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HPV16 E6、P21WAF1、CDK2、Livin在宫颈癌中的表达及其意义
目的 探讨人乳头瘤病毒(HPV)16 E6、P21WAF1、CDK2、livin在宫颈癌中的表达及P21WAF1、CDK2、livin与E6的关系.方法 采用免疫组化SP法检测HPV16 E6、P21 P21WAF1、CDK2、livin在20例宫颈癌、40例宫颈上皮内瘤变(CIN)及20例正常对照组中的表达.应用图像分析软件分别对此四个因子的表达进行平均光密度分析.结果 E6、P21WAF1、CDK2、livin蛋白于宫颈癌组高于CIN1-2组及正常组(P<0.05),CIN3组高于CIN1-2组及正常组(P<0.05),宫颈癌组与CIN3组之间差异无统计学意义(P>0.05).CIN1-2组与正常组之间差异无统计学意义(P>0.05).E6分别与P21WAF1、CDK2、livin成正相关(相关系数r分别为0.706、0.713、0.711,P<0.05).结论 E6、CDK2与宫颈癌的发生、发展密切相关,E6、CDK2异常高表达可能是宫颈疾病恶变早期事件.livin可能成为宫颈癌潜在的治疗分子靶向.
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HPV16 E6小干扰RNA对人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用
目的 探讨HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)对人宫颈癌移植瘤的抑制作用.方法 建立人宫颈癌CaSki细胞裸鼠皮下接种模型,将HPV16 E6 siRNA注入瘤体内(实验组),同时设对照组,动态观察并测定肿瘤的生长.采用原位末端标记(TUNEL)法检测肿瘤细胞凋亡情况;免疫组化法测定E6、p53蛋白的表达;检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)含量;光镜观察肝肾脏结构的改变.结果 HPV16 E6 siRNA处理后,肿瘤生长明显受到抑制,实验组肿瘤体积[(0.21±0.06)cm3]及瘤重[(0.13±0.04)g]均明显降低,与对照组差异有统计学意义(P＜0.05);实验组肿瘤细胞凋亡[(29.8±1.4)%]明显增加,E6和p53蛋白表达均下调;实验组和对照组血清ALT、AST含量无明显差异,实验组肝肾脏结构无明显异常.结论 HPV16 E6 siRNA能够抑制宫颈癌移植瘤生长,且对肝脏无毒副作用,可为宫颈癌的治疗提供一个新的特异性基因治疗方法.
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新疆维、汉族宫颈鳞癌病变中HPV16E6基因变异分析
目的 分析新疆地区维、汉族妇女宫颈鳞癌组织中HPV16型E6基因的变异情况.方法 从新疆地区5例维吾尔族妇女和5例汉族妇女宫颈活检组织中提取病毒基因组DNA,经反向膜杂交检测确定为HPV16单一感染.采用PCR技术扩增HPV16 E6基因片段,克隆到pUC18-T载体中进行DNA测序.结果 成功克隆了HPV16 E6基因,DNA测序结果表明,与德国标准株相比,10例宫颈鳞癌组织中共检出12种E6基因突变类型,包括107(T→C)、133(A.→C)、168(C→G)、178(T→G)、310(T→C)、321(T→C)、341(T→C)、350(T→G)、375(A→G)、410(T→A)、499(G→T)和548(A→G),其中178(T→G)和350(T→G)的突变频率较高,均为30％(3/10).汉族和维吾尔族标本中共有的突变包括178(T→G)和350(T→G),仅存在于汉族标本的突变为107(T→C)、133(A→C)、168(C→G)、310(T→C)和499(G→T),仅发生在维吾尔族标本的突变为321(T→C)、341( T→C)、375(A→G)、410(T→A)和548(A→G).结论 与德国标准株比较,新疆维吾尔族、汉族宫颈癌患者中HPV16 E6基因存在新的变异,其中178(T→G)和350(T→G)型基因变异为热点突变；新疆地区宫颈癌的高发可能与HPV16 E6基因突变有关.
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Daxx和HPV16 E6在宫颈病变中的表达及其意义
目的 探讨Daxx与人乳头瘤病毒(HPV) 16 E6在宫颈病变中的表达情况及其意义.方法 对2010年9月至2013年11月就诊于中国医科大学附属盛京医院妇产科门诊活检或手术切除宫颈组织标本[其中宫颈癌63例,宫颈上皮不典型增生(CIN)Ⅲ44例,Ⅰ～Ⅱ45例,正常宫颈标本42例],采用免疫组化SABC法,检测Daxx及HPV16 F6的表达情况.结果 (1)在慢性宫颈炎、CINⅠ～Ⅱ、CINⅢ和宫颈癌中Daxx的阳性表达率分别为28.57％(12/42),40.00％(18/45),65.91％(29/44),66.67％ (42/63),HPV16 E6为15.38％(6/39),36.17％(17/47),46.30％(25/54),100.00％(24/24);二者在宫颈高度病变组表达高于低级别组(P＜0.05).(2) HPV16 F6高表达组的Daxx表达率高于HPV16 E6低表达组(P＜0.05).(3) Daxx的表达与宫颈癌的病理分级、临床分期、淋巴结转移情况及患者年龄无关(P＞0.05).(4) Daxx与HPV16 E6的阳性表达呈正相关(r=0.695,P＜0.05).结论 Daxx和HPV16 E6随着宫颈病变级别的升高表达增加,两者可能存在某种协同作用,可能对宫颈病变发展起促进作用.
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RNA干扰HPV16 E6基因表达对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响
目的:探讨HPV16 E6小干扰RNA (siRNA)对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响.方法:利用化学合成的方法,合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染SiHa细胞.应用荧光定量RT-PCR和Western-blot检测HPV16 E6 mRNA及其蛋白水平的表达.MTT法绘制细胞生长曲线.流式细胞术评价HPV16 E6 siRNA对细胞周期的影响.结果:HPV16 E6 siRNA转染细胞48h及72h后,细胞内HPV16 E6 mRNA及蛋白表达量明显下调,与HPV16 E6阴性对照组及空白组比较[48h(1.85±0.15)vs (2.14±0.13),(2.29±0.11);72h (1.82±0.06)vs(2.32±0.14),(2.35±0.23)],差异有显著性意义(P＜0.01);MTT显示细胞生长明显受到抑制;流式细胞术检测显示,E6 siRNA可将细胞阻滞在G1期.结论:HPV16 E6 siRNA能抑制SiHa细胞增殖.
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HPV16 E6对HeLa细胞中Rap1 GAP蛋白水平下调的研究
目的 探讨HPV16 E6对细胞中Rap1GAP蛋白水平的影响,为阐明宫颈癌发生发展的分子机制提供实验依据.本研究组前期实验显示,宫颈癌石蜡切片组织中Rap1GAP蛋白水平下降,且与高危型HPV16/18感染相关.本文将进一步探讨HPV16 E6是否导致Rap1 GAP蛋白下调的原因.方法 通过将HPV16 E6基因插入pGEX-KG的BamHI和HindⅢ酶切位点构建GST标记的HPV E6质粒,采用脂质体转染法将其转染入HeLa细胞中,Western blot方法观察GST-tagged-HPV16 E6在HeLa细胞中的表达,并观察其对HeLa细胞中内源性Rap1GAP蛋白水平的影响.结果 测序表明成功构建GST标记的HPV16 E6质粒;Western blot检测表明HPV16 E6在HeLa细胞中成功表达;并且发现HeLa细胞中过表达HPV16 E6后,Rap1GAP蛋白相对含量(0.602±0.205)明显低于未转染组(1.130 ±0.163),差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 HPV16 E6下调Rap1GAP蛋白水平.
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HPV16 E6小干扰RNA与宫颈癌细胞中E6 p53 p21关系的研究
目的 探讨HPV16 E6小干扰RNA(siRNA)与宫颈癌CaSki细胞中E6、p53、p21之间的关系.方法 2004年9月至2005年3月于四川大学华西第二医院,应用化学合成针对HPV16 E6的siRNA借脂质体转染CaSki细胞,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术检测E6 siRNA转染前后细胞中HPV16E6、p53、p21 mRNA及其蛋白表达的变化.结果 转染24 h,E6 mRNA的表达显著低于空白组(P＜0.05).各时间点p53、p21 mRNA的表达差异无显著性意义(P＞0.05).转染48 h,E6蛋白表达明显下调,p53、p21蛋白表达相应升高.结论 HPV16 E6 siRNA能特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6 mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复p53蛋白的功能活性.RNA干扰(RNAi)技术可为HPV感染相关性疾病提供一种新的特异性基因治疗方法.
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启动子甲基化下调宫颈鳞癌组织miR-34a表达
目的:探讨宫颈鳞癌组织miR-34a下调的表达机制.方法:应用茎环RT Realtime-PCR方法检测48例宫颈鳞癌和20例正常宫颈组织中miR-34a的表达；通过甲基化特异PCR检测miR-34a启动子甲基化情况,分析5-Aza-dC去甲基化处理的Caski宫颈癌细胞miR-34a表达变化,观察miR-34a启动子甲基化对miR-34a失调表达的影响.结果:miR-34a在宫颈鳞癌组织中的表达明显低于正常宫颈组织,差异有统计学意义(P＜0.05).甲基化特异PCR检测显示,宫颈鳞癌组织miR-34a启动子区甲基化比率明显高于正常宫颈组织(P＜0.05).5-Aza-dC去甲基化处理人类乳头状瘤病毒(HPV) 16阳性的Caski细胞后,miR-34a表达明显升高(P＜ 0.05).结论:除HPV16 E6外,启动子甲基化也是抑癌基因miR-34a在宫颈鳞癌组织中异常表达的原因.
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GRIM-19与HPV16 E6的蛋白相互作用及位点的研究
目的 探讨GRIM-19与HPV16 E6的蛋白相互作用及其作用位点.方法 ①采用免疫共沉淀方法(CO-IP)检测GRIM-19与HPV16 E6蛋白的体内结合作用；②采用GST pull down方法检测GRIM-19与HPV16 E6蛋白的体外结合作用.结果 ①CO-IP方法结果显示在宫颈癌细胞株SiHa细胞中GRIM-19与HPV16 E6在体内具有蛋白结合作用；②GST pull down方法检测结果显示GRIM-19的N端第1～35位氨基酸是与HPV16 E6结合位点.结论 GRIM-19与HPV16 E6有蛋白结合作用,作用位点为第1～35位氨基酸残基.
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朗格汉斯细胞与宫颈癌及HPV16 E6的关系
目的:研究宫颈组织中朗格汉斯细胞(LC)的数量、形态及分布特点与宫颈癌及人乳头瘤病毒(HPV)16E6的关系.方法:用免疫组织化学技术(SP染色法)对标本的朗格汉斯细胞进行检测,以直接PCR法检测HPV16E6并对E6基因测序.结果:40例宫颈鳞癌,16例宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅱ/Ⅲ级与14例正常宫颈组织中,S-100蛋白阳性LC数量在正常组、CINⅡ/Ⅲ组、宫颈癌组中依次增加(P=0.000),与宫颈癌的临床分期呈负相关(R=-0.552,P=0.000),随宫颈癌组织分化程度降低而减少(P=0.039),与淋巴结转移无关(P=0.245).HPV16 E6在正常对照组、CINⅡ/Ⅲ组和浸润癌组中的阳性率依次上调(P=0.000).HPV16 E6(+)组中LC数量比HPV16E6(一)组少(P=0.011).LC的表达在HPV16 E6原型组和在HPV16 E6 D25E突变株组中无统计学差异(P=0.813).结论:LC功能缺陷与宫颈癌的发生有关.
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HPV16E6对ZEB1介导的宫颈癌细胞上皮间质转化的促进作用
目的:探讨宫颈癌细胞中HPV16 E6病毒蛋白对E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)及其介导的上皮间质转化(EMT)的影响.方法:构建HPV16 E6质粒并转染至宫颈癌细胞C33A(E6-C33A组),同时设置Control-C33A组;设计合成靶向E6特异性shRNA,使Siha细胞中E6低表达(shE6-Siha组),设置Control-Siha组.划痕实验比较各组细胞迁移情况;荧光定量PCR和Western Blot检测EMT相关指标(E-cadherin、vimentin)及ZEB1的表达;生物信息学方法预测HPV16 E6和ZEB1的三级结构及二者的相互作用,免疫共沉淀进行验证.结果:划痕实验显示E6-C33A组细胞迁移能力显著高于Control-C33A组;而shE6-Siha组细胞迁移能力显著低于Control-Siha组;与Control-C33A组相比,E6-C33A组中ZEB1、vimentin的表达量明显升高,E-cadherin表达则降低;与Control-Siha组相比,shE6-Siha组ZEB1、vimentin表达下降,E-cadherin表达升高.免疫共沉淀证明HPV16 E6与ZEB1存在相互作用.结论:HPV16 E6可促进ZEB1的表达,诱发宫颈癌细胞的EMT.
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pEGFP-HPV16 E6重组质粒的构建及其在Hela细胞中的表达定位
目的 构建以绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-HPV16 E6.方法 利用脂质体转染体外培养的Hela细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP～HPV16 E6融合蛋白在细胞中的分布和定位,用Western blot方法验证其蛋白的表达.结果 在空载体pEGFP-C2转染组中,Hela细胞内绿色荧光呈弥散分布;重组质粒pEGFP-HPV16 E6转染组中,绿色荧光集中在细胞核中.结论 pEGFP-HPV16 E6融合基因真核表达载体在真核细胞Hela中获得了表达,细胞所表达的融合蛋白具有HPV16 E6和EGFP的双重活性,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位,为HPV16 E6的功能研究提供了线索.
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宫颈癌和癌前病变中Aurora A表达及与HPV16感染的关系
目的 探讨宫颈病变组织中Aurora A表达及与HPV-16 E6感染的关系.方法 采用半定量RT-PCR方法检测204例宫颈组织中Aurora A及HPV-16 E6的表达.结果 ①HPV-16 E6的表达水平在CINⅡ、Ⅲ及宫颈鳞癌明显高于慢性宫颈炎和CIN Ⅰ(P＜0.05);②Aurora A的表达水平在CINⅡ、Ⅲ及宫颈鳞癌明显高于慢性宫颈炎和CIN Ⅰ,但在宫颈鳞癌与CINⅡ、Ⅲ中的表达差异无统计学意义(P＞0.05);③AuroraA mRNA在HPV16阳性组的表达明显高于阴性组(P＜0.05).结论 HPV-16 E6表达与宫颈病变的进展相关;Aurora A的表达与宫颈癌的发生、发展及与HPV-16感染密切相关.Aurora A有望成为宫颈癌早期诊断、治疗的生物学指标.
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RNA干涉抑制宫颈癌 CaSki细胞株 HPV16 E6基因的研究
背景与目的:研究表明宫颈癌的发生发展与人乳头瘤病毒 (human papilloma virus,HPV)E6、 E7癌基因密切相关,于是人们采用核酶或 HPV E6、 E7反义寡核苷酸抑制其表达来治疗宫颈癌,虽然取得了一定的效果,但仍面临基因抑制效率低、维持时间短、工作量大、耗费多等问题.本研究采用新的 RNA干扰技术干扰宫颈癌 CaSki细胞中 HPV16 E6转录,以了解其能否特异性抑制 HPV16 E6基因及其时效性如何.方法:设计合成针对 HPV16 E6的荧光标记 siRNA,借脂质体转染宫颈癌 CaSki细胞,通过荧光照片计数荧光细胞占所有细胞的比例计算转染效率;测定转染后不同时间点的细胞凋亡率; RT PCR 测定 HPV16 E6 mRNA变化, Western blot和流式细胞仪检测转染前后蛋白表达情况. 结果:相差显微镜荧光照片显示细胞转染的效率为 81%. HPV16 E6 siRNA转染细胞后 24 h、 48 h、 5天凋亡率分别为 7.7%、 11.8%和 37.4%,转染 9天时凋亡率下降至 12.6%. RT-PCR 扩增结果显示,细胞转染前HPV16 E6 mRNA 的量与 siRNA阴性对照比较没有显著性差异,但转染后 24 h、48 h、5天和 9天分别减少了 77%、83%、59%和 41%;而作为内对照的β-actin mRNA在转染前后无变化.流式细胞仪定量测定 HPV16 E6蛋白,结果显示转染后 24 h、 48h和 5天,蛋白表达抑制率分别为 79.7%、 80.4%和 71.3%; 9天时抑制率有下降,但仍可达 57.4%.此结果与 HPV16 E6 Western blot结果相吻合.以 Lamin A/C作为内对照,不同的时间点 Lamin A/C蛋白表达均无差异.结论:宫颈癌 CaSki细胞中确实有 RNA干扰现象存在,对外源性的 HPV16病毒 E6基因的干扰具有基因特异性和高效性.
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宫颈癌及其癌前病变组织中HPV16 E6蛋白的表达及意义
目的:探讨宫颈癌及其癌前病变组织中16型人乳头瘤病毒(HPV16)E6蛋白的表达及其意义.方法:用免疫组化SP法对15例正常宫颈组织、14例低级别宫颈上皮内瘤变(LCIN)、11例高级别宫颈上皮内瘤变(HCIN)以及61例浸润性宫颈癌标本进行了HPV16 E6蛋白表达的检测.结果:HPV16 E6蛋白在正常宫颈上皮、CINⅠ～Ⅱ、CINⅢ及浸润性宫颈鳞癌中的阳性表达率分别为0(0/15)、7.14%(1/14)、36.36%(4/11)、59.02%(36/61).高级别CIN和浸润性宫颈癌中HPV16 E6蛋白阳性率明显高于正常宫颈组织和低级别CIN(P<0.05),HPV16 E6蛋白表达与宫颈癌临床分期、组织分化和淋巴结转移无关(P>0.05).结论:HPV16 E6蛋白的检测可能可作为宫颈癌前病变转归的指标.
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RNA干涉宫颈癌HPV16 E6基因的体内实验研究
目的:采用RNA干涉技术干扰宫颈癌HPV16 E6基因转录,通过体内动物实验了解其抑制HPV16 E6基因的效率.方法:设计合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型,将E6 siRNA直接注入动物腹腔或瘤体,通过移植瘤体积、重量的变化,肿瘤切片HPV16 E6免疫组化,肿瘤细胞凋亡来了解RNA干涉的效果.结果:体内实验中无论腹腔还是瘤内注射HPV16 E6 siRNA,均明显抑制肿瘤的生长,HPV16 E6蛋白表达明显受抑,肿瘤细胞凋亡增加,重复给药较单次给药效果更好.结论:宫颈癌裸鼠移植瘤实验表明RNA干涉HPV16 E6基因的效果具有特异性和高效性.
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RNA干扰技术抑制HPV16 E6基因表达对宫颈癌细胞株CaSki增殖的影响
目的 观察HPV16 E6小干扰RNA(si RNA)能否抑制宫颈癌细胞生长,并探讨其作用机理.方法 化学合成针对 HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,应用细胞计数的方法测定细胞生长 曲线、活细胞率及细胞生长抑制率.运用实时荧光定量RT-PCR、流式细胞术检测转染后不同时间点细胞周期、HPV16 E6、p53、p21 mRNA及蛋白表达的变化.结果 转染HPV16 E6 siRNA后,细胞生长明显受到抑制.流式细胞术结果 显示并未将细胞 阻滞在G1期.实时荧光定量RT-PCR显示,转染24 h,E6 mRNA的表达比空白组降低了 20.11倍(P＜0.05),而p53、p21 mRNA的表达无明显变化.转染48 h,E6蛋白表达明显下调,Pp53、P21蛋白表达相应地升高.结论 HPV16 E6 siRNA 可通过特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6 mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复 P53蛋白的功能活性而发挥抑制宫颈癌细胞生长的作用.
