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外源性硫化氢通过Keap1-Nrf2信号通路减轻胃缺血再灌注引起的黏膜损伤
目的 观察外源性硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)供体NaHS预处理对大鼠胃缺血再灌注(gastric ische-mia-reperfusion,GI-R)损伤的影响及其可能的作用机制.方法 雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠,实验分3组:假手术(Sham)组、GI-R组和NaHS组.采用夹闭腹腔动脉30 min再灌注1h方法建立GI-R损伤模型.GI-R后处死各组大鼠,采用Adobe Photoshop软件分析计算GI-R引起的胃黏膜损伤面积,苏木精-伊红染色后光镜下观察GI-R引起的胃黏膜损伤深度,化学比色法检测大鼠胃黏膜中过氧化氢(H2O2)和谷胱甘肽(GSH)含量,免疫印迹法测定大鼠胃黏膜组织中Keap1、Nrf2、超氧化物歧化酶(SOD2)和黄嘌呤氧化酶(XOD)的表达,免疫组化法检测大鼠胃黏膜Keap1和Nrf2表达.结果 GI-R组胃黏膜损伤明显、损伤深度较深,NaHS组胃黏膜损伤面积和深度较GI-R组明显缩小和减少.与GI-R组相比,NaHS预处理后能增加胃黏膜组织中GSH、Nrf2、SOD2水平(P＜0.05),降低H2O2、Keap1、XOD水平(P＜0.05).结论 外源性H2S预处理可以通过Keap1-Nrf2信号通路减轻大鼠胃缺血再灌注引起的黏膜损伤.
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类查尔酮Nrf2激活剂的合成及ARE诱导活性
对先导化合物CPUY191001结构进行改造,以期得到活性更好的ARE-Nrf2激活剂.通过羟醛缩合反应合成17个目标化合物,采用MTT法测试目标化合物的抗增殖活性,并利用荧光素酶报告基因实验考察目标化合物对ARE的诱导活性.MTT数据显示,该系列化合物几乎无细胞毒性(IC50＞ 50 μmoL/L),活性测试结果表明,大部分类查尔酮衍生物对ARE具有一定的诱导活性,其中化合物2,3,10活性较优,且具有浓度依赖性.化合物2,3,10在抗炎与肿瘤预防治疗药物的研究领域中具有一定的应用前景,值得进一步研究.
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Keap1在乳腺癌组织中的表达及临床意义
[目的]探讨Keap1在乳腺癌组织中的表达.[方法]选取2013年1月至2015年12月在武汉市武昌医院肿瘤科收治的原发乳腺肿瘤患者,其中病理诊断为乳腺癌80例(乳腺癌组)和乳腺良性肿瘤300例(乳腺良性肿瘤组),两组都进行Keap1的免疫组化分析与临床资料的调查分析.[结果]乳腺癌组的Keap1阳性表达率为70.0％,乳腺良性肿瘤组为7.8％,乳腺癌组的Keap1阳性表达率明显高于乳腺良性肿瘤组(P＜0.05).在80例乳腺癌患者中,Keap1的阳性表达与患者的病理类型、临床分期、淋巴结转移情况等有相关性(P＜0.05).多元回归Logistic分析结果显示,临床分期、淋巴结转移与病理类型是影响乳腺癌患者Keap1阳性表达的主要独立危险因素(P＜0.05).[结论] Keap1在乳腺癌组织中呈现高表达,且与患者的临床分期、淋巴结转移与病理类型明显相关,参与乳腺癌的发生与发展.
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Nrf2基因的过表达对酒精诱导的HepG2细胞损伤的保护作用及机制
目的:探讨于人类肝癌细胞系HepG2中过表达Nrf2基因后对由酒精处理引起的细胞氧化压力和炎症反应的影响和机制.方法:经过Keap1 siRNA预处理的HepG2细胞经含75 mmol/L酒精的培养基孵育72 h后,应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测细胞活性以及应用Western blot和荧光定量实时聚合酶链反应(PCR)方法检测细胞内氧化压力和促炎症蛋白的表达水平.同时,转录因子核因子κB(NF-κB)的活性以及其抑制蛋白IκBα的表达也通过Westernblot检测.结果:经含75 mmol/L酒精的培养基孵育72 h后,HepG2细胞的细胞活性显著下降,同时伴随着细胞内抗氧化酶表达水平的显著下降和促炎症蛋白表达的显著上升.Nrf2基因的过表达显著增加了HepG2细胞活性,恢复了细胞内抗氧化酶的表达水平,并改善了细胞内的炎症反应(P＜0.05).Nrf2的过表达亦通过恢复IκBα的水平降低了由酒精处理诱导的转录因子NF-κB的活性(P＜0.05).结论:Nrf2基因的过表达可以有效改善酒精造成的HepG2细胞内氧化压力和炎症反应,该效应部分通过抑制NF-κB的活性来完成.
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慢病毒介导shRNA干扰前列腺癌PC3细胞Keap1基因表达的研究
目的:针对Keap1构建shRNA慢病毒干扰载体,并评价慢病毒介导的RNA干扰在人前列腺癌细胞PC3中的基因沉默效应.方法:利用生物信息学方法设计针对Keap1的RNAi寡聚核苷酸序列;采用慢病毒载体构建Keap1的shRNA载体,利用大肠杆菌进行重组表达,利用293T细胞包装得到重组腺病毒;依据绿色荧光蛋白(GFP)示踪,逐孔稀释法确定转染效率及滴度;以实时荧光定量法比较各靶序列的基因干扰效果.结果:筛选了所构建的4个Keap1靶向序列,以慢病毒载体构建完成对应Keap1的shRNA质粒.通过瞬时转染筛选得到效率佳(干扰效率达到80％)的靶序列和工作条件.结论:本研究成功构建并筛选了针对Keap1的shRNA慢病毒载体,有效抑制PC3细胞中Keap1的表达.
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转录因子Nrf2的神经保护作用及其机制
NF-E2相关因子2(Nrf2),感受体内反应活性氧(Reactive oxygen species,ROS)变化后,与体内的锚定蛋白Keap1解聚,发生核转位并调控下游多种抗氧化应激蛋白,解毒酶及转运体基因的表达,参与抗氧化应激生理及病理过程.目前,许多研究发现,Nrf2转录调控的下游靶基因可以对抗由脑中风氧化应激引起的神经系统病变,阿尔茨海默病(Alzheimer's disease),帕金森病(Parkinson's disease),侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS).本文对近年来Nrf2在神经保护方面的作用及其机制,以及Nrf2作为药物治疗靶点治疗神经退行性病变的新研究成果进行总结.
关键词： 抗氧化应激 Nrf2 神经保护 Keap1 抗氧化反应元件ARE -
Keap1-Nrf2信号通路在肝再生中的作用及相关药物研究进展
肝脏在化学损伤或手术切除组织后可以再生,肝再生是一个复杂的过程,涉及多种细胞因子和多个信号通路.核因子E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)是氧化还原反应敏感转录因子,在细胞抗氧化防御、氧化还原平衡、炎症、中间代谢等过程中起到调控作用,并与细胞增殖密切相关.一些报告已证实在Nrf2缺失的情况下,肝脏切除术后肝再生出现了延迟现象,由此可见Nrf2信号通路参与了肝再生的过程.该文根据已有的研究结果,综述Nrf2信号通路在肝再生过程中的作用,并对影响肝再生或肝细胞增殖的药物进行总结,以期发现更多的治疗肝脏疾病的药物,并为药物作用机制的研究提供思路.
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急性脑梗死外周血中Nrf2的表达及其与氧化应激的关系研究
目的：探讨急性脑梗死周围血中Nrf2（NF‐E2‐related factor2）的表达与氧化应激的关系，阐明N rf2介导的氧化应激炎症反应与急性脑梗死中动脉粥样硬化性血管病变的关系。方法采用流式细胞学、RT‐PCR、ELISA法，从细胞学、mRNA 和炎症因子三方面动态观察氧化应激核心分子N rf2与急性脑梗死进展之间的关系，同时结合颈动脉彩超测量颈动脉粥样硬化斑块形成情况。结果急性脑梗死周围血中N rf2及下游抗氧化物酶的表达较对照组有明显差异（ P ＜0．05）。结论 Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键因子，受 Keap1的调控，通过与抗氧化反应元件 ARE （antioxidant response element）相互作用，调节抗氧化蛋白和II相解毒酶的表达。Nrf2及下游抗氧化物酶的表达呈正相关，对急性脑梗死患者受损的神经组织细胞保护具有重要作用。
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胃癌组织中Keap1、 IKKβ蛋白表达及意义
目的 探讨Keich样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)和IκB激酶β(inhibitor kappa B kinase β,IKKβ)在胃癌组织中的表达.方法 应用免疫组化法检测54例胃癌患者的胃癌组织及24例癌旁正常组织中Keap1和IKKβ蛋白的表达,分析Keap1和IKKβ蛋白的表达与胃癌临床病理特征关系及二者表达的相关性.结果 Keap1与IKKJβ在胃癌组织中的表达高于癌旁正常组织,差异具有统计学意义(P＜0.05);胃癌组织中Keap1蛋白的表达与淋巴结的转移具有明显相关性(P＜0.05),但与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型、组织分化程度无相关性(P＞0.05);胃癌组中IKKβ蛋白的表达与组织分化程度及淋巴结转移相关(P＜0.05),与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型均无相关性(P＞0.05);Keap1的表达与IKKβ的表达无相关性(r=0.2839,P＞0.05).结论 胃癌组织中Keap1、IKKβ蛋白表达异常,提示Keap1可能影响IKKβ介导的NF-κB信号通路,并在胃癌的发生、发展中发挥重要作用.
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Nrf2/Keap1抗氧化系统与白内障
Nrf2/Keap1系统被认为是机体抗氧化机制中重要的通路,该通路的激活及其与其他通路相互作用是阻止白内障发生发展的重要机制.研究表明,Nrf2/Keap1抗氧化系统结构功能异常、去甲基化的启动与加速及Tet1的异常激活与白内障的发生发展密切相关.本文就Nrf2/Keap1系统与白内障发生发展的关系及其相关机制进行综述.
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Nrf2和Keap1的表达与鼻咽癌患者预后的关系研究
目的:探讨Nrf2和Keap1在鼻咽癌组织中的表达情况,分析Nrf2和Keap1表达水平与鼻咽癌患者临床病理特征以及预后的关系.方法:选取经组织病理学证实为鼻咽部非角化性鳞状细胞癌的108例患者,并选取与之匹配的活检标本组织芯片作为免疫组织化学检测的研究对象,分析Nrf2和Keap1蛋白的表达与鼻咽癌患者放疗预后的关系.结果:108例鼻咽癌患者的5年无病生存率(DFS)和总生存率(OS)分别为57.4％和70.2％.细胞核Nrf2低表达组、高表达组的5年DFS分别为59.4％、53.8％,差异无统计学意义(P=0.595);细胞质Keap1低表达组、高表达组的5年DFS分别为42.2％、68.2％,差异有统计学意义(P=0.016).细胞核Nrf2低表达组、高表达组的5年OS分别为70.8％、69.2％,差异无统计学意义(P=0.496);细胞质Keap1低表达组、高表达组的5年OS分别为55.6％、80.9％,差异有统计学意义(P＜0.001).结论:Nrf2和Keap1在鼻咽癌中表达与患者的临床分期、分化程度以及颈部淋巴结转移等临床病理特征无关.细胞质Keap1高表达者有较高的DFS以及OS;Keap1是鼻咽癌患者DFS和OS的独立预后因素.
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Nrf2和Keap1在喉癌组织中的表达及意义
目的:探讨Keap1-Nrf2-ARE信号通路在喉鳞状细胞癌发生、发展中的作用.方法:35例喉癌组织及癌旁组织取自2012-02-2013-09期间河北医科大学第二医院住院手术的喉癌患者,采用免疫组织化学方法检测喉鳞状细胞癌组织及癌旁正常组织中Nrf2和Keap1的表达情况.所有实验数据用SPSS 13.0统计软件分析.结果:Nrf2和Keap1在癌组织中的阳性表达率分别为77.14％和71.43％,在癌旁组织中的阳性表达率为8.57％和31.43％,2者相比差异有统计学意义(P＜0.01).Nrf2和Keap1在Ⅰ～Ⅱ期喉癌组织中的阳性表达率为65.00％和55.00％,在Ⅲ～Ⅳ期喉癌组织中均为93.33％,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).Nrf2和Keap1在有淋巴结转移的喉癌组织中阳性表达率均为100.00％,与无淋巴结转移的喉癌组织中阳性表达率68.00％和60.00％相比,均差异有统计学意义(P＜0.05).Nrf2和Keap1的阳性表达与喉癌的病理分化程度、患者吸烟量以及年龄未见相关性(P＞0.05).结论:Keap1-Nrf2-ARE信号通路所介导的氧化应激反应与喉癌的发展关系密切.
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植物雌激素在雌性生殖系统中的抗氧化作用
目的 探讨植物雌激素白藜芦醇、染料木黄酮和大豆黄酮在人类宫颈癌细胞HeLa、乳腺癌细胞MCF7和卵巢癌细胞SK-OV-3中对抗氧化信号通路的影响.方法 将抗氧化响应元件ARE报告基因转染入HeLa、MCF7和SK-OV-3细胞.稳定表达ARE荧光报告基因后,细胞培养基中分别加入50、25、12.5、6.25、3.125、1.56和0μmol/L的3种植物雌激素,检测ARE诱导倍数的变化.分别检测3种植物雌激素24h处理后诱导细胞中抗氧化基因Nrf2、SOD1、SOD2、SOD3、HO-1、GSTm、GSTp、NQO1、CAT和CLGC等的mRNA表达水平.在MCF7细胞中,检测25μmol/L的白藜芦醇和大豆黄酮对野生型Keap1蛋白抑制Nrf2-ARE表达的影响.结果 在MCF7、HeLa和SK-OV-3细胞中,3种植物雌激素均能诱导ARE报告基因的高表达,并促进Nrf2、SOD3、GSTp、CAT和CLGC等抗氧化基因的高表达.同时,25μmol/L的白藜芦醇和大豆黄酮在MCF7细胞中能够有效淬灭Keap1蛋白对ARE表达的抑制作用.结论 植物雌激素白藜芦醇、染料木黄酮和大豆黄酮能够在人类宫颈癌细胞HeLa、乳腺癌细胞MCF7和卵巢癌细胞SK-OV-3中诱导抗氧化信号通路.诱导效应具有剂量依赖性和组织特异性.转录调控蛋白Keap1可能参与了诱导反应机制.
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肺癌细胞系中KEAP1与NRF2相互作用区域基因突变的检测
目的 检测非小细胞肺癌细胞系中KEAP1及NF-E2相关因子2(NRF2)相互作用结构域基因的突变情况.方法 以6个非小细胞肺癌细胞系为材料,检测KEAP1基因的第2至第6外显子及NRF2的DLG和ETGE基序编码序列的碱基序列突变情况,推测相应的氨基酸序列变异.同时检测供试细胞系的细胞内活性氧浓度,分析目标序列突变对肺癌细胞抗氧化系统的影响.结果 在KEAP1基因第4外显子区域发现4个所有癌细胞系共有的突变,部分细胞系的第3外显子区域还存在错义突变,所有NRF2-ETGE基序编码序列均存在多重遗传变异.活性氧检测发现供试细胞系活性氧浓度均高于肺胚细胞.结论 KEAP1和NRF2基因相互作用结构域的基因突变在供试细胞系内普遍存在,非小细胞肺癌细胞系对细胞内活性氧浓度失去调控能力是普遍现象.
关键词： NF-E2相关因子2 非小细胞肺癌 Keap1 -
砷对Keap1基因沉默的人皮肤角质细胞砷甲基化代谢酶表达的影响研究
目的 砷对Keap1基因沉默的人皮肤角质(HaCaT)细胞砷甲基化代谢酶表达的影响.方法 实验共五组,A组为正常HaCaT细胞,B、C、D、E组为模型细胞.A、B组不给砷,C、D、E组给予不同浓度的砷.五组细胞在8h、24h、48h、72h,用实时荧光定量PCR(qPCR)检测核转录因子红胞系-2p45(NF-E2)相关因子-2(Nrf2)、KELCH样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)、三价砷甲基转移酶(As3 MT)、N-6-腺嘌呤DNA甲基转移酶1(N6AMT1)的基因表达;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞内同型半胱氨酸(HCY)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、As3MT、N6AMT1的蛋白浓度.结果 (1) QPCR结果发现:与A组比,抑制Keap1基因使细胞中N6AMT1基因表达在8h、24h、48h表达上调(P＜0.05).与B组比:砷浓度2.9 μ.mol/L,8h、72h N6AMT1、24h As3MT基因表达上调(P＜0.017),8h、72h As3MT、24h N6AMT1基因表达下调(P ＜0.017);砷浓度5.8 μmol/L,8h N6AMT1、48h As3MT基因表达上调(P ＜0.017),8h As3MT、48h N6AMT1基因表达下调(P＜0.017).砷浓度29μmol/L时,24h N6AMT1基因表达下调(P ＜0.017),As3MT基因表达上调(P＜0.017).(2) ELISA结果发现:与B组比,砷浓度≤5.8μmol/L SAM、HCY蛋白表达上调(P ＜0.0125);砷浓度29 μmol/L抑制SAM、HCY蛋白的表达下调(P＜0.0125).结论 N6AMT1在抗氧化中发挥重要作用;在砷代谢中,As3MT、N6AMT1表达保持动态平衡;长时间、高浓度的砷会造成砷代谢障碍.
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核因子E2相关因子在氧化应激中的作用
核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid-derived factor 2-related factor,Nrf2或NFE2L2)在人类中是一种由NFE2L2基因编码的转录因子[1].Nrf2诱导不同基因的表达编码多种抗氧化酶,在氧化应激的调控中发挥重要的生理作用.目前以Nrf2为新靶点作为干预氧化应激生理过程的研究引起了广大研究者的兴趣.本文就Nrf2结构、信号通路、调控机制及其功能做一综述.
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Nrf2、Keap1蛋白在104例肺腺癌中的表达及其临床病理特征
背景与目的 前期研究表明核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2, Nrf2)和Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)的表达在肺癌患者中存在个体差异,其与化疗或表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)的疗效相关,但Nrf2及Keap1在不同驱动基因肺腺癌患者中的表达情况仍不清楚.本研究旨在探讨Nrf2、Keap1在肺腺癌患者中的表达与EGFR基因突变状态的关系及其对EGFR-TKIs疗效的影响.方法 应用免疫组化方法检测104例EGFR结果明确的肺腺癌患者,确定Nrf2、Keap1的表达情况,并分析其临床病理特征.结果 104例患者中Nrf2阳性率为71.2%,Keap1高表达率为34.6%;Nrf2阳性率与性别、分期和EGFR突变状态显著相关(P<0.05),而与年龄、吸烟、分化程度、病理亚型无关(P>0.05);Keap1表达水平与年龄、性别、吸烟、病理亚型、肿瘤分化、EGFR突变状态等均无关(P>0.05);EGFR-TKIs治疗的患者无进展生存期(progression free survival, PFS)和总生存期(overall survival, OS)与Nrf2表达水平显著相关(P>0.05),但与Keap1表达水平无关(P<0.05).Nrf2高表达组的中位PFS、OS显著低于低表达/阴性组(P<0.05).多因素分析表明Nrf2表达水平是EGFR-TKIs PFS和OS的独立预测因素.结论Nrf2阳性率与EGFR基因突变状态显著相关,Nrf2在EGFR突变肺腺癌患者中的表达水平与EGFR TKIs疗效显著相关,因此,Nrf2是预测EGFR TKIs疗效的理想指标和潜在的干预靶点.
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Keap1在非小细胞肺癌中的表达及与化疗疗效相关性的研究
背景与目的 已有研究表明Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1,Keap1)与铂类耐药相关.本研究旨在探讨Keap1在进展期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及其与一线含铂化疗方案疗效的相关性.方法 应用免疫组化检测50例进展期NSCLC患者组织标本中Keap1的表达.结果 进展期NSCLC患者中Keap1高表达率为26.0％; Keap1表达水平与化疗疗效、无进展生存期(progression free survival,PFS)有关(P＜0.05),而与性别、年龄、吸烟、病理类型、分化程度、转移和总生存期无关(P＞0.05).Keap1高表达组的中位PFS明显高于低表达组(P=0.002).多因素分析表明Keap1表达水平是一线化疗方案PFS的独立预测因素( P=0.007).结论 Keap1与进展期NSCLC一线化疗疗效和PFS有关,Keap1可能成为新的化疗疗效预测指标.
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姜黄素对HepG2细胞增殖及Keap1、Nrf-2表达的影响
目的 探索姜黄素对肝癌HepG2细胞增殖及Keap1、Nrf-2表达的影响.方法 姜黄素(10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)处理HepG2细胞,采用MTT法检测细胞增殖活力,Real-time PCR法检测Keap1 mRNA的表达,Western blotting法检测Keap1及Nrf-2蛋白的表达,荧光酶标仪检测细胞内活性氧(ROS)的变化.结果 姜黄素可抑制HepG2细胞的增殖活性,中剂量组与低剂量组相比具有显著性差异(P＜0.05),高剂量组与中剂量组之间差异不明显(P＞0.05);姜黄素可促进Keap1 mRNA及蛋白的表达,表达量随着药物浓度上升呈升高趋势(P＜0.05);姜黄素可抑制Nrf-2蛋白表达,且随着药物浓度的增加Nrf-2蛋白表达量降低(P＜0.05);随着姜黄素浓度增加,HepG2细胞内ROS生成量升高(P＜0.05).结论 姜黄素可以抑制HepG2细胞的增殖,其机制可能与促进Keap1表达,从而抑制Nrf-2核转位,致Nrf-2抗氧化功能弱化,ROS生成增加,促进了细胞凋亡有关.
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细胞凋亡与Nrf2信号通路研究进展
核转录因子Nrf2信号通路是调控细胞对抗外来异物和氧化损伤的关键通路,已经明确其在细胞凋亡中发挥十分重要的作用.本文从Nrf2信号通路对细胞凋亡的保护作用、与凋亡相关蛋白之间的相互作用、以及促进肿瘤细胞凋亡和增强肿瘤细胞耐药性的双重作用等方面,就细胞凋亡与Nrf2信号通路关系的相关研究进展进行综述.
