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血清铁蛋白和甲胎蛋白及甲胎蛋白异质体－L3单项与联合检测对原发性肝癌辅助诊断的临床应用价值
目的：评价血清铁蛋白（FER）、甲胎蛋白（AFP）及甲胎蛋白异质体－L3（AFP－L3）3项肿瘤标志物单一及联合检测对原发性肝癌（ PHC）的诊断价值。方法采用病例对照研究，选取2014年1至12月首都医科大学附属北京佑安医院就诊的PHC患者212例（其中Ⅰ期45例，Ⅱ期78例，Ⅲ期81例，Ⅳ期8例），肝硬化患者127例，慢性肝炎患者101例及健康体检者98名作为研究对象，检测血清中FER、AFP、AFP－L3的水平。其中FER和AFP测定采用电化学发光法，AFP－L3测定先采用亲和吸附分离，然后再采用电化学发光法检测。各组间FER、AFP及AFP－L3水平采用非参数秩和检验进行差异分析，并对3者水平进行组间的独立和联合诊断性能分析，结合Logistic回归分析，绘制ROC曲线并计算及比较曲线下面积（ AUC）评价各指标单项及联合检测的诊断价值。结果 PHC组、肝硬化组、慢性肝炎组及健康对照组血清FER浓度分别为：308．45（148．98～662．80）、151．70（51．44～507．40）、298．20（157．30～701．80）、113．50（54．98～221．38）μg／L；AFP浓度分别为48．50（5．25～748．40）、3．91（1．80～17．53）、4．76（2．29～30．56）、2．57（0．93～3．68）μg／L；AFP－L3浓度分别为4．75（0．61～127．95）、0．61（0．61～2．50）、0．61（0．61～2．85）、0．61（0．61～0．61）μg／L，各组间3项指标的差异均有统计学意义（χ2＝67．66、146．31、119．02，P＜0．001）。随着病理分期（Ⅰ～Ⅳ）的加重，FER、AFP及AFP－L3的血清水平均显著增高，差异有统计学意义（χ2＝21．63、22．68、21．98，P＜0．001）。单项检测诊断PHC时，FER的敏感度高（75．00％），AFP－L3的特异度高（82．52％）；双项目检测方案中，FER／AFP的敏感度高（89．15％），FER＋AFP－L3和AFP＋AFP－L3特异度较高（均86．20％）；3项目检测时， FER／AFP／AFP－L3敏感度高达89．15％， FER＋AFP＋AFP－L3特异度高达86．50％。3者联合检测的ROC曲线AUC为0．803±0．019（95％ CI：0．765～0．841），显著高于FER （0．748±0．022，95％ CI：0．705～0．790，Z＝4．67，P＜0．001）及 AFP－L3（0．726±0．024，95％ CI：0．679～0．772，Z＝3．64，P＜0．001）单独检测，但与AFP单独检测相比差异无统计学意义（0．776±0．021，95％CI：0．735～0．818，Z＝1．34，P＝0．18）。结论 FER检测在PHC辅助诊断中具有重要价值，FER、AFP及AFP－L3三项联合检测可提高PHC患者的诊断率。（中华检验医学杂志，2016，39：604－608）
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毛细管电泳免疫-激光诱导荧光术测定甲氨蝶呤对映体耐药A549细胞株中叶酰聚谷氨酸合成酶
目的 为观察甲氨蝶呤(MTX)对映体诱导肺癌A549细胞株耐药后叶酰聚谷氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase,FPGS)含量变化,建立一种用毛细管电泳免疫-激光诱导荧光术(CEIA-LIF)测定FPGS的方法,以便为深入探讨肿瘤耐药机制提供新的实验手段.方法 实验分别选用耐药浓度为25 μmol/L的L-(+)-MTX和D-(-)-MTX肺癌A549耐药细胞株,以MTX敏感的细胞株作对照,培养获取上述3株细胞,并粗提取FIGS做CEIA-LIF和免疫印迹(WB)实验;用异硫氰酸荧光素(FITC)标记FPGS抗体,与提取的FPGS进行免疫反应;然后采用CEIA-LIF,根据不同分子量蛋白具有不同的迁移时间,分离检测标记蛋白,检测L广(+)-MTX和D-(-)-MTX作用耐药前后3株肺癌A549细胞株中FPGS表达含量;同时用WB作对照,以评价CEIA-LIF的特异性和FPGs定量的准确性.结果 CEIA-LIF分离标记FPGS抗体与免疫复合物的分离时间分别为7.1、8.9 min,分离度(R)=4.5,在10 min内即完成蛋白的分离和检测.经WB鉴定3株细胞液氮冻融裂解后离心提取液中组分与FPGS抗体无非特异性条带出现.CEIA-LIF测定敏感细胞株的检测下限为0.68 mg/μl细胞;而其检测25 μmol/L L(+)-MTX和25 μmol/L D-(-)-MTX诱导耐药细胞中FPGS的表达含量分别为对照组敏感细胞的46.59%和48.36%.结论 本研究建立的CEIA-LIF检测FPGS法具有高效快速的特点,且具与WB类似的特异性;同时提高了检测的敏感度.L-(+)-MTX和D-(-)-MTX诱导耐药后细胞株中FPGS表达含量较敏感细胞株明显减少,证明MTX耐药细胞株FPGS表达含量受损.
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亲和毛细管电泳法测定甲氨蝶呤对映体与二氢叶酸还原酶反应动力学参数
目的 建立一种测定氨甲蝶呤(MTX)两种对映体与二氢叶酸还原酶(DHFR)结合反应动力学参数的方法.方法 建立DHFR反应体系,采取亲和毛细管电泳技术,以含0.2%Brij-35的pH 9.50的50mmol/L硼砂为电泳缓冲液,检测波长为254 nm,在25 kV的电压下,分离反应体系中各组分.观察酶反应前后的电泳图谱并根据反应生成物峰面积的变化计算相关反应动力学参数,将不同浓度的氨甲蝶呤两种对映体L-(+)-MTX和D-(-)-MTX分别作用于所建立的DHFR反应体系,测定两种对映体的半数抑制浓度(IC50).结果 建立了亲和毛细管电泳法对氨甲蝶呤对映体与DHFR反应动力学参数的测定方法,在30 min内实现DHFR反应体系中反应物和生成物的分离,并根据反应生成物峰面积的变化计算得出D-(-)-MTX的IC50为3.17×10-7mol/L,L-(+)-MTX的IC50为2.48×10-8mol/L,两者相差13倍左右.结论 亲和毛细管电泳的方法可以快速准确地用于DHFR反应动力学参数的研究,通过检测MTX对映体对DHFR的抑制能力的差异,首次发现MTX对映体对DHFR有立体选择性作用.
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实时荧光定量PCR法检测MTX对映体耐药A549细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA的表达
目的 建立实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞中FPGS mRNA表达的方法,研究MTX对映体[L-(+)-MTX和D-(-)-MTX]耐药细胞株中FPGS的基因表达差异,并用于观察白血病患者MTX治疗耐药前后FPGS mRNA表达水平的变化.方法 用SYBR Green Ⅰ为荧光染料,以β-actin作参照,建立检测FPGS mRNA的实时荧光定量PCR方法.根据Ct值、标准曲线相关系数、斜率、重复性曲线、熔解曲线、扩增效率曲线等进行方法学评价.并用该方法检测MTX对映体耐药细胞株及应用MTX耐药的14例白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA的表达.结果 建立的标准曲线Ct值与模板浓度有良好的线性关系,FPGS和β-actin标准曲线相关系数分别为0.996 8和0.998 7,斜率分别为-3.595和-3.740,批内CV为1.27%～2.95%,批间CV为3.82%;熔解曲线均呈单个特异峰,扩增效率相似(斜率为0.021 7);L-(+)-MTX耐药细胞和D-(-)-MTX耐药细胞中FPGS mRNA相对含量分别为(3.51±0.66)和(0.16±0.01),A549亲本细胞(S)中FPGS mRNA相对含量为(1.00±0.31),差异有统计学意义(F=64.45,P＜0.01);L-(+)-MTX耐药细胞和D-(-)-MTX耐药细胞间FPGS mRNA相对含量差异有统计学意义(q=9.29,P＜0.01).白血病患者应用MTX治疗耐药后,FPGS mRNA表达水平为(0.35±0.04),用药前为(1.00±0.44),差异有统计学意义(t=8.83,P＜0.01).结论 建立的实时荧光定量PCR检测FPGS mRNA的方法重复性好、特异度高,可用于FPGSmRNA含量分析.MTX诱导耐药后细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA表达发生了变化,MTX 2种对映体形式在细胞耐药机制中可能发挥了不同的作用.
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原发性肝细胞癌中DNMT3b基因剪接变异体的表达分析
目的:研究原发性肝癌中DNMT3b基因剪接变异体的表达情况及其在肝癌发生发展中的作用.方法:通过RT-PCR的方法对30例肝癌、30例癌旁组织中DNMT3b基因的剪接变异体进行检测,并将结果与肝癌患者临床指标进行统计学分析.结果:RT-PCR结果显示DNMT3b基因以四种剪接变异体(DNMT3b1、 DNMT3b3、 DNMT3b4和DNMT3b5)的形式表达,其总的表达率肝癌组为93.3%(28/30),癌旁组为93.3%(28/30).其中DNMT3b4在肝癌组中的表达高于癌旁组(P<0.05),与肝癌病理分化和CLIP评分无相关性(P>0.05).结论:DNMT3b基因剪接变异体DNMT3b4可能参与肝癌的发生演变.
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盐酸氮芥及其异构体抗肿瘤研究
目的:研究盐酸氮芥、氮芥异构体对K562及L1210细胞增殖的影响.方法:采用克隆形成法、MTT比色法及活细胞计数法.结果:盐酸氮芥及其异构体能抑制K562及L1210细胞增殖,与对照组相比有显著性差异(P＜0.01),抑制作用与剂量呈显著性正相关.结论:盐酸氮芥及其异构体对K562和L1210细胞有明显抑制作用,且异构体作用明显优于盐酸氮芥.
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蔗糖比旋光度的测定实验新设计
有机化学是医学院校各专业学生的必修课,立体异构体,尤其对映异构体是医用化学的重要一章,所以测量旋光度的实验一直是重要的有机实验.摸索适宜的实验温度,用稀盐酸催化水解蔗糖,测量其旋光度,旋光度的变化范围大,变化的速度适中,能够使学生更好地掌握旋光度的测定方法,认识转化糖的水解和有机物的立体异构现象,改进后实验课更充实,内容更合理.
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干扰素调节因子剪切的剪接异构体IRF-3c的结构及功能
目的干扰素调节因子(IRF)3是病毒感染后调节干扰素基因转录重要的转录因子,寻找IRF-3新的剪接异构体,研究其结构及功能.方法抽提人类细胞RNA,用IRF-3已发表序列设计引物,作cDNA末端快速放大(RACE)及逆转录聚合酶链反应,生物信息学方法比较新序列,亚克隆IRF-3c至pcDNA3.1-flag,转染人胚胎肾上皮293细胞,用抗flag抗体作Western blot分析,用萤虫素酶功能分析的方法观测IRF-3c对病毒诱导的干扰素β启动子萤虫素酶活性的影响.结果发现了一种新的IRF3剪接异构体IRF-3c,IRF-3c用了紧接第六外显子后的180个第六内含子的碱基,新引入的初第2、3、4个新碱基为一终止密码子,导致IRF-3c蛋白多肽终止于第327位.Western blot出现预期的相对分子质量为44 000的IRF-3c的蛋白强阳性条带.新的引用外显子序列可在小鼠的ETS表达库中找到同源序列,提示这种新的剪接体在生物演进中有其保守功能,IRF-3c萤虫素酶功能分析显示,该剪接体能抑制病毒诱导的干扰素β启动子活性至对照组的40%～50%.结论新的剪接体的发现为IRF-3这一重要分子的功能调节提供了新的线索,它是病毒感染通路中干扰素的显负性抑制剂,提示其功能为干扰素产生的精细调节成分,可防止干扰素的过度产生,其特异性序列可用于分析它们在人类疾病中的病理意义.
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苯巴比妥诱导对普罗帕酮体外Ⅰ相代谢的立体选择性影响
目的:观察苯巴比妥对S(+)-和R(-)-普罗帕酮(PPF)体外Ⅰ相代谢有无立体选择性的影响.方法:将消旋普罗帕酮与对照或苯巴比妥诱导的大鼠肝微粒体孵育后,采用手性衍生化反相高效液相色谱法,测定对映体的经时孵育曲线和酶动力学参数(大反应速度、米氏常数、内在清除率).结果:在对照大鼠肝微粒体中,PPF的Ⅰ相代谢无立体选择性.经苯巴比妥诱导处理后,在5 mg/L底物浓度时R(-)-PPF的代谢快于S(+)-PPF,两对映体的米氏常数和内在清除率有显著性差异.结论:苯巴比妥选择性地诱导了大鼠肝微粒体对PPF的Ⅰ相代谢.
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盐酸伐昔洛韦的手性分离及其对映体杂质的含量测定
目的：了解国产盐酸伐昔洛韦中L-对映体杂质的含量，为我国药典制订手性药物杂质限量提供参考数据。方法：应用手性高效液相色谱法。色谱条件：CROWNPAK? CR（＋）手性柱（4 mm ×150 mm，5μm）；检测器波长254 nm；流动相为水-甲醇-高氯酸（19∶1∶0．1）；流速0．75 ml/min，进样量10μl。结果：D-伐昔洛韦与L-伐昔洛韦完全分离，分离度为12。不同厂家的8批盐酸伐昔洛韦中L-对映体杂质的平均含量为0．65％～2．62％。结论：各批产品中L-对映体杂质含量均符合美国药典标准，我国药典可以参照此数据。
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毛细管电泳法检查瑞格列奈片中左旋异构体杂质
目的：建立毛细管电泳法检测瑞格列奈片中左旋异构体杂质。方法：采用未涂层熔融石英毛细管柱（50μm ×50 cm，有效长度41 cm）为分离通道，运行缓冲液为pH 3．5，30 mmol/L的磷酸二氢钠缓冲溶液，含5 mg/ml CM-β-CD。结果：左旋瑞格列奈在浓度为2．00～80．00μg/ml 范围内线性关系良好（ r ＝0．9993），方法回收率为92．5％～105．0％。结论：本实验建立的方法简单、准确、灵敏，可用于瑞格列奈片中左旋异构体杂质的检测。
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非索非那定对映体柱前手性衍生化反相高效液相色谱分析方法的建立
目的：建立适用于体外细胞模型的OATP1 B1手性底物非索非那定柱前手性衍生化分析方法，为测定细胞中非索非那定对映体提供分析手段。方法：选择R-（＋）-苯乙基异氰酸酯作为手性衍生化试剂，与非索非那定生成氨基甲酸酯衍生物，应用液相色谱-串联质谱法确定对映体衍生物色谱峰，通过反相高效液相色谱法实现对映体的分离分析。结果：在建立的手性分离条件下，成功实现非索非那定对映体分离分析，非索非那定两个对映体衍生物在25～100 ng/ml浓度范围内线性关系良好（R2＝0．9992，0．9989），日内、日间精密度均小于10％。结论：本实验建立的非索非那定对映体柱前手性衍生化反相高效液相色谱分析方法灵敏、准确，可用于体外细胞模型中盐酸非索非那定立体选择性分析。
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马来酸噻吗洛尔原料和滴眼剂中对映体杂质的含量测定
目的：了解国内生产的马来酸噻吗洛尔及其滴眼液中对映体杂质含量，为我国药典制订手性药物杂质限量提供参考数据。方法：应用手性高效液相色谱法，色谱条件为：Chiralcel OD 手性柱（4．6 mm ×150 mm，5μm）；检测器波长297 nm；流动相为正己烷-异丙醇-二乙胺（480∶20∶1）；柱温25℃；流速1．0 ml/min，进样量5μl。结果：两个对映体的色谱分离度为4．3。不同厂家的两批马来酸噻吗洛尔原料药中的对映体杂质平均含量小于0．67％，3批马来酸噻吗洛尔滴眼液中的对映体杂质平均含量小于0．31％。结论：各批马来酸噻吗洛尔产品中对映体杂质含量均符合欧洲药典标准，我国药典可以参照此数据。
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毛细管电泳法检查盐酸左西替利嗪片中右旋异构体杂质
目的：建立毛细管电泳法检查盐酸左西替利嗪片中右旋异构体杂质。方法：用磺酸化-β-环糊精（ S-β-CD）作为手性选择剂，考察了S-β-CD浓度、pH值和缓冲盐浓度对分离的影响。结果：在30 mmol/L磷酸盐运行缓冲液（含20 g/L S-β-CD，pH 7．0）中，西替利嗪对映体在分离电压为15 kV的条件下得到良好分离，并满足对盐酸左西替利嗪片检查右旋异构体杂质所需要的条件。结论：本实验建立的方法灵敏、可靠，可用于左旋西替利嗪中右旋异构体杂质的检查。
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RR-福莫特罗和rac-福莫特罗对人支气管舒张作用的比较
目的:比较RR-福莫特罗和rac-福莫特罗对人支气管舒张作用.方法:将内径2～4 mm、长15 mm的人支气管螺旋条置入持续供氧的浴槽内,静息张力为1 g,以蓄积给药法测定RR-福莫特罗(10 pmol*L-1～3.2 μmol*L-1)和rac-福莫特罗(10 pmol*L-1～3.2 μmol*L-1)在静息情况下,及氨甲酰胆碱(10 μmol*L-1)或组胺(100 μmol*L-1)引起收缩情况下的张力改变.结果:RR-福莫特罗在静息状况下支气管舒张作用强于rac-福莫特罗(P<0.05).RR-福莫特罗和rac-福莫特罗对抗由氨甲酰胆碱和组胺引起的收缩,且RR-福莫特罗的对抗作用强于rac-福莫特罗(P<0.05).结论:RR-福莫特罗对人支气管的舒张作用强于rac-福莫特罗.
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手性固定相法和手性衍生化法拆分β-受体阻断剂类药物及其结构类似物
目的:建立一些β-受体阻断剂类药物及其结构类似物的手性高效液相色谱拆分方法.方法:利用Chiralcel OD和Chiralpak AD两种手性固定相及GITC手性衍生化试剂,对11种药物进行手性拆分研究.结果:普萘洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、美托洛尔、塞利洛尔、卡维地洛、索他洛尔、普罗帕酮、麻黄碱和佐米曲普坦都在一种或几种色谱条件下得到了较好的分离.柱温对Chiralcel OD的拆分因子影响较大,相同条件下柱温越低,药物拆分因子越大.结论:用OD和AD 两种手性固定相和GITC手性衍生化法拆分β-受体阻断剂等β-胺基醇类药物具有互补性.
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A549/MTX对映体耐药细胞的裸鼠荷瘤模型的建立
目的 利用L型和D型氨甲喋呤(MTX)对映体分别建立人肺腺癌A549细胞株裸鼠耐药模型,为进一步揭示MTX对映体体内活性差异的原因提供实验平台.方法 裸鼠皮下分别接种A549、耐药细胞株A549/L-MTX、A549/D-MTX各6×106个/0.2 ml,观察肿瘤生长特性;瘤体原代培养后四甲基偶氮唑兰(MTT)法检测耐药指数( resistance index RI);免疫组化(IHC)检测ki-67、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein1,MRP1)、survivin变化.结果 从肿瘤生长曲线上看瘤体积三者差异有统计学意义(P<0.05),A549/L-MTX/nude组体积更小.A549/L-MTX/nude移植瘤RI为4.9,为低度耐药,A549/D-MTX/nude移植瘤RI为14.5,为中度耐药.A549/L-MTX/nude相关蛋白总体表达低于A549/D-MTX/nude,两者表达差异有统计学意义(P均<0.05).结论 成功建立对MTX两种对映体耐药的A549细胞株裸鼠肿瘤模型,且两种耐药细胞具有不同耐药特性,为研究MTX对映体体内抗肿瘤活性差异提供了较好的实验平台.
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使用手性冠醚的高效毛细管电泳法研究伯胺类药物的手性分离
目的采用HPCE法拆分伯胺类药物对映异构体.方法缓冲液20 mmol/LTris-0.1%H3PO4(v/v)(pH 2.06)+18-冠-6-四甲酸(18C6H4);检测波长210 nm.结果 8种伯胺类药物得以拆分.结论缓冲液中添加手性冠醚的HPCE法能较好地拆分伯胺类药物.
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p53异构体△133p53在不同胃组织中的表达及意义
目的 探讨p53选择性剪接异构体△133p53的mRNA在胃癌、慢性萎缩性胃炎和慢性浅表性胃炎组织中的表达及意义.方法 采用巢式逆转录多聚酶链反应检测△133p53在30例胃癌、30例慢性萎缩性胃炎和20例慢性浅表性胃炎组织中的表达.结果 △133p53在胃癌、慢性萎缩性胃炎和慢性浅表性胃炎组织中的阳性表达率分别为70.0％、50.0％和25.0％,差异有统计学意义(P均＜0.05).结论 ①A133p53的表达在胃癌、慢性萎缩性胃炎和慢性浅表性胃炎组织中呈逐渐明显下降趋势.②△133p53异构体可能对胃癌的发生发展及其诊断、治疗具有重要作用.
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p53异构体和MDM2、PTEN在胃癌组织中表达的相关性
目的 探讨p53的选择性剪接异构体与双微基因2(MDM2)、同源性磷酸酶张力蛋白(PTEN)在胃癌组织中的表达及其相关性.方法 分别应用巢式逆转录多聚酶链反应(NT-PCR)和免疫组织化学(PV-9000两步法)方法检测p53的五种选择性剪接异构体和MDM2、PTEN在胃癌组织和癌旁胃组织中的表达,并进行统计学分析.结果 在30例胃癌患者癌组织和癌旁胃组织中均未检测到三种p53异构体p53γ、△133p53β、△133p53γ的mRNA表达.与癌旁组织比较,胃癌组织中△133p53表达阳性率高,p53β表达阳性率低,MDM2蛋白表达阳性率高,PTEN 蛋白表达阳性率低(P均＜0.01).Spearman's相关性分析显示,△133p53和MDM2,p53β和PTEN在胃癌中表达均呈正相关关系(r =0.408,P=0.025;r =0.413,P =0.02)；△133p53和PTEN,p53β和MDM2在胃癌中表达呈负相关关系(r=-0.467,P=0.009;r=-0.480,P =0.007).结论 △133p53、p53β通过调节p53活性,并以P53为中介,影响了PTEN-MDM2-p53网络环路中PTEN、MDM2蛋白的表达.
关键词： 胃肿瘤 蛋白质p53 立体异构现象 双微基因2 同源性磷酸酶张力蛋白
