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角质细胞生长因子对老龄鼠胸腺细胞增殖作用的研究
目的 观察角质细胞牛长因子(KGF)通过恢复胸腺上皮细胞(TEC)数量促进老龄鼠胸腺细胞增殖的作用.方法 ①体内实验:BALB/C小鼠10只,随机分为KGF处理组和对照组,每组各5只,连续7 d分别给予皮下注射重组人KGF(5 mg·kg-1·d-1)和生理盐水,4周后枪测小鼠胸腺和脾组织的细胞总数,流式细胞仪分别检测胸腺组织中CD4单阳件(CD4SP)、CD8单阳性(CD8SP)、CD4CD8双阳性(DP)、CD4CD8双阴性(DN)以及脾组织中CD4SP、CD8SP各T细胞业群的比例:②体外实验:鼠胸腺上皮来源的1C6细胞,分别经含不同浓度(25、50、100、200、400、800 ng/m1)的重组人KGF和不含重组人KGF的完全培养液(对照组)作用24 h,采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖率.结果 细胞计数和流式细胞仪检测显示,与对照组相比,KGF处理组平均胸腺细胞总数和CD4SP、CD8SP、DP、DN各T细胞亚群的平均细胞数以及KGF处理组平均脾细胞总数和CD4SP、CD8SP各T细胞亚群的平均细胞数均有明显增加(均P<0.05).MTT法检测显示,在低浓度(<200 ng/ml)时,1C6细胞增殖率随KGF浓度的增加不断升高;当KGF浓度为200 ng/ml时,1C6细胞增殖率达到高值:而在高浓度(＞200 ng/ml)时,1C6细胞增殖率随KGF浓度的增加又逐渐下降;与对照组比较,浓度为100、200、400 ng/ml的重组人KGF对1C6细胞具有明显的促增殖作用(均P<0.05).结论 KGF可通过恢复老龄鼠TEC数量以及促进胸腺细胞生成和增加成熟T细胞向外周输出而增强机体的免疫力.
关键词： 成纤维细胞生长因子7 胸腺 T淋巴细胞 小鼠 近交BALB/C -
EV71不同接种途径对BALB/c小鼠的感染特点
目的 研究EV71 JN200804株对1日龄BALB/c小鼠的感染特点,建立EV71感染BALB/c小鼠的动物模型,为疫苗和抗病毒药物的研究提供可靠的动物评价工具.方法 EV71JN200804株分别采用口服、颅内注射、肌内注射和腹腔注射感染1日龄BALB/c小鼠,出现后肢麻痹后,做后肢电生理检测；安乐动物,采集脑、脊髓、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、小肠及后肢肌肉,进行动物体内的病毒分离和RT-PCR鉴定,同时对各器官组织进行组织病理学观察.结果 接种EV71后,颅内、肌内和腹腔注射组小鼠体重增长缓慢,4～5d出现后肢麻痹,7d左右死亡.RT-PCR和病毒分离表明颅内、肌内和腹腔注射组的肌肉分离到病毒,颅内注射组脊髓也分离到病毒,经RT-PCR鉴定为EV71感染.肌电图显示颅内、肌内和腹腔注射组的时限显著增加,波幅显著降低,判断小鼠后肢麻痹可能既有神经源性损害又有肌源性损害.组织病理学观察发现,颅内、肌内、腹腔注射组小脑浦肯野细胞及颗粒细胞减少,脊髓前角白质区神经纤维肿胀,后肢肌肉组织大片坏死溶解、炎性细胞浸润,肺组织明显充血,局部心肌细胞肿胀,部分肝组织内可见巨噬样细胞及淋巴样细胞浸润,部分肾皮质中肾小球萎缩、数目减少,而口服组无明显病理变化.结论 EV71 JN200804株通过颅内、肌内和腹腔注射三种途径均能感染并导致1日龄BALB/c小鼠后肢麻痹,此动物模型可用于EV71致病机制和特异性抗病毒药物的研究及疫苗的评价.
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抗CD49d单克隆抗体与rhG-CSF动员的外周血干细胞移植重建小鼠造血功能的比较研究
为比较研究抗CD49d单克隆抗体和重组人粒细胞集落刺激因子 (rhG-CSF)动员的外周血干细胞对造血功能重建的影响,经放、化疗预处理的BALB/c小鼠分别接受经生理盐水(对照组)、rhG-CSF(实验1组)、抗CD49d单克隆抗体(实验2组)动员的同系小鼠的外周血干细胞移植,观察受体小鼠的4周存活率、外周血白细胞(WBC)、骨髓有核细胞(BMNC)、粒细胞巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)及脾集落形成单位(CFU-S)等指标.结果显示,实验1、2组小鼠的4周存活率、WBC、BMNC,CFU-GM和CFU-S均明显高于对照组(P<0.01),实验1、2组之间比较差异无显著性意义(P＞0.05).提示抗CD49d单克隆抗体或rhG-CSF均能动员小鼠外周血干细胞,并能重建同系小鼠的造血功能.
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BALB/c系裸小鼠脏器重量、脏器系数的测定
目的测定SPF级BALB/c裸小鼠脏器重量、脏器系数的生物学特性指标.方法选用成年SPF级BALB/c裸小鼠38只,雌雄各半,分别测定体重和12个脏器重量,计算脏器系数.结果雌雄裸小鼠肾、脑重量差异有显著性(P＜0.01),体重、心、肝、肾上腺重量差异有显著性(P＜0.05),脑系数、肾上腺系数差异有显著性(P＜ 0.01).肾系数差异显著(P＜0.05).雄性裸小鼠体重与心、肝、肾、脑、肾上腺、睾丸有线性关系.雌性裸小鼠体重与肝、肾、胃有线性关系.结论BALB/c雌雄裸小鼠的体重、心重量、肝重量、肾重量、脑重量、肾上腺重量、肾系数、脑系数、肾上腺系数具有差异,其体重与某些脏器存在一定的线性关系.
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BALB/c裸小鼠心、肝、肺脏8种矿物质元素含量的研究
目的对SPF级BALB/c裸小鼠心、肝、肺脏矿物质元素含量的研究.方法采用电感偶合等离子体发射光谱法(ICP-AES)测定BALB/c裸小鼠纯合子(nu/nu)的心、肝、肺等脏器矿物质元素Zn、Cu、Fe、Ca、Mg、Mn、P、S的含量.结果BALB/c裸小鼠心、肝、肺脏器矿物质元素Zn、Mg、Mn、P、S含量雌、雄之间比较差异具有显著性,心、肝、肺等脏器矿物质元素Zn、Cu、Ca、Mg、Mn、P、S含量比较差异具有显著性,BALB/c雌、雄裸小鼠心、肝、肺等脏器矿物质元素含量排列顺序一致.结论矿物质元素在BALB/c裸小鼠心、肝、肺脏的分布呈现出一定的规律,性别对裸小鼠心、肝、肺脏的某些元素含量存在一定的影响.
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肿瘤坏死因子受体2在喉鳞癌裸鼠模型中的表达及意义
目的:利用脂质体转染肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)于喉鳞癌裸鼠模型中,探讨转染的佳剂量及时间.方法:构建喉鳞癌裸鼠模型,将不同剂量TNFR2于不同时间转染至模型中,利用流式细胞术及免疫组织化学法测定TNFR2的表达.结果:鳞状细胞癌荷瘤裸鼠的瘤组织基本不表达TNFR2.转染TNFR2后,48 h蛋白表达达高峰,主要为细胞膜表达.给瘤体内转染5 μg TNFR2效果佳,蛋白表达水平高.结论:TNFR2的佳转染剂量为5 μg,48 h可达高峰.此结果为喉鳞癌的基因治疗提供了依据.
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外标准法实时定量反转录-聚合酶链反应方法的建立
目的为了检测BALB/C小鼠甲状腺促甲状腺激素受体(TSHR)表达,建立外标准法实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法.方法取正常BALB/C小鼠甲状腺提取甲状腺总RNA,逆转录后进行PCR,PCR产物经回收纯化后作为real-time PCR的标准品,制作标准曲线,优化反应条件使溶解曲线有特异扩增.检测豚鼠TSHR分子免疫的BALB/C小鼠甲状腺TSHR mRNA的表达.结果建立的外标准法SYBR GREENⅠ实时定量RT-PCR方法可以灵敏检测到10 copies的核酸,灵敏度为普通PCR的104倍;溶解曲线只有特异峰;不同标准点批间变异系数范围为5.8%～14.3%(n=6).与对照组比较,TSHR大分子免疫的BALB/C小鼠甲状腺组织TSHR mRNA水平显著升高(P＜0.05).结论外标准法实时定量RT-PCR具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点,可精确地检测出小鼠甲状腺组织TSHR mRNA的水平.
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钥孔戚血蓝蛋白诱导Balb/C小鼠脾细胞Th1/Th2失衡
背景:建立具有一定特征的、稳定的、可重复性强的Th1/Th2失衡动物模型是研究Th1/Th2失衡机制的重要基础.目的:分析钥孔戚血蓝蛋白诱导Balb/C小鼠脾细胞Th1/Th2失衡的特点.设计:随机对照探索性实验.单位:河北医科大学基础医学院河北省法医学实验室.材料:实验于2005-09/2007-02在河北医科大学基础医学院河北省法医学实验室完成.实验选用Balb/c小鼠,对动物处置方法符合动物伦理学要求.方法:①以钥孔戚血蓝蛋白+完全弗氏佐剂免疫Balb/C小鼠,分离脾细胞,细胞因子分泌高峰点测定实验分为3组,分别为钥孔戚血蓝蛋白6.25,12.5,25 mg/kg组:不同免疫剂量和免疫次数实验分为7组.分别为钥孔戚血蓝蛋白6.25,12.5,25 me/kg组,6.25,12.5,25 mg/kg二次免疫组及对照组.主要观察指标:以酶联免疫吸附法检测小鼠脾细胞培养上清中Th1型细胞因子γ-干扰素、白细胞介素2、白细胞介素12 p40及Th2型细胞因子白细胞介素4、白细胞介素5的分泌量及血清中Th1型抗体IgG2a和Th2型抗体IgG1水平.结果:①钥孔戚血蓝蛋白免疫使小鼠出现脾肿大,脾细胞计数增高.②体外同种抗原再刺激使免疫小鼠脾细胞培养上清中4种细胞因子浓度增高,其中白细胞介素2分泌量于24h即明显增高,48 h达高峰:白细胞介素4、γ-干扰素和白细胞介素5在24 h轻度增高,以后逐渐上升,96 h达高峰.各时间点培养上清中白细胞介素12p40含量均较低,与对照组无明显差异.③不同剂量单次或二次免疫均可致4种细胞因子不同程度增高,白细胞介素4/γ-干扰素比值增高,其中12.5 mg/kg钥孔戚血蓝蛋白二次免疫组细胞因子分泌量明显高于其他各组(P＜0.01).④钥孔戚血蓝蛋白免疫小鼠血清IgG1,IgG2a水平发生不同程度增高,其中IgG1增高更为明显.结论:钥孔戚血蓝蛋白加完全弗氏佐剂可诱导Balb/C小鼠脾细胞发生Th2型优势反应.
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持续高剂量电磁辐射对小鼠外周血免疫细胞数量影响的长期效应
目的:观察慢性持续高剂量电磁辐射照射后小鼠外周血免疫细胞数量及比例变化,探讨慢性持续高剂量电磁辐射对小鼠免疫系统的影响.方法:采用随机、平行对照分组法,将30只雄性Balb/c小鼠平均分为正常对照组、10 mW·cm-2辐照组及环磷酰胺给药组,每组10只.辐照组动物予以30 min·d-1、每周辐照5d,持续4周；给药组在辐照组开始辐照时给药,每次每只30 mg·kg-1,共7次；各组小鼠于辐照结束后30、45、60、75、90、105和120 d分别采集尾静脉血,应用流式细胞术检测外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+比率、CD49+ NK细胞数量及比例的变化.结果:经持续高剂量电磁辐射后,小鼠的外周血白细胞数量显著上升,CD4+T细胞数量于辐照后75 d开始明显升高,辐照后90 d开始下降但仍高于正常组(P＜0.05),观察周期结束时,CD4+T细胞数量下降到与正常组相同(120 d); CD8+T细胞数量于辐照后75 d明显降低,直到观察周期结束时(120 d),T细胞的数量恢复至与正常组的T细胞数量相同；CD4+/CD8+比率在持续高剂量电磁辐射诱导下呈上升趋势,并且明显高于正常对照组(P＜0.05); CD49+NK细胞数量在辐射后明显低于正常对照组(P＜0.05).结论:慢性、持续性大剂量电磁辐射可导致小鼠免疫系统的紊乱,通过检测外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+T细胞、CD49+ NK细胞数量及比例的变化,可了解辐照后机体的免疫状态.
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柯萨奇B3病毒川金丝猴分离毒株实验性感染BALB/c小鼠的病理形态学
目的:研究来源于川金丝猴的柯萨奇B3病毒株CVB/SGM-05对BALB/c小鼠的致病变特点.方法:4～6周龄健康雄性BALB/c小鼠30只,通过腹腔注射途径将滴度为105个TCID50/0.1 mL的CVB/SGM-05接种小鼠(0.2 mL/只),观察感染小鼠的临床症状及大体病变特点;分别摘取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、胃、肠、脑和脂肪组织,经10%的中性甲醛溶液固定后制作常规的病理石蜡切片,光镜下观察其病理变化特点.结果:小鼠于接毒后60 h开始死亡,死亡率达80%;发病小鼠均出现典型的结膜炎.对死亡小鼠剖检可见,肝脏明显肿大,呈淡黄色样改变,表面可见针尖大灰白小点;部分小鼠的脾脏肿大、边缘与坏死的脂肪发生粘连;明显的病变为腹腔内脂肪的大量坏死.病理切片观察可见心、肝、肾组织均有不同程度的细胞变性,心肌纤维间有炎性细胞浸润,肝细胞坏死严重;胃、肠黏膜上皮坏死、脱落;脑组织可见轻度淤血;脂肪坏死尤其明显.结论:与人源的标准毒株Nancy比较,猴源的CVB/SGM-05感染BALB/c小鼠可引起多脏器损伤,提示不同来源的CVB3毒株可能对感染动物的致病性有一定差异.
关键词： CVB/SGM-05 小鼠 近交BALB/C 实验感染 病理变化 -
人脐带间充质干细胞对急性肝功能衰竭小鼠肝组织微小核糖核酸-155和肿瘤坏死因子表达的影响
目的 探讨间充质干细胞(MSC)对急性肝功能衰竭(ALF)小鼠肝组织中miRNA-155和TNF表达的影响,以及与MSC疗效间的关系.方法 采用随机数字表法和随机数余数分组法将BALB/c清洁级小鼠96只分为4组,即健康对照组、急性肝功能衰竭组、MSC治疗组和MSC预防组各24只.ALF组予以D-GalN 900 mg/kg+脂多糖10 μg/kg腹腔注射建立模型;MSC治疗组在900 mg/kg D-GalN+ 10 μg/kg脂多糖腹腔注射后2h,予以尾静脉注射MSC 1×106;MSC预防组在900mg/kgD-GalN+10 μg/kg脂多糖腹腔注射前予以尾静脉注射MSC 1×106;健康对照组予以0.9％氯化钠溶液1 mL腹腔注射.给药7h后每组处死小鼠12只,检测小鼠血清肝功能,ELISA法检测TNF水平,实时定量PCR检测肝组织miRNA-155、TNF mRNA.余下每组12只小鼠观察24 h生存率.组间均数比较用单因素方差分析,相关性分析采用Pearson和Spearman相关分析.结果 D GalN/脂多糖诱导7h后,MSC预防和MSC治疗组小鼠ALT水平均较ALF组降低,差异均有统计学意义(q值分别为13.20和4.58,均P＜0.01);MSC预防组和MSC治疗组AST水平均较ALF组降低,差异均有统计学意义(q值分别为18.90和9.83,均P＜0.01).与ALF组相比,MSC预防组和MSC治疗组血清TNF水平均有所降低,差异均有统计学意义(q值分别为14.70和3.95,均P＜0.01).健康对照组、ALF组、MSC治疗组和MSC预防组小鼠肝组织TNF mRNA表达水平分别为1.0±0.3、19.2±2.2、6.6±1.7和4.3±0.9,组间比较差异有统计学意义(F=72.24,P＜0.01).与ALF组相比,MSC预防组和MSC治疗组小鼠肝组织TNF mRNA表达水平均有下调,差异均有统计学意义(q值分别为31.40和21.72,均P＜0.01).与ALF组相比,MSC预防组和MSC治疗组小鼠肝组织miRNA-155水平均有下调,差异均有统计学意义(q值分别为19.40和9.58,均P＜0.01).ALF组小鼠肝组织miRNA 155上调和TNFmRNA诱导呈正相关(r＝0.734,P=0.007).MSC预防组和MSC治疗组miRNA-155和TNF mRNA的部分逆转亦呈正相关(r值分别为0.687和0.590,P值分别为0.014和0.044).给药后24 h,健康对照组、ALF组、MSC治疗组和MSC预防组各死亡0/12、10/12、6/12和3/12只,组间比较差异有统计学意义(x2＝19.078,P＜0.01).结论 在MSC干预小鼠ALF发病过程中,可以部分逆转上调的肝组织miRNA-155和TNF,且存在协同性,提示MSC治疗ALF可能通过对肝组织miRNA-155和TNF的调控发生作用.
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D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导急性肝功能衰竭小鼠血清微小核糖核酸的表达
目的 探讨D氨基半乳糖联合脂多糖诱导急性肝功能衰竭小鼠血清微小核糖核酸(miRNA)的表达变化以及与肝组织miRNA的相关性.方法 Balb/C清洁级小鼠40只分为两组,模型组32只,对照组8只.模型组应用D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导Balb/C小鼠急性肝功能衰竭,对照组腹腔注射0.9％氯化钠溶液1 mL.模型组给药后0、3、5和7h分别处死小鼠各8只,采集血清及肝组织,观察小鼠给药后肝功能生物化学指标及肝组织病理学变化.抽提血清及肝组织miRNA,取0、5和7h肝组织进行锁核酸(LNA)-miRNA微阵列分析,并用实时定量反转录PCR检测miRNA.组间均数比较用单因素方差分析,相关性分析采用Pearson和Spearman相关分析.结果 随着小鼠急性肝功能衰竭的发生,肝组织miRNA的表达发生显著变化,共有21个miRNA明显上调,27个miRNA明显下调,其中miRNA-122和miRNA-1187表达下调,miRNA-146a、miRNA-155表达上调.经PCR验证发现小鼠肝组织miRNA 122和miRNA-1187表达逐渐下调,血清miRNA-122和miRNA-1187的表达则逐渐上调；炎性相关的miRNA 146a和miRNA-155在肝组织和血清中表达均明显增加.小鼠miRNA-122和miRNA-1187在组织与血清中的表达呈负相关(r值分别=-0.477和-0.420,P值分别=0.0089和0.0231),而miRNA-155在组织与血清中表达呈正相关(r=0.678,P=0.0001).小鼠血清miRNA 122(r值分别=0.571和0.554)、miRNA-1187(r值分别=0.471和0.542)的相对表达量与ALT和AST水平均呈正相关(均P＜0.05).血清miRNA 122和miRNA-1187在给药5h上升显著,早于血清转氨酶的变化.结论急性肝功能衰竭小鼠肝组织和血清miRNA-122和miRNA-1187的表达呈负相关,血清中miRNA-122、miRNA-1187的变化早于血清转氨酶的变化,有可能成为早期预测肝损伤的血清标志物.
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低分子肝素对新生鼠肝细胞先天性感染人巨细胞病毒的影响
目的 研究低分子肝素( LMWH)对新生鼠肝细胞先天性感染人巨细胞病毒(HCMV)病毒学和病理学的影响.方法 取健康纯系清洁级BALB/c鼠60只,10周龄,雌雄各半,均分为5组,每组6对.LMWH干预组和阳性对照组腹腔接种6.0 lg半数组织培养感染剂量(TCID50)的HCMV AD169,空白对照组腹腔注射高糖改良Eagles培养液0.5 mL/只,然后交配.LMWH干预Ⅰ组的雌鼠在孕期给予皮下注射LMWH 1000 U/kg×10 d;LMWH干预Ⅱ组的雌鼠在孕期给予皮下注射LMWH 1000 U/kg×5d,待生产后再给新生鼠皮下注射LMWH 1000 U/kg×5 d;LMWH干预Ⅲ组在生产后予新生鼠皮下注射LMWH 1000 U/kg×10d.产后10 d处死新生鼠,取肝脏,进行病毒分离、干湿质量测定、病理学检查和荧光定量PCR检测.多组间比较采用方差分析.结果 阳性对照组新生鼠肝组织悬液中10d可分离到HCMV,而LMWH干预的3组新生鼠需24 d分离到HCMV.阳性对照组新生鼠肝组织有浊肿、空泡变性,核内有嗜碱性包涵体,部分肝细胞坏死,而LMWH干预组肝组织仅有轻度肝细胞浊肿变性,炎性反应轻微,类似空白对照组.LMWH干预组肝组织含水量较阳性对照组明显降低.LMWH干预的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组50 mg肝组织HCMV DNA载量对数值分别为(3.26±0.43)、(3.26±0.41)和(3.32±0.51) lg拷贝,较阳性对照组的(7.38±0.53) 1g拷贝显著降低(F=314.620,P＜0.01),但LMWH干预组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 LMWH在宫内和出生后干预能显著减少肝细胞HCMV复制,减轻肝组织炎性反应.
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地塞米松在D-氨基半乳糖联合内毒素诱导小鼠急性肝功能衰竭
目的 探讨地塞米松冲击疗法对D氨基半乳糖(D-Gal)联合内毒素(LPS)所致急性肝功能衰竭模型促炎与抗炎因子的影响,为深入阐明糖皮质激素在重型肝炎中的作用机制提供实验依据.方法 雄性BALB/c小鼠随机分为健康对照组6只、肝功能衰竭模型组24只和地塞米松治疗组24只,采用LPS 10μg/kg和D-Gal 900 mg/kg联合腹腔注射制备肝功能衰竭模型,治疗组同时注射地塞米松10 mg/kg.健康对照组8 h,肝功能衰竭模型组和地塞米松治疗组2、4、6、8 h各6只小鼠心脏采血检测血清ALT、AST;肝组织经苏木精-伊红染色并应用病理学双盲评价行改良Knodell评分;不连续密度梯度法分离肝库普弗细胞(KCs)并鉴定,ELISA法检测KCs上清液IL-10TNF-α和核因子(NF)-κB变化,半定量RT-PCR检测肝组织TNF-α、IL-10 mRNA表达.结果 地塞米松治疗组与肝功能衰竭模型组组织学改良Knodell评分在6、8 h分别为7.500±1.871、10.830±1.472和10.500±1.049、15.670±1.633,差异有统计学意义(P＜0.05);血清ALT、AST、肝KCs上清液TNF-α水平随损伤时间延长均逐渐升高,但治疗组较肝功能衰竭模型组低,差异有统计学意义(P＜0.01),肝组织TNF-α mRNA亦随损伤时间增加而升高,治疗组与肝功能衰竭模型组在6、8 h比较,差异有统计学意义(P＜0.05);肝KCs上清液及肝组织IL-10随损伤时间增加而升高,治疗组较肝功能衰竭模型组升高显著,在6、8 h明显(P＜0.05);肝KCs上清液NF-κB活性在2 h即升高,4 h达高峰,4～6 h为一高峰平台,8 h与正常无差异,两组2、4、6 h各时点之间差异有统计学意义(P＜0.01).结论肝功能衰竭早期应用地塞米松冲击疗法对肝脏有保护作用,其机制可能为通过抑制肝脏KCs NF-κB表达,下调肝脏原位及循环中TNF-α水平,调节促炎与抗炎因子之间的平衡而起作用.
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雌激素受体在不同周龄的雌性BALB/c小鼠胸腺中的表达
了解雌激素受体(ER)在不同周龄雌性BALB/c小鼠胸腺中的表达.结果显示从出生后1周至8周,ER在胸腺中的表达量逐渐增加.ER阳性细胞为胸腺上皮细胞和胸腺细胞.ER既存在于胞质,也存在于胞核.
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在雌性小鼠制备Graves病动物模型
目的 用表达TSH受体A亚单位(TSHR289)的重组腺病毒免疫近交系BALB/c雌性小鼠制备人类Graves病动物模型.方法 AdMax法构建重组腺病毒(Ad-TSHR289).将6～8周雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组.取已构建好的Ad-TSHR289、对照腺病毒(Ad-null)分别直接经胫前肌注射小鼠,每3周免疫1次,共3次,第3次免疫后8周采血,检测血清TSH受体抗体(TRAb)、TT4、TSH,剥离甲状腺,行石蜡包埋,切片,组织学检查.结果 实验组中50%的小鼠TRAb水平显著升高,21.4%血清TT4水平明显升高,TT4升高的小鼠有不同程度的体重减轻,甲状腺组织病理切片显示:28.6%的小鼠甲状腺显著增生并有乳头状结构形成,但无淋巴细胞浸润.结论 利用表达TSHR289的重组腺病毒免疫近交系BALB/c小鼠,成功地制备了Graves病动物模型,为Graves病的进一步研究提供了良好的工具.
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双调蛋白过表达促进小鼠肠癌CT26细胞的体内生长
目的:探讨上皮细胞生长因子双调蛋白(amphiregulin,AREG)对小鼠肠癌CT26细胞生长的影响及其相关机制.方法:采用ELISA法检测不同小鼠肿瘤细胞中AREG蛋白的表达水平.将携带AREG基因的重组慢病毒载体转染至小鼠肠癌CT26细胞、黑素瘤B16细胞和肝癌LPC-Akt细胞,同时以转染空载体细胞作为阴性对照.采用MTT法、克隆形成实验和FCM法分别检测AREG过表达后细胞的体外增殖和克隆形成能力以及细胞周期进程.构建AREG过表达CT26细胞的小鼠移植瘤模型,观察小鼠体内移植瘤的生长情况,并且采用FCM法和实时荧光定量PCR法分别检测移植瘤组织中免疫细胞的分布情况以及趋化因子的表达水平.结果:小鼠肠癌CT26、黑素瘤B16和肝癌LPC-Akt细胞中AREG相对低表达.过表达AREG后,上述3种肿瘤细胞的体外增殖能力、克隆形成能力及细胞周期进程均无明显变化(P值均＞ 0.05).然而,在CT26细胞的小鼠移植瘤模型中,AREG过表达可明显促进肿瘤细胞的体内生长(P＜0.01),下调肿瘤组织中CD8+T细胞所占比例(P＜0.05),并降低与CD8+T细胞招募相关的CC趋化因子配体5(CC chemokine ligand 5,CCL5)的转录水平(P＜0.05).结论:AREG能够促进小鼠肠癌CT26细胞的体内生长,推测其作用机制可能与调控CD8+T细胞招募相关趋化因子,从而影响肿瘤微环境有关.
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微RNA-21表达下调可抑制人结肠癌SW620细胞在裸鼠体内的生长
目的:探讨反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASOs)下调微RNA-21(microRNA-21,miR-21)表达对高侵袭性人结肠癌SW620细胞在裸鼠体内生长的影响.方法:首先建立人结肠癌SW620细胞的裸鼠荷瘤模型,并于肿瘤局部分别注射p-miR-21-ASOs重组质粒或p-Cont对照质粒,然后观察裸鼠体内肿瘤的生长变化.末次注射5d后,处死裸鼠,剥取肿瘤组织,测量各组肿瘤组织的大小和质量.采用HE染色法观察肿瘤组织形态学变化;TUNEL法检测肿瘤局部细胞凋亡情况;免疫组织荧光法检测肿瘤组织中增殖核抗原Ki-67蛋白的表达变化;实时荧光定量PCR法检测肿瘤组织中miR-21成熟体的表达,以及细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)2、CDK3、CDK4和CDK6的表达变化;蛋白质印迹法检测磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-PKB,又称为p-Akt)和磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinase,p-ERK)的表达水平.结果:与p-Cont对照组相比,p-miR-21-ASOs质粒转染组的肿瘤生长缓慢(P＜0.05),剥离肿瘤的质量明显减少(P＜0.01),肿瘤组织中可见大片坏死区域,而且肿瘤细胞中miR-21成熟体的表达水平明显下调(P＜0.01).miR-21表达下调后,肿瘤组织中Ki-67的表达量明显减少(P＜0.01),而相对凋亡细胞数明显增多(P＜0.05);并且,细胞周期相关分子CDK2、CDK3、CDK4和CDK6的表达均明显下调(P值均＜0.001),Akt和ERK蛋白的磷酸化水平也均明显下调(P值均＜0.05).结论:ASOs下调miR-21表达可显著抑制人高侵袭性结肠癌细胞在裸鼠体内的生长,提示miR-21可作为结肠癌基因治疗的一个潜在新靶标.
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睡美人转座子介导AEG1基因修饰的树突状细胞可治疗小鼠肝癌
目的:探讨睡美人(Sleeping Bbeauty,SB)转座子系统转染树突状细胞(dendritic cells,DCs)的效率,以及星形胶质细胞上调基因1(astrocyte elevated gene 1,AEG1)重组转座子系统转染DCs对小鼠肝癌的抑制作用.方法:从pEGFP-N1质粒中获取巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因,从小鼠肝癌细胞H22中克隆AEG1基因,将上述基因分别插入质粒pT/HB后获得重组转座子载体pT-CMV-EGFP和pT-CMV-AEG1.将重组转座子载体分别与转座酶pCMV-SB11按一定比例混合后获得双质粒转座子系统pT-CMV-EGFP/SB11和pT-CMV-AEG1/SB11.将pT-CMV-EGFP/SB11转染DCs,荧光显微镜和FCM法观察EGFP表达率;将pT-CMV-AEG1/SB11转染DCs后,RT-PCR和蛋白质印迹法分别检测AEG1 mRNA和蛋白的表达.用pT-CMV-AEG1/SB 11转染后的DCs治疗肝癌H22细胞荷瘤小鼠,观察小鼠体内肿瘤体积的变化,并采用乳酸脱氢酶释放法检测治疗19d后小鼠脾细胞对肝癌H22细胞的杀伤活性.结果:经质粒酶切和基因测序证实,重组转座子载体pT-CMV-EGFP和pT-CMV-AEG1均构建成功.pT-CMV-EGFP/SB11转染DCs后24和48 h,细胞内EGFP的表达率分别为46.5％和27.8％,均明显高于空载体pT-CMV/SB11转染组(P值均＜0.001).pT-CMV-AEG1/SB11转染DCs后24 h,细胞内AEG1 mRNA和蛋白表达水平均高于空载体pT-CMV/SB11转染组(P值均＜ 0.001).用pT-CMV-AEG1/SB11转染的DCs治疗H22荷瘤小鼠后,小鼠体内肿瘤生长被明显抑制(P＜0.01),小鼠脾细胞对肝癌H22细胞的杀伤活性明显增强(P＜0.01).结论:SB转座子系统可高效转染DCs.pT-CMV-AEG1/SB11转染的DCs可通过诱导特异性细胞免疫,抑制H22细胞荷瘤小鼠的肿瘤生长.
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bcr-abl反转录病毒介导的慢性粒细胞白血病样小鼠二次移植模型的建立
目的:构建bcr-abl反转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)样二次移植模型,为深入研究CML的发病和治疗机制奠定可靠的基础.方法:收集已成功建模的由bcr-abl反转录病毒介导的CML样模型小鼠的骨髓细胞或脾细胞,经尾静脉输注入经亚致死剂量γ射线(450 cGy)照射的同种雌性受体鼠,进行造血组织的形态学观察、Y染色体及其特异性性别决定基因Sry的检测以及bcr-abl mRNA和蛋白水平表达的检测,分析鉴定CML样小鼠二次移植模型情况.结果:移植后12 d,肉眼可见明显的脾结节形成,连续切片可见成堆脾集落.移植4～5周后,在雌性受体小鼠骨髓中检出相似Y染色体及Y染色体特异性Sry基因,骨髓和脾脏中检出bcr-abl融合基因.移植10～12周后外周血白细胞水平升高至正常未处理小鼠的4～8倍,粒系细胞水平明显升高至(20～32)×109个/L,外周血涂片幼稚细胞占10%～20%;骨髓涂片结果显示粒系细胞显著增多,易见幼稚细胞,肝脾也可见白血病细胞浸润;同时,在肝脏中检测出bcr-abl融合基因,骨髓中检测出bcr-abl融合蛋白的表达.移植18周后,外周血涂片幼稚细胞占30%以上,小鼠发生急性变,终因肺出血相继死亡.结论:本研究成功建立了bcr-abl反转录病毒介导的小鼠CML样二次移植模型,该模型可用于后续CML信号通路和治疗机制的研究.
