/B的高通量筛查及临床检测.
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干血滤纸片类固醇激素质控品制备及评价
目的 探讨用于类固醇激素液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测,室内质控干血滤纸片(DBS)类固醇激素质控品的制备方法.方法 收集全血,分离血细胞和血浆,生理盐水洗涤血细胞,活性炭过夜吸附血浆,添加标准品,制成低、中、高三个浓度的DBS类固醇激素质控品,LC-MS/MS检测并分析其精确度、准确度、稳定性及不同血斑间的差异.结果 DBS类固醇激素质控品批内精确度和准确度分别为2.4 %~7.0 %,102.0 %~111.0 %;批间精确度和准确度分别为5.1%~9.8%,99.0%~114.8%;-20℃保存5个月,月间差异无统计学意义(P>0.05);不同血斑间变异系数为3.3%~8.2%,变异系数较小.结论 配制的DBS类固醇激素质控品具有良好的精确度、准确度及稳定性,血斑间差异小,符合室内质控品要求,可用于LC-MS/MS检测类固醇激素的室内质控.
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干血滤纸片法测定血清肌酸激酶实验研究
目的 建立干血滤纸片肌酸磷酸激酶检测方法,分析干血滤纸片法与静脉血清法所测得结果的相关性,界定微法肌酸磷酸激酶病理性高值的"阈值".方法 收集100份标本,分别应用静脉血清法和干血滤纸片法检测肌酸磷酸激酶活性,运用统计学方法对两种方法检测的结果进行相关性分析.利用受试者工作特征曲线界定干血滤纸片法肌酸磷酸激酶病理性高值的"阈值".结果 将肌酸磷酸激酶>170 IU/L作为分界线,经静脉血清法检测,100份标本中50份为异常高值,50份为正常.经统计学分析,静脉血清法和干血滤纸片法所测定肌酸磷酸激酶结果存在正相关,但两种方法测得的肌酸磷酸激酶值不可直接比较和互换.当病理性肌酸磷酸激酶高值的"阈值"定为150.5 IU/L时,干血滤纸片法敏感度和特异度均为90%;当病理性肌酸磷酸激酶高值的"阈值"定在400 IU/L时,干血滤纸片法检测肌酸磷酸激酶灵敏度为70%,特异度为72%.结论 干血滤纸片法和静脉血清法所测结果存在良好相关性.兼顾实验敏感度和特异度,用于肌酸磷酸激酶筛查时的"阈值"建议定为400 IU/L.
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串联质谱分析干血滤纸片中酰基肉碱质控
目的:串联质谱技术是近几年应用于临床检验的新技术,具有特异性强、灵敏度高,一次试验可检测数十种物质的优点.本文通过对近4年的质控结果进行分析,探讨影响检测结果的因素及应对措施. 方法:美国CDC每年提供4批酰基肉碱质控干血滤纸片,酰基肉碱检测方法为取直径为3 mm的质控干血滤纸片放人96孔聚丙烯板,经含酰基肉碱内标的甲醇萃取,盐酸正丁醇衍生后,进行串联质谱检测.分析本实验室质控结果与美国CDC检测结果的偏差及其他实验室质控结果(169个实验室的均值)与美国CDC检测结果的偏差之间的差异. 结果:本实验室每次质控结果所有酰基肉碱均在美国CDC检测结果95%可信区间内,且每一批结果的临床评价与美国CDC质控临床评价完全一致.本实验室质控结果与美国CDC检测结果的偏差与其他实验室质控结果与美国CDC检测结果的偏差比较,无显著差异,丙酰基肉碱差异显著(Z=-2.638,P<0.005),戊二酰基肉碱差异亦显著(Z=-2.482,P<0.005). 结论:本实验室酰基肉碱质控结果,达到美国CDC的质控要求,丙酰基肉碱检测值偏高,其阳性判断切割值设定也相应增高,而戊二酰基肉碱检测值偏低,其阳性判断切割值设定也相应降低.
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液-质联用串联质谱检测干血滤纸氨基酸水平的影响因素
目的 分析液-质串联质谱检测干血滤纸片氨基酸水平的影响因素,寻找消除这些影响因素的方法.方法 设立3个影响因素组:①不同打孔位置组;②4℃条件下,不同滤纸片保存时间组;③室温条件下,不同放置时间组.比较在上述条件下检测干血滤纸片的氨基酸水平.结果 不同的打孔位置对于19种氨基酸的测定没有明显的影响.不同的纸片保存时间对多数氨基酸的测定没有明显的影响,但是Glu、Gly、Pro、Ser 4种氨基酸的水平随着纸片保存时间的不同而发生了明显的变化;不同的放置时间对多数氨基酸的测定没有明显影响,但是Arg、Gln、Glu、Lys、Tyr 5种氨基酸的水平随着放置时间的不同而发生了明显的变化.结论 在使用串联质谱法检测干血滤纸片上的氨基酸水平时应使用新鲜纸片,及时进行预处理,从而保证结果的稳定性和准确性.
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干血滤纸片试剂盒和水煮法提取间日疟原虫DNA用于PCR检测的比较
目的:比较水煮法和干血滤纸片基因组DNA分离试剂盒提取间日疟原虫DNA用于PCR检测及克隆研究的差异.方法:采集间日疟患者末梢血制备干血滤纸片,分别用水煮法和QIAamp DNA mini kit试剂盒提取间日疟原虫基因组DNA 10份.PCR扩增LDH基因,并克隆质粒pGEM-PvLDH.分析比较2种提取方法的差异.结果:水煮法和试剂盒法提取的间日疟原虫gDNA,均扩增出LDH基因特异条带,但试剂盒提取的gDNA目的条带亮于水煮法.结论:水煮法操作简便、快速、经济,在等量血源条件下,所得DNA量较少、纯度较低;试剂盒提取可获得较高的得率,在定量检测和复合扩增时受到的影响因素较少,成功率较高.
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串联质谱检测干血滤纸片中氨基酸质控分析
目的 通过对近3年的质控结果进行分析,探讨影响检测结果的因素及应对措施.方法 美国疾病控制和预防中心(CDC)每年提供4批氨基酸质控干血滤纸片,利用串联质谱技术检测干血滤纸片中氨基酸水平.以美国CDC检测结果为标准,分析本实验室氨基酸质控结果偏差及其他实验室质控结果(213个实验室的均值)偏差之间的差异.结果 本实验室每次质控结果所有氨基酸均在美国CDC检测结果95%可信区间内,且每一批结果的临床评价与美国CDC质控临床评价完全一致.本实验室质控结果偏差与其他实验室质控结果偏差比较,苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和缬氨酸均无显著性差异,瓜氨酸有显著性差异(Z＝-2.945 P＜0.005).结论 本实验室氨基酸质控结果,达到美国CDC的质控要求,瓜氨酸检测值偏低,其阳性判断切割值设定也相应降低.
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高效液相色谱法检测干血滤纸片中卡马西平的浓度
目的:建立高效液相色谱法检测干血滤纸片中卡马西平血药浓度的方法.方法:将30μL含卡马西平的全血滴在滤纸上,室温下晾干至少3h,待干透后从滤纸上打孔取下6 mm直径的血斑,放入1.5 mL普通离心管中,加入含有内标的甲醇溶液200 μL,超声水浴10min,涡旋1min,15 000 r·min-1离心5 min,取上清进样.色谱柱为AgilentTC-G8柱(250mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇-水(55∶45),内标为苯妥英,流速为1.0mL·min-1,检测波长为235nm.结果:卡马西平血药浓度在1.0～32.0 μg·mL-1范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0.999 0),方法回收率为101.3％～110.5％,提取回收率为59.8％～62.1％.结论:本方法操作简单、准确、可靠,适用于测定干血滤纸片中卡马西平的血药浓度.
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FGFR3基因突变分析鉴别软骨发育不全及类似遗传性侏儒
目的 了解中国人软骨发育不全患者(achondroplasia, ACH)的基因突变情况,建立一种快速简便的从分子水平鉴别ACH及类似遗传性侏儒的方法.方法 对21例ACH患者及6例疑似ACH患者的干血滤纸片进行成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor 3, FGFR3)基因跨膜区特异性扩增,通过限性内切酶分析、单链构象多态和变性梯度凝胶电泳检测基因突变.结果 6例疑似ACH患者中,1例为ACH,5例为假性软骨发育不全.22例ACH患者中,21例发生了FGFR3基因1138位核苷酸G→A的转换,1例发生了1138位G→C的颠换.结论 中国人ACH患者的基因突变与FGFR3基因1138位核苷酸G→A和G→C的突变密切相关.该法是一种快速简便地从分子水平鉴别ACH及类似遗传性侏儒的方法.
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希特林蛋白缺乏症1例报告
患儿，男，1月8天，因“新生儿遗传代谢病筛查血苯丙氨酸浓度增高”于2012年5月6日来院。患儿系G2 P2，39周孕，剖宫产，出生体重3000 g。生后7天在我院两次血苯丙氨酸检测浓度为6．6 mg／dl、6．8 mg／dl ，初步诊断为苯丙酮尿症。生后38天体重4．5 kg，身高53 cm，一般情况可，呼吸平稳，皮肤无黄染，心肺检查无阳性体征，腹部稍胀，无包块，肝脏肋下3．5cm，质软，脾脏未扪及，神经系统检查正常。彩色多普勒超声示右肝肋缘下3．6cm，表面平滑，边缘锐利，实质回声稍增强，肝内未见占位性病变，肝内管道清晰，肝内外胆管不宽。血清总蛋白48．4 g／L， ALB 34．4 g／L， GLB14．1 g／L， AST 36．8 U／L，ALT 19．9 U／L，TBIL 28．3μmol／L，DBIL 20．8μmol／L，IBIL 7．5μmol／L，TBA252．8μmol／L，TG 1．1 mmol／L，TC3．6 mmol／L，HDL-C 1．0 mmol／L， LDL-C 2．1 mmol／L，AFP＞1000．0 IU／ml。血液高压液相色谱-串联质谱检查示，甲硫氨酸、瓜氨酸、精氨酸增高。尿液气相质谱有机酸检测提示，4-羟基苯乳酸及4-羟基苯丙酮酸轻度增高。诊断为希特林蛋白缺乏症。停喂母乳，给予无乳糖奶粉治疗两周。干血滤纸片高压液相色谱-串联质谱检查示，瓜氨酸、精氨酸降低，甲硫氨酸仍然增高。尿液气相质谱有机酸检测4-羟基苯乳酸及4-羟基苯丙酮酸恢复正常。继续坚持无乳糖奶粉治疗，2月后干血滤纸片高压液相色谱-串联质谱检查瓜氨酸、精氨酸、甲硫氨酸恢复正常。彩色多普勒超声示肝脏形态正常，右肝肋缘下2．5 cm，表面平滑，边缘锐利，实质回声均匀，肝内未见占位性病变，肝内管道清晰，肝内外胆管不宽。8个月后复查肝功显示，血清总蛋白、ALB恢复正常，血清AFP降至6．04 IU／ml （参考范围0．00～5．80 IU／ml ）。1年后血清AFP完全降至正常，继续无乳糖奶粉治疗，门诊随访。
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串联质谱法快速检测干血滤纸片酰基肉碱含量
目的 建立一种串联质谱法对干血滤纸片中的酰基肉碱进行快速分析,以用于脂肪酸代谢障碍性疾病和有机酸血症诊断及治疗效果的监测.方法 取8种不同浓度的酰基肉碱的干血滤纸片(直径5 mm),用甲醇(含已知浓度的相应酰基肉碱同位素内标)对其进行萃取,不进行衍生化,萃取物过滤后直接进入ESI+-MS/MS上机分析测定;采用多反应监测模式(MRM),以标准品制作标准曲线,同位素内标法定量建立分析方法,进行回收试验、精密度试验、干扰试验及准确度试验.结果 各标准曲线相关系数r2>0.994.低浓度各种酰基肉碱回收率为85 %～103.5%,准确度在91.8%～110.0%;中浓度各种酰基肉碱回收率为85%～96%,准确度在87.6%～110.1%;高浓度酰基肉碱回收率为94%～100.1%,准确度在95.7%～110.1%.实测值与加入浓度之间的相关系数(r)为:0.997～1.000.各种酰基肉碱批内变异系数(CV)1%～10%和批间变异系数(CV)5%～13%.内标液保存1～21天的检测均值均在CDC提供的参考范围内,而批内CV%均＜10%.263例0～6岁健康儿童血滤纸片中酰基肉碱浓度因受年龄因素影响,按不同年龄组划分各种肉碱参考范围.结论 非衍生化串联质谱法分析干血滤纸片中的酰基肉碱含量,样本前处理简单,能够达到较高的精确度和准确度,无常规串联质谱中的衍生化、氮吹和复溶等步骤,大大节省了的标本处理时间,是一项简便、快捷、准确的检测方法,可以用于脂肪酸代谢障碍性疾病和有机酸血症诊断及治疗效果监测.
