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B、T淋巴细胞弱化因子在人类免疫性疾病中的作用及机制研究进展
B、T淋巴细胞弱化因子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA）是类似于CTLA-4和PD-1的一种共抑制性分子，在负向调控外周免疫耐受和免疫应答中具有重要作用。动物疾病模型的研究表明：BTLA 在多种疾病的发生、发展中起着重要的作用，但在人类免疫性疾病中的作用尚不明朗。本文以近年来BTLA在人类免疫性疾病的临床研究为基础，综述BTLA在人类免疫性疾病中的作用及机制，从中归纳其在人类免疫性疾病中的规律，探讨BTLA在临床疾病发生、发展的机制，为以BTLA为靶点的人类免疫性疾病的诊断、治疗和预防策略提供依据。
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HIV感染者调节性T细胞表面B、T淋巴细胞衰减因子的表达研究
目的:对HIV感染者调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)上B 、T淋巴细胞衰减因子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)的表达水平进行检测,并探讨其在HIV感染进程中的作用.方法:选取24例感染在一年之内的HIV早期感染者(Early HIV infected patients,EHI组)、14例感染超过一年的HIV慢性感染者(CD4+T计数>200 cells/μl,HIV组)、6例AIDS患者(CD4+T计数<200 cells/μl,AIDS组)和9例健康人作为对照,应用流式细胞仪检测不同时期感染者及健康对照者Treg细胞BTLA的表达水平,分析其与疾病进展及免疫活化的相关性.结果:随着HIV疾病进展,EHI组、HIV组及AIDS组Treg细胞BTLA表达水平依次升高,其中HIV组与AIDS组Treg细胞BTLA表达水平显著高于EHI组(P<0.05及P<0.01),AIDS组Treg细胞BTLA的表达水平高于健康对照(P<0.05);Treg细胞BTLA表达水平与CD4+T淋巴细胞计数呈负相关(P<0.001),与病毒载量呈正相关(P<0.01);Treg细胞BTLA表达水平与活化CD4+CD38+T淋巴细胞及CD4+HLA-DR+T淋巴细胞呈正相关(P<0.001,P<0.001).结论:HIV感染者Treg细胞BTLA表达升高,与疾病进展显著相关,提示其可能通过加强Treg细胞的抑制功能加速疾病进展,并为未来HIV感染的干预提供信息.
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HIV早期和慢性感染者不同亚群T细胞BTLA的表达
目的:对中国HIV早期和慢性感染者不同亚群T细胞BTLA表达水平及与疾病进展相关性进行研究,探讨BTLA表达在HIV感染中的作用.方法:选取21例HIV早期感染者、29例HIV慢性感染者及23例正常对照,应用流式细胞仪检测CD4+CD45RA+、CD4+CD45RA-、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RA-及总CD4+、CD8+T细胞BTLA表达水平,同时分析CD4+HLA-DR+、CD4+CD38+、CD8+HLA-DR+、CD8+CD38+T细胞表达水平,分析不同亚群T细胞BTLA表达水平与疾病进展及免疫活化的相关性.结果:HIV早期感染组各亚群T细胞BTLA表达水平高于正常对照,其中CD4+CD45RA-、CD8+CD45RA-、总CD4+T细胞BTLA表达水平在两组之间差异具有统计学意义(P＜0.01);HIV早期感染组各亚群T细胞BTLA表达水平高于慢性感染者,除CD8+CD45RA-T细胞外,其它亚群T细胞BTLA表达水平在两组之间差异具有统计学意义(P＜0.01);慢性HIV感染者CD8+CD45RA+T细胞BTLA表达水平低于正常对照,差异显著(P＜0.01),其余T细胞亚群 BTLA表达水平在两组之间无明显差异.HIV感染者T细胞亚群BTLA表达水平与T细胞活化水平负相关:除CD8+CD45RA-T细胞外,各亚群T细胞BTLA表达百分率与T细胞活化(CD4+HLA-DR+T细胞表达)水平明显负相关(P＜0.01);各亚群T细胞BTLA表达水平与CD4+CD38+、CD8+CD38+T细胞表达水平无明显相关性.HIV感染者总CD8+T细胞BTLA表达水平与CD4+T细胞数量明显正相关(P＜0 01).结论:中国HIV感染者T细胞BTLA表达与疾病进展及免疫活化状况显著相关,早期感染阶段BTLA表达升高,慢性感染期表达下降,为明确HIV的致病机制及免疫治疗提供线索.
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BTLA信号对T细胞活化的起始和早期阶段的调节作用
目的:观察BTLA分子在T细胞上的表达并探讨其在各个阶段不同时相对T细胞活化的抑制.方法:分离人外周血单个核细胞,经阴性选择磁珠分离纯化获得T淋巴细胞.检测T细胞上BTLA、CTLA-4和PD-1的表达;用CD3抗体刺激T细胞活化,比较BTLA、CTLA-4和PD-1在T细胞活化过程中的动态表达.CD3抗体联合CD28抗体活化T细胞,在不同的活化时间,MTT法检测BTLA单抗8H9对T细胞增殖的影响.GM-CSF和IL-4体外诱导单核细胞分化成未成熟DC,CD40抗体刺激DC成熟,流式榆测HVEM在DC上的表达.用DC诱导T细胞活化,加入游离8H9或抗HVEM抗体,阻断HVEM和BTLA结合,MTT法检测T细胞增殖.结果:静止T细胞组成性高表达BTLA,不表达CTLA-4和PD-1分子.T细胞活化后,BTLA分子表达有所降低,然后迅速回升至高水平.CTLA-4、PD-1分子在活化后两大几乎不表达,第三天开始表达并逐渐上升.8H9可以抑制CD3和C028抗体活化的T细胞增殖.CD3和CD28抗体预先活化T细胞24小时或48小时后,再加入8H9仍然具有抑制效应,但不如在T细胞活化之初加入8H9的抑制效应.单核细胞诱导的不成熟DC上高表达HVEM,当DC成熟后,HVEM表达降低.用游离8H9或HVEM抗体阻断DC表面HVEM与T细胞表面BTLA结合,48小时之内均明显增强了DC诱导的T细胞增殖.结论:BTLA信号可以提高T细胞的活化阈值,在T细胞活化的起始和早期阶段发挥重要的负性调控作用.
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肿瘤坏死因子受体超家族成员HVEM/TR2研究进展
HVEM/TR2是近来发现的肿瘤坏死因子受体超家族成员,可与单纯疱疹病毒包膜糖蛋白D(HSV-gD)结合介导HSV感染细胞过程;可与其配体LIGHT结合刺激T细胞增殖,在肿瘤免疫、移植免疫、炎症反应、自身免疫性疾病的发生及胸腺阴性选择等过程中发挥重要的生物学作用.另外,新近发现它可与另一配体BTLA结合而抑制T细胞增殖,可能为自身免疫病的治疗提供新思路.
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负性共刺激分子与自身免疫病
T细胞活化需要识别双信号系统,即MHC-抗原肽提供的第一信号和共刺激分子提供的协同刺激信号.共刺激分子中有正性分子和负性分子之分,二者之间的平衡对自身免疫的启动,发生,发展有重要意义.负性共刺激分子除了CTLA-4外,PD-1、BTLA、TIM-3为新近发现的负性共刺激分子,在多种自身免疫性疾病发生、发展中起作用.本文就其结构,表达,功能及负性调节机制及其与自身免疫病的关系作简要阐述.
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LIGHT-HVEM-BTLA共信号分子的研究进展
BTLA是新近发现的一个CD28 超家族共抑制分子,它的配体不是B7家族成员而是TNF受体超家族成员 HVEM.HVEM同时还存在一个TNF超家族的配体,即T细胞上可诱导表达的与HSV的糖蛋白D竞争结合HVEM的淋巴毒素类似物(LIGHT).HVEM可以作为一个分子开关,通过结合LIGHT或BTLA在免疫调节中发挥不同的作用.
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B7-CD28家族成员的免疫调节功能及其新研究进展
近年来,随着对共刺激家族成员的深入研究,人们发现其成员不断扩大,而且它们在免疫反应中的作用也有所不同,本文主要对其家族成员的免疫调节功能及其新研究进展进行综述.
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新型负性共刺激分子-BTLA的研究进展
BTLA(B and T lymphocyte attenuator)是近年发现的免疫球蛋白表面分子家族成员,其与细胞毒T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、程序坏死因子-1(PD-1)构成了一组抑制性受体,主要在T、B淋巴细胞上表达.BTLA4与其配体结合后,对活化的T细胞可产生抑制效应,从而防止过强的细胞免疫应答,维持耐受,保护机体免受自身免疫反应的损伤.目前对于BTLA的配体,以及BTLA与配体相互作用的确切机制尚未完全明确,故就近年来关于BTLA的分子结构,表达与分布情况,配体分子,及其在免疫应答中作用的研究进展作一综述.
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人共信号分子HVEM在外周血PBMC表达特性及其对T细胞的生物学作用
HVEM既可作为受体与LIGHT作用传递正性共刺激信号,又能作为配体作用于BTLA介导负性共抑制信号.为深入探讨HVEM对T细胞复杂而又独特的调控作用,本文研究了HVEM在免疫细胞上的表达特性,初步探讨了T细胞表达的HVEM分子所介导的生物学作用.采用LPS刺激人新鲜PBMC,以及PHA或PMA/IM刺激活化T细胞;间接免疫荧光标记和流式细胞术检测HVEM表达;MTT法分析T细胞增殖作用.结果显示,HVEM在不同条件刺激活化的T细胞表面均呈现先上调后下调表达;T细胞增殖试验表明,基因转染细胞L929/LIGHT能够明显促进T细胞的增殖及IL-2和IFN-γ的分泌,而以抗人BTLA单抗在一定程度上模拟HVEM所介导的BTLA/HVEM信号能够明显抑制T细胞增殖作用及细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-10的产生.
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一株鼠抗人BTLA功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性鉴定
为了研制鼠抗人BTLA功能性单克隆抗体,以高表达人BTLA分子的基因转染细胞L929/BTLA为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并以基因转染细胞293T/BTLA和293T/mock作为抗原,筛选阳性杂交瘤克隆,经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复鉴定和多次克隆化培养,筛选获得分泌特异性鼠抗人BTLA分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用Ig亚型快速定性试纸法、细胞核染色体计数、竞争结合抑制试验和T增殖抑制试验等对单抗进行生物学特性的鉴定.结果表明,成功获得一株持续、稳定分泌鼠抗人BTLA单克隆抗体的杂交瘤细胞株8H9,该单抗可特异性识别基因转染细胞以及静止与活化T淋巴细胞上表达的BTLA分子,单抗8H9和BTLA交联后能显著抑制鼠抗人CD3单抗对T细胞激发的增殖作用.
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BTLA信号通路在免疫调节中的作用
BTLA(CD272)属于免疫球蛋白超家族成员,广泛表达于免疫细胞,其配体为HVEM.BTLA基因敲除小鼠淋巴器官发育基本正常,但TCR诱导的免疫应答反应显著增强,CD8记忆T细胞数量显著增多；抗原特异性IgG反应增强,并逐步出现自身抗体、高丙球蛋白血症以及自身免疫性肝炎样疾病.这些结果证明,BTLA具有抑制细胞及体液免疫反应的功能.BTLA信号通路与部分自身免疫性疾病、艾滋病等感染性疾病、肿瘤和移植物抗宿主病等的发生和发展密切相关,调控BTLA信号通路有望用于相关疾病的免疫治疗.
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BTLA在肿瘤免疫中的作用及其临床意义
继程序死亡分子(PD-1)与细胞毒性T细胞相关抗原-4(CTLA-4)之后,CD28家族的新成员B、T淋巴细胞弱化因子(BTLA)已成为新的研究热点.BTLA表达谱介于PD-1和CTLA-4之间,它不仅表达于T细胞,在B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞中也有表达.BTLA与其配体结合传递共抑制信号,在机体抗肿瘤免疫应答中发挥负性调节作用,并与肿瘤的免疫逃逸机制相关,可能成为肿瘤生物治疗潜在的靶点.
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BTLA与HVEM相互作用对T细胞活化的影响
目的：探讨小鼠髓系树突状细胞（BMDC）上HVEM与T细胞上BTLA相互作用对T细胞活化的影响。方法：C57BL／6小鼠的BMDC与T细胞混合培养，HVEM抗体封闭BMDC上的HVEM后，采用MTT法检测T细胞的活化增殖，ELISA试剂盒检测IL-2的分泌。结果：混合培养的启动和早期（0～48 h）、中晚期（48～96 h）以及全程（0～96 h），加入HVEM抗体实验组的T细胞增殖效应均明显高于对照组（P＜0．05），同时CD3＋T细胞组和CD4＋T细胞组IL-2的分泌明显高于对照组（P＜0．05）。结论：BTLA-HVEM相互作用产生的负性信号对T细胞的活化起抑制作用，特别是在BMDC与T细胞混合培养的启动和早期（0～48 h），BTLA负性信号就有抑制T细胞活化的作用，有别于传统的负反馈调节抑制，提示T细胞的活化可能存在多种负性调节模式。
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小鼠BTLA基因重组慢病毒载体的构建及鉴定
目的:构建小鼠B、T淋巴细胞衰减子(BTLA)基因重组慢病毒载体,探讨BTLA基因过表达对小鼠脾T淋巴细胞增殖及活化的影响.方法:以小鼠脾脏组织总RNA为模板,逆转录为cDNA,通过PCR技术扩增BTLA基因,构建pWPTS-mBTLA慢病毒载体,磷酸钙法感染人胚肾上皮细胞株293T细胞.RT-PCR及Western blot法检测BTLA mRNA和BTLA蛋白表达,50％组织培养感梁剂量(TCID50)法检测重组慢病毒滴度.通过感染pWPTS-mBTLA及pWPTS-GFP慢病毒载体的293T细胞与小鼠脾脏T淋巴细胞混合培养,初步研究BTLA基因过表达对小鼠脾T淋巴细胞活化与增殖的影响.结果:成功构建小鼠pWPTS-mBTLA慢病毒载体,并制备高滴度病毒颗粒(1.3×108 pfu/ml).通过对比实验组与对照组小鼠脾T淋巴细胞的增殖结果,发现4d及8dT细胞的增殖效应均明显受抑制,差异具有统计学意义(P＜0.05),且这种抑制作用在0～8 d内具有时间依赖性.结论:过表达BTLA基因的293T细胞与小鼠脾T淋巴细胞混合培养后对其增殖及活化有抑制作用,提示成功构建具有生物学效应的小鼠BTLA基因重组慢病毒载体.
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BTLA负性共刺激分子修饰树突状细胞对大鼠移植肝脏的免疫保护作用
目的 探讨BTLA修饰的树突状细胞(DC)对肝脏移植物免疫保护的诱导作用及机制.方法 72只大鼠肝移植免疫排斥模型(选择DA大鼠36只为供体,Lewis大鼠36只为受体),随机分为3组:A组(非干预组,n=12)移植术后不用免疫抑制剂;B组(FK506处理组,n=12)术后用FK506 0.2 mg/(k·d)灌胃;C组(BTLA干预组,n=12;即经重组腺病毒Adv-BTLA修饰的DC回输组).分别于术后3、5、7 d随机解剖受体大鼠6只,取材肝组织对移植肝进行病理学观察,同时静脉采血测定血清谷丙转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)和总胆红素(TBIL)浓度;每组各留6只观察其生存时间和死亡原因.结果 A组的DA→Lewis组合的模型术后血清生化指标、肝脏病理学改变、生存情况均符合肝移植急性排斥的特点,排斥反应于术后3～5 d出现,并逐渐增强,术后7 d迅速达到高峰并维持;B组急性排斥可以为免疫抑制药物FK506预防而达到长期存活;C组急性排斥程度明显减轻,且排斥反应出现时间要晚,受体大鼠存活时间明显延长.A、B和C组中位生存时间分别为14、73、26d;3组的累积生存率曲线差异有统计学意义(Log-Rank取值为19.13,P＜0.01).结论 BTLA修饰的DC可以对大鼠移植肝脏起到免疫保护作用;经BTLA修饰的供体DC细胞迁移到受体组织内,能够抑制肝移植急性排斥反应,并延长移植肝和受体大鼠存活时间.
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BTLA与免疫性疾病关系的研究进展
BTLA是近年发现的CD28家族共抑制受体,主要表达于T、B细胞,在DC、单核及NK细胞上也有表达,其结构和功能与其它两种抑制性受体CTLA-4和PD-1相似.已证明BTLA的配体是HVEM,两者结合可负性调节T、B细胞的激活与增殖.近研究发现BTLA与多种免疫性疾病(如自身免疫性疾病、移植排斥反应、肿瘤等)的发生、发展有关.随着对BTLA生物学功能研究的不断深入,必将阐明BTLA在免疫性疾病发生、发展中的作用及机理,为免疫性疾病治疗提供新思路.
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B7/CD28家族共刺激分子在川崎病发病机制中的作用
目的 观察在川崎病(KD)患儿外周血单个核细胞(PBMC)B7/CD28家族分子:CTLA-4、BTLA、ICOS、CD80、CD86表达变化,旨在探讨B7/CD28家族分子在KD发病机制中的作用. 方法应用荧光定量PCR检测48例KD患儿和其中30例用丙种球蛋白(IVIG)治疗后患儿的CTLA-4、BTLA、ICOS mRNA表达的变化,部分患儿应用流式细胞术测定CD80、CD86表达状况.本研究以25例同龄健康儿童作为对照组.结果 (1)KD组与对照组相比:正性调节因子ICOS mRNA的表达显著升高(P<0.01);CD80、CD86表达升高(P<0.01);负性调节因子CTLA-4、BTLA mRNA的表达则显著降低(P<0.05, P<0.01).其中冠状动脉损害组较无冠状动脉损害组ICOS表达程度更高(P<0.01).(2)KD组中IVIG治疗前后进行配对比较:IVIG治疗后CTLA-4、BTLA mRNA表达显著回升(P<0.05),ICOS mRNA的表达则显著下降(P<0.05). IVIG治疗不敏感组与敏感组比较:ICOS表达前者显著升高(P<0.05),CTLA-4、BTLA表达显著降低(P<0.05). 结论 KD患儿B7/CD28家族分子正性调节因子过度表达,负性调节因子表达不足可能是KD免疫发病机制的重要环节.正性调节因子过度表达可能与KD冠状动脉损害有关; IVIG治疗可能在纠正KD淋巴细胞过度活化中发挥作用;正、负调控因子表达失衡程度可能与KD IVIG疗效有关.
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BTLA介导的负调共刺激信号对混合淋巴细胞反应抑制的研究
目的 HVEM基因突变体腺病毒载体对大鼠混合淋巴细胞反应(MLR)的影响.方法 RT-PCR获得人HVEM的cDNA,使其与LIGHT分子结合的表位点突变,保留与BTLA结合的关健位点.构建经修饰的HVEM基因的复制缺陷型腺病毒载体Adv-mHVEM-IRES2-EGFP并对其进行鉴定和转染效率测定.将该载体用于混合淋巴细胞反应中,观察对淋巴细胞增殖的影响.结果 成功构建HVEM突变体和EGFP复制缺陷型腺病毒载体,经过测序与预期一致,体外培养细胞转染效率达到95%以上.该载体能够对大鼠MLR有明细的抑制作用.结论 构建的腺病毒载体能够共表达目的基因的产物HVEM突变体和EGFP蛋白,对体外细胞具有高效转染能力.该载体能够对大鼠混合淋巴细胞反应有明显的抑制作用.
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BTLA蛋白胞外区片段的制备及鉴定
目的克隆人的BTLA蛋白分子的基因胞外区片段(Extracellular region of BTLA,exBTLA),并在Flp-In CHO系统表达、纯化,用于单克隆抗体的制备或直接进行功能研究.方法用RT-PCR方法制备exBTLA基因,以哺乳细胞高效表达质粒载体pSec/WG为载体构建重组融合exBTLA-Ig Fc/pSec/WG质粒.重组体经双酶切鉴定后,再通过测序鉴定克隆的正确性.采用脂质体法将重组质粒转染Flp-In CHO细胞,G蛋白亲和层析法纯化蛋白.用Western blotting检测BTLA基因胞外区表达的特异性.结果正确构建了exBTLA/pSec/WG重组质粒,并在转染细胞所分泌的上清液中检测出了蛋白片段的表达.利用亲和层析法成功纯化出特异的exBTLA蛋白.结论成功地构建了exBTLA/pSec/WG重组质粒,纯化出exBTLA蛋白,为下一步mAb制备及其功能研究提供实验依据.
