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TNF-α对缺氧复氧损伤的肾小管上皮HK-2细胞NGAL表达的影响
目的 研究TNF-α对缺氧复氧损伤的HK-2细胞中NGAL表达的影响,探讨NGAL作为早期AKI标志的意义.方法 模拟缺氧复氧模型,RT-PCR法检测不同缺氧时间和不同浓度TNF-α作用后NGAL表达水平.结果 缺氧复氧后NGAL表达上调,1、2、4 h组均高于0.5 h组.随TNF-α浓度增高NGAL表达增加.缺氧1 h,同时200 μg/L TNF-α刺激后,NGAL明显提高.结论 缺氧复氧后,NGAL表达明显增强,TNF-α的大量产生,可能是NGAL表达增加的直接原因之一.
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生物人工肾小管对动物模型细胞因子水平及生存时间的影响
目的:观察人工肾小管辅助装置(bio-artificial renal tubule assist device,RAD)对动物模型细胞因子水平、生存时间的影响.方法:经盲肠结扎加穿孔及双侧输尿管结扎术造模后的12头猪被随机平均分为3组,分别为RAD治疗组、不含小管细胞的假RAD治疗组和非治疗对照组.各组分别定时抽取静脉血检测血液电解质、肾功能指标.应用猪特异性酶联免疫试剂盒测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,并记录两组动物的存活时间.结果:RAD组透析前后的血钾均值为(6.92±0.12),(4.39±0.46)mmol/L,血肌酐均值为(911.3±100.7),(652±130)μmol/L,TNF-α均值为(0.537±0.038),(0.278±0.069)μg/L,与对照组比较,差异均有显著性意义(P＜0.05).RAD组的平均生存时间为[(110.25±18.69)h],明显长于非治疗对照组[(72.84±11.62)h]和假RAD治疗组[(75.20±19.08)h],差异有显著性意义(P＜0.05).结论:用RAD治疗可降低多脏器功能障碍综合征(multiple organ dysfunction failure,MODS)并急性肾功能衰竭(acute renalfailure,ARF)动物的TNF-α水平,并延长其存活时间.
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2型糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中相关蛋白及转化生长因子β1的变化
目的:观察2型糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中的标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白、角蛋白18及转化生长因子β1表达变化,分析糖尿病肾病时肾小管病变、肾间质纤维化可能的发生、发展机制.方法:实验于2002-10/2003-05在河北医科大学第二医院完成.纳入二级8周龄雌性SD大鼠40只.随机分为正常对照组和糖尿病组,各20只.通过高糖、高脂饮食加腹腔注射小剂量链脲佐菌素的方法,制作2型糖尿病大鼠模型.分别动态观察12,24周时对照组,糖尿病组大鼠糖尿病肾病时,肾脏的病理改变及功能变化,并同时应用免疫组化技术及流式细胞学技术检测肾小管上皮细胞转分化过程中的标志蛋白:α-平滑肌肌动蛋白、角蛋白18及转化生长因子β1在肾小管上皮细胞中的表达. 结果:糖尿病组共成模16只,血糖没有升高的大鼠未纳入结果分析,两组共纳入结果分析36只.①糖尿病组大鼠12周时光镜下可见部分肾小管轻度萎缩或管腔扩张,上皮细胞水肿,胞浆内可见小脂肪空泡,肾小管损伤指数增高;24周时上述变化程度加深,管腔内可见破碎脱落的细胞.24周电镜下可见线粒体部分水肿,嵴大部分消失,微绒毛显著减少,部分肾小管基底膜明显增厚,小管间可见大量胶原纤维.②免疫组化显示:糖尿病组大鼠肾小管上皮细胞胞浆中α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子β1表达增强,角蛋白18表达则下降,它们均随病程进展而加重.③流式测α-平滑肌肌动蛋白及转化生长因子β1表达与免疫组化结果一致,并且与三酰甘油、胆固醇、24 h尿白蛋白排泄率明显正相关,与肌酐清除率负相关.结论:在2型糖尿病肾病的发展过程中确实存在小管上皮-肌成纤维细胞转分化,而且转化生长因子β1是其重要的促进因子.小管上皮-肌成纤维细胞转分化与肾功能下降的程度相平行.
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肾脏组织工程研究:生物人工肾小管对多器官功能障碍猪白细胞介素10水平及生存时间的影响
目的:观察用猪细胞株(LLC-PK1)构建的生物人工肾小管装置(renal tubule assist device,RAD)对多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)猪细胞因子白细胞介素10(IL-10)及预后的影响.方法:健康杂交家猪16只,用盲肠结扎和穿孔加双侧输尿管结扎术制作重症感染性MODS并ARF模型,并随机分为3组:RAD治疗组(n=5):将RAD与血滤器连接,对MODS猪模型行连续性静脉-静脉血液滤过(continuous venovenous hemofiltration,CVVH)治疗;假RAD治疗组(n=5):将RAD换为无细胞的假RAD,余与RAD治疗组相同;对照组(n=6).观察生命指标、肝肾功能、血气分析、IL-10和生存时间等.结果:①低血压明显改善:RAD治疗组治疗24 h时平均动脉压显著高于同时间点的假RAD治疗组、对照组[(92.75±2.22),(63.50±11.82),(53.50±2.52)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),F=33.08,P<0.01];透析4～20 hRAD治疗组动物精神状态明显好转,假RAD治疗组、对照组无显著变化(P>0.05).②RAD治疗组、假RAD治疗组两组间血丙氨酸转氨酶、肌酐值比较无显著差异.③细胞因子:RAD治疗组IL-10的峰值明显高于假RAD治疗组、对照组[(241.40±86.64),(106.30±9.69),(102.59±10.21)ng/L,F=9.75,P<0.05].④生存时间:RAD组的平均生存时间为(110.25±18.69)h,明显长于对照组[(74.96±23.00)h]和假RAD治疗组[(81.20±11.76)h](F=5.66,P<0.05),前者比后两者分别延长了47.1%,35.8%.结论:用RAD治疗改善了MODS的生命指标,并促使抗炎因子IL-10显著升高、生存时间明显延长.
关键词： 肾小管/细胞学 肾 人工 白细胞介素10/血液 器官功能衰竭/治疗 -
缺氧与氧化损伤后肾小管上皮细胞能量代谢及细胞骨架的改变
目的:观察缺氧、氧化损伤后培养的人肾小管上皮细胞能量代谢及细胞骨架改变之间的关系.方法:实验于2002-09/2003-09在解放军第三军医大学西南医院实验动物中心完成.①将人肾小管上皮细胞株HK-2细胞分为正常组、缺氧组、氧化损伤组3组:正常组中加入无血清RMPI1640培养液;缺氧组加入含0.1μmol/L抗霉素A的无血清无底物RMPI1640培养液;氧化损伤组加入含0.1 mmol/L H2O2的无血清RMPI1640培养液.②观察各组细胞生长状况和形态及细胞存活率;测定细胞外液乳酸脱氢酶比活性代表肾小管上皮细胞膜通透性变化;采用ATP酶(Na+,K+和Ca2+-ATP)试剂盒直接测定各组细胞能量代谢改变,采用细胞免疫荧光化学方法检测各组细胞细胞骨架改变.结果:①正常组细胞生长状况良好,折光性强;缺氧、氧化损伤组细胞皱缩、突起减少,细胞存活率明显低于正常组[(56.2±2.3)%,(62.5±2.6)%,(96.5±3.2)%,P＜0.01].②缺氧、氧化损伤组乳酸脱氢酶比活性显著高于正常组(P＜0.01).③Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性正常组明显高于缺氧、氧化损伤组[(9.61±0.53),(3.68±0.27),(5.10±0.19)nkat/g;(7.97±0.66),(3.12±0.24),(4.56±0.32)nkat/g,P＜0.01],而缺氧组、氧化损伤组之间比较差异不显著(P＞0.05).④免疫荧光标记细胞内细胞骨架(微管、微丝、中间丝)显示正常TEC微管、微丝、中间丝表达丰富,在胞浆内呈均匀一致分布;缺氧、氧化损伤后细胞骨架破坏、塌陷,网络结构和支架作用消失.结论:缺氧、氧化损伤能量代谢障碍可造成细胞骨架破坏,终导致肾小管上皮细胞的坏死和凋亡.
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大鼠BMP-7重组腺病毒构建及在肾小管上皮细胞中表达
目的:利用AdEasy~(TM) system构建携带大鼠BMP-7基因的重组腺病毒,并鉴定其在原代肾小管上皮细胞中的表达.方法:将BMP-7全长序列分为46个片段分段合成,再采用PCR方法将合成的46个寡核苷酸片段拼接成BMP-7基因,并克隆到测序载体中测序鉴定.经Not I和Hind Ⅲ双酶切后接入pShuttle-CMV穿梭载体,构建重组腺病毒的穿梭质粒pShuttle-BMP-7.EcoRI酶切重组pShuttle-BMP-7,与pAdEasy~(TM)DNA电穿孔共转化BJ5183感受态菌, 抽提重组AdBMP-7质粒,PacI酶切线性化重组质粒AdBMP-7后,转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增,腺病毒荧光检测试剂盒测定其滴度.用AdBMP-7感染大鼠肾小管上皮细胞,以ELISA法和Western-blot法检测BMP(-7)在大鼠肾小管上皮细胞中的表达.RT-PCR方法检测α-SMA mRNA的表达水平,以鉴定重组腺病毒AdBMP-7的生物学活性.结果:构建了BMP-7基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度重组腺病毒保存液.该重组腺病毒在体外能有效转染大鼠肾小管上皮细胞并高表达BMP-7蛋白,所表达的BMP-7蛋白能有效逆转由TGF-β1诱导的α-SMA表达增高.结论:成功地构建了携带大鼠BMP-7基因的重组腺病毒,并初步证实其具有一定的抗肾纤维化功能.
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PAX2基因在梗阻性肾病大鼠肾小管上皮细胞重新表达的意义
[目的]探讨PAX2基因在梗阻性肾病大鼠肾小管上皮细胞的重新表达对肾间质纤维化的意义.[方法]80只大鼠随机分为:假手术组(sham 组)和模型组(UUO组)各40只.于术后3d、5d、7d、14d(每组10只)处死取肾组织. 光镜观察肾脏病理形态改变,免疫组化、Western blot及real time PCR检测肾组织PAX2蛋白和mRNA的表达.[结果]①HE和Masson染色观察到UUO组肾间质呈现明显的纤维化.②免疫组化发现sham组肾小管上皮细胞无PAX2表达;UUO组肾小管上皮细胞表达较多;③Western blot显示PAX2蛋白水平在UUO组术后3d相比sham组明显的增加(P<0.05),随着梗阻时间延长PAX2蛋白表达更加明显;④real time PCR显示, PAX2 mRNA与PAX2蛋白的表达趋势相同.⑤相关分析:PAX2蛋白水平与肾小管损伤程度呈正相关(r=0.991,P<0.05),与肾间质纤维化程度呈正相关(r=0.985,P<0.05).[结论]胚胎发育基因PAX2在梗阻性肾病大鼠肾小管存在重新表达;并参与了梗阻性肾病肾小管损伤和肾间质纤维化的过程.
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冬虫夏草对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞ILK表达的影响
[目的]观察糖尿病大鼠肾小管上皮细胞整合素连接激酶(ILK)的表达及冬虫夏草对其表达的影响.[方法]雄性Wistar大鼠随机分为3组:正常对照组(N组,n=12)、糖尿病模型组(D组,n=12)、糖尿病冬虫夏草干预组[C组,n=12,冬虫夏草1000 mg/(kg·d)灌胃].成模后第8周末及16周末各组分别处死6只大鼠,测定24 h尿蛋白排泄量、血肌酐;HE及MASSON染色法观察肾脏病理改变;免疫组织化学法检测ILK、E钙粘蛋白(E-cad)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及转化生长因子β1(TGF-β1)的表达.[结果]①与N组比较,D组大鼠肾小管间质损伤指数、肾间质胶原面积明显增加(P<0.01).②D组大鼠肾小管上皮细胞E-cad阳性表达显著低于N组,TGF-β1、ILK和α-SMA阳性表达均显著高于N组;E-cad表达和TGF-β1表达呈负相关(rs=-0.60,P<0.05);ILK、α-SMA表达和TGF-β1表达呈正相关(rs=0.88,P<0.01;rs=0.91,P<0.05).③C组大鼠肾小管间质损伤指数、肾闻质胶原面积较D组明显减弱,其肾小管上皮细胞的E-cad的表达较D组明显增加,TGF-β1、ILK和α-SMA表达较D组均明显减弱(P<0.01).[结论]冬虫夏草能通过下调ILK表达发挥肾脏保护作用.
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罗格列酮对高糖刺激后HK-2细胞形态变化及FSP1、E-cad表达的影响
[目的]研究罗格列酮(RGZ)对高糖作用下,人近端肾小管上皮细胞(HK-2)形态变化及成纤维细胞特异蛋白1(FSP1)、E-钙粘蛋白(E-cad)表达的影响.[方法]采用第3代细胞株,同步培养后分为3组:N组为正常对照组(含5.5mmol/L葡萄糖),H组为高糖组(含25 mmol/L葡萄糖),HR组为高糖DMEM加RGZ组(H组加入10μmol/L RGZ).光镜和电镜下分别现察HK-2细胞的基本结构与超微结构;Westernblot法检测细胞FSP1、E-cad蛋白表达.[结果]①与N组比较,H组细胞呈梭形变,电镜下粗面内质网增加,线粒体及微绒毛减少;FSP1蛋白表达增强(P<0.01),E-cad蛋白表达减弱(P<0.01).②与H组比较,HR组细胞恢复为多边形或圆形,电镜下微绒毛和线拉体增加,粗面内质网减少;FSP1表达下降(P<0.01),E-cad表达增加(P<0.01).[结论]①高糖刺激后HK-2细胞出现表型转化.②RGZ能够减弱高糖刺激下HK-2细胞的表型转化.
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脓毒症急性肾损伤大鼠肾小管细胞结构及Beclin1表达的变化
[目的]观察脓毒症急性肾损伤大鼠肾小管细胞自噬微细结构及自噬相关蛋白Beclin-1表达变化.[方法]取18只SD大鼠,其中12只采用盲肠结扎穿孔(Cecal ligation and puncture,CLP)制备脓毒症急性肾损伤模型(脓毒症组),6只为假手术组.采用免疫组织化学和免疫印迹技术检测大鼠肾组织Beclin1表达变化,采用光学和透射电镜技术观察两组大鼠肾组织细胞结构的变化.[结果]脓毒症组急性肾损伤24h后,近髓质和髓质外带的近端小管出现大量散在的自噬细胞;自噬细胞皱缩,核染色质固缩边聚,多数自噬颗粒脱落到小管腔内随尿液排出;Beclin1蛋白在脓毒症组肾脏组织中的表达明显高于假手术组.[结论]大鼠脓毒症急性肾损伤24h后,肾组织Beclin1蛋白表达增高,部分近端小管细胞发生自噬.
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脂多糖诱导肾小管上皮细胞 HK-2损伤后自噬相关蛋白LC3、p-Akt 、T-Akt 的表达变化及其意义
【目的】探讨脂多糖诱导肾小管上皮细胞HK‐2损伤后自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3（microtubule‐associated protein light chain 3，LC3）Ⅱ、磷酸化蛋白激酶B （p‐Akt）、总蛋白激酶B （T‐Akt）的表达变化及其意义。【方法】采用脂多糖诱导建立肾小管上皮细胞 HK‐2急性损伤模型，采用Western blot定量法检测损伤后不同时间点自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin‐1和Akt的表达；使用不同浓度的P13K抑制剂LY294002预处理 HK‐2细胞1 h后，Western blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ、p‐Akt 、Beclin‐1的表达情况。【结果】自噬相关蛋白LC3Ⅱ在诱导HK‐2细胞损伤3 h后表达开始逐渐增加，而Beclin‐1无明显变化，p‐Akt表达于损伤后3 h达到高峰，此后逐渐恢复到正常水平；使用P13K抑制剂LY294002预处理 HK‐2后，自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin‐1的表达上调、p‐Akt显著下调。【结论】脂多糖导致肾小管上皮细胞 HK‐2损伤后可诱导自噬发生，且P13K／Akt信号通路在其中可能发挥调节作用。
关键词： 脂多糖类/药理学 肾小管/细胞学 上皮细胞 1-磷脂酰肌醇3-激酶 -
miR-29a对肾小管上皮细胞凋亡的影响及其机制研究
目的 研究微小RNA(miR)-29a在急性肾损伤患者血清中的表达情况,探究miR-29a是否通过调控膦酸酯酶张力蛋白同源物(PTEN)表达影响肾小管细胞凋亡.方法 收集113例急性肾损伤(AKI)患者以及110例健康对照者血清,通过实时荧光定量PCR检测血清中miR-29a的表达情况.体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2),通过转染miR-29a NC和miR-29a mimic到HK-2细胞中,用TGF-β1诱导HK-2细胞凋亡,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,用生物信息学预测miR-29a的潜在靶基因,荧光素酶报告基因实验验证miR-29a与PTEN的互补配对关系,Western blot检测潜在靶基因PTEN的表达情况.再通过转染过表达PTEN的质粒,用流式细胞仪检测HK-2细胞的凋亡情况.结果 与健康对照者血清相比,AKI患者血清中的miR-29a表达水平降低(P＜0.05);流式细胞仪结果显示转染miR-29a mimic后,HK-2细胞的凋亡明显少于转染miR-29a NC组(P＜0.05);荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-29a与PTEN具有互补配对关系;转染过表达PTEN后,肾小管上皮细胞的凋亡率增加(P＜0.05).结论 在AKI患者血清中,miR-29a表达水平降低,过表达miR-29a通过抑制PTEN蛋白的表达从而抑制肾小管上皮细胞凋亡.
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转化生长因子β1通过AKT通路诱导肾小管上皮细胞Twist蛋白的表达
目的 探讨转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是否能影响肾小管上皮细胞Twist表达及可能通路.方法 将肾小管上皮细胞HKCs细胞株分成正常对照组、TGF-β1组(T组)及TGF-β1+特异性抑制剂wortmannin组(T+W组),培养48 h后观察细胞形态,免疫荧光测定E-钙黏素(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscle actin,α-SMA)表达,同时使用免疫印迹(western blotting)测定E-cadherin、α-SMA以及twist的蛋白表达.结果 与正常对照组比较,T组E-cadherin表达明显下降(3.54 ±0.17 vs 16.06 ±0.50,P=0.001);而α-SMA、twist的蛋白明显升高(α-SMA:14.78±0.48 vs 3.75±0.50,P=0.001; twist:14.24±0.14 vs 3.06±0.15,P=0.001).与T组比较,T+W组α-SMA、twist表达明显抑制(α-SMA:3.50 ±0.39 vs 15.0 ±0.24,P=0.001;twist:3.09±0.1 vs 14.04 ±0.16,P=0.001);而E-cadherin表达明显升高(15.88±0.36 vs 3.46±0.19,P=0.001).结论 TGF-β1诱导EMT过程中通过AKT通路诱导twist表达.
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肌酐代谢产物对人肾小管上皮细胞毒性作用的比较研究
目的 比较观察甲基胍、1-甲脲乙醇酸酐对人肾小管上皮细胞的毒性作用.方法 HK-2细胞作为研究对象,分为三组培养:正常对照(A)组,甲基胍(B)组、1-甲脲乙醇酸酐(C)组,用MTT比色试验法检测细胞增殖,NAG酶释放检测对细胞的毒性,Hoechst染色及Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测凋亡.结果 HK-2细胞加入甲基胍、1-甲脲乙醇酸酐后,较正常对照组吸光度值显著下降(0.188±0.011,0.176±0.010 vs 0.545±0.021,F＝1557.74,P＜0.01),NAG酶浓度显著上升(20.488±0.473,22.225±0.565 vs 5.125±0.198,F＝3848.22,P＜0.01).Hoechst33258染色显示凋亡细胞呈现核固缩,染色加深,并出现凋亡小体.流式细胞术显示B组、C组HK-2细胞凋亡率显著高于A组(18.23±1.1581,20.22±1.1433 vs 2.473±0.321,F＝526.06,P＜0.01).C组吸光度值显著低于B组(0.176±0.010 vs 0.188±0.011,t＝2.26,P＜0.05),NAG酶浓度显著高于B组(22.225±0.565 vs 20.488±0.473,t＝-6.67,P＜0.01),凋亡率显著高于B组(20.22±1.1433 vs 18.23±1.1581,t＝-2.762,P＜0.05).结论 1-甲脲乙醇酸酐对肾小管上皮细胞的毒性作用强于甲基胍.
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内皮素-1对糖尿病肾脏疾病鼠肾小管上皮细胞转分化的影响
目的 通过观察糖尿病肾脏疾病(DKD)中肾小管上皮细胞转分化的相关蛋白 α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)及转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达状况,探讨内皮素-1(ET-1)促进DKD的发病机制.方法 对20只大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ),所有大鼠均在第4周后处死,分别检测血清、肾组织ET-1水平,并检测肾组织中E-cadherin、α-SMA和TGF-β1蛋白的表达,以及 α-SMA、TGF-β1的mRNA表达.结果 ET-1可促进肾小管上皮细胞 α-SMA和TGF-β1 mRNA蛋白表达,抑制E-cadherin表达,ET-1受体拮抗剂组和TGF-β1 siRNA组可抑制ET-1对肾小管上皮细胞 α-SMA和TGF-β1的表达,并促进E-cadherin的表达,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 DKD中ET-1可促进肾小管上皮向肌成纤维细胞及间质细胞转分化.
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膜性肾病患者蛋白尿对肾小管上皮细胞转分化的影响
目的 探讨膜性肾病患者蛋白尿对肾小管上皮细胞转分化的影响.方法 提取膜性肾病患者尿蛋白进行蛋白成分分析、细菌内毒素试验、蛋白溶液的肌酐水平等质量鉴定后,尿蛋白组分别按1.0、2.0、4.0、8.0mg/mL蛋白质量浓度刺激人肾小管上皮细胞(hRTEC)48h,空白对照组无尿蛋白,采用蛋白质印迹法(Westernblot)检测hRTEC胞浆内平滑肌肌动蛋白-α(α-SMA)的表达,观察hRTEC转分化情况.结果 膜性肾病患者尿蛋白组分构成:清蛋白为56.4%、转铁蛋白为34.6%、免疫球蛋白G(IgG)为6.9%.膜性肾病患者尿蛋白诱导hRTEC胞浆中α-SMA水平随蛋白质量浓度的增加而增加(P＜0.05).结论 膜性肾病患者的蛋白尿是导致肾间质纤维化的原因之一,并具有质量浓度依赖关系.
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大鼠肾小管上皮细胞分离及其体外原代培养
目的 探讨大鼠肾小管上皮细胞的原代培养方法.方法 在原有肾小管细胞培养方法的基础上进行改良,采用机械研磨过筛、Ⅰ型胶原酶消化法分离出肾小管节段,在DMEM/F12[含5％胎牛血清(FBS)和胰岛素-转铁蛋白-硒]培养基中培养,并进行ZO-1免疫荧光染色鉴定.结果 细胞培养至第3天完全贴壁,为多边鹅卵石样;免疫荧光染色显示90％以上的细胞为ZO-1表达阳性.结论 采用机械研磨过筛、Ⅰ型胶原酶消化、DMEM/F12(含5％FBS和胰岛素-转铁蛋白-硒)培养基中培养的方法可以获得纯度达90％以上的肾小管上皮细胞,可满足对肾小管上皮细胞的研究.
